Methodenartikel

Een pipet-Tip gebaseerde methode voor Seeding cellen Droplet Microfluidic Platforms

12.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57848

⸱

11 februari 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een protocol voor het zaaien van schaarse bevolking van cellen gebruikt pipet-tips om druppel microfluidic apparaten ten behoeve van hogere efficiëntie van de inkapseling van cellen in druppeltjes.

Samenvatting

Onder diverse microfluidic platform ontwerpen vaak gebruikt voor cellulaire analyse, biedt druppel-microfluidics een robuust hulpmiddel bij het opsporen en analyseren van cellen op de eencellige niveau door het elimineren van de invloed van externe factoren op de mobiele communicatie. Inkapseling van cellen in druppels is ingegeven door de Poisson-verdeling als een functie van het aantal cellen aanwezig zijn in elke druppel en het gemiddeld aantal cellen per volume van druppel. Primaire cellen, met name immune cellen of klinische monsters kan worden schaars en verlies-loze inkapseling van cellen blijft uitdagend. In deze paper presenteren we een nieuwe methodologie die gebruikmaakt van de pipet-tips om te laden cellen naar microfluidic druppel gebaseerde apparaten zonder significant verlies van cellen. Met verschillende celtypes tonen we efficiënte cel inkapseling in druppeltjes die nauw overeenkomt met de efficiëntie van de inkapseling voorspeld door de Poisson-verdeling. Onze methode kan zorgt voor verlies-minder laden van cellen naar microfluidic platforms en gemakkelijk aangepast voor downstream eencellige analyse, bijvoorbeeld om te decoderen van de cellulaire interacties tussen de verschillende soorten cellen.

Inleiding

In de afgelopen jaren heeft het gebruik van microfluidics als een robuust en veelzijdig platform voor cellulaire analyses op het niveau van eencellige snel toegenomen1. Deze platforms bieden high-throughput screening van afzonderlijke cellen en biologische moleculen met hoge precisie en gevoeligheid met behulp van zeer kleine steekproef volume2,3,4. Onder verschillende soorten microfluidic ontwerpen, druppel-gebaseerde platforms in staat stellen hoge gegevensdoorvoer analyse van enige cellen door hen te isoleren in een druppel van de waterfase omgeven door een onmengbare fase waarmee exacte en nauwkeurige controle over de mobiele communicatie5,6. Druppel gebaseerde microfluidics geeft de flexibiliteit om te isoleren van één of meerdere-cellen in, beide, waterige en hydrogel druppels en waardevol is in het sonderen van complexe cellulaire gedrag, zoals eiwit secretie of cellulaire interacties7, 8 , 9. signalering en cross-talk onder immune cellen kunnen worden beïnvloed door interacties met andere cellen in de communicatie-10. Isolatie van afzonderlijke cellen in druppeltjes biedt een effectieve ruisvrije analytisch laboratorium, vrij van de invloed van externe milieufactoren voor meer efficiënte en nauwkeurige resultaten11,12. Het ontwerp van een droplet-microfluidic-platform met meerdere inhammen wijzigen kan de inkapseling van meerdere celtypen te bestuderen van cellulaire interacties via cel-paren12,13.

Het proces voor de inkapseling van cellen in druppels is willekeurig en het tarief voor de inkapseling van cellen statistisch kan worden bepaald met behulp van de formule voor de Poisson-verdeling14,15. Dit tarief van inkapseling kan worden geschat door te overwegen de gemiddelde koers van de aankomst van cellen op het kruispunt van de druppel en ervan uitgaande dat de komst van elke cel onafhankelijk van de komst van andere is cellen16. Hoewel onafhankelijke cel aankomst kan niet worden gegarandeerd, in het geval van de dunbevolkte gedistribueerde cellen, de veronderstelling van onafhankelijkheid kan worden beschouwd en de waarschijnlijkheid van een droplet met een of meer cellen voorspeld kan worden als een functie van het aantal cellen aanwezig in elke druppel en het gemiddeld aantal cellen per druppel16,17. Aangezien deze schatting van cellulaire inkapseling in druppels afhankelijk van het aantal cellen aanwezig zijn in elke druppel is, kan men suggereren dat de verhoging van de concentratie van de cellen bij de inlaat van het gemiddelde aantal cellen aanwezig zijn in elke druppel zal toenemen 16. dus, om ervoor te zorgen de eencellige inkapseling, de concentraties van de cel moeten worden verminderd maar dit vaak leidt tot een groot aantal lege druppels18.

Verlies van cellen tijdens het laden door bijlage, sedimentatie, en/of samendoen in de spuit, slang, of productie-apparaat is een gemeenschappelijk nadeel verantwoordelijk voor de afwijking van de inkapseling van de werkelijke waarden van de inkapseling van de voorspelde waarden19 . Dit probleem krijgt verder overdreven wanneer zaaien van zeldzame immune cellen of klinische monsters, aangezien zij reeds schaarse in de bevolking en de inkapseling van slechts een paar cellen, veel lager dan verwacht, niet in voldoende gegevens experimentele analyse voorziet. Plasmacytoid dendritische cellen (PDC's) zijn een zeldzame deelverzameling van immune cellen die alleen vormt ongeveer 0,2 - 0,6 procent van de hele witte bloed cel bevolking20. Deze cellen afscheiden enorme hoeveelheden type I interferon na activatie en daarmee spelen een cruciale rol in de immuunrespons op21. Bij de studie van de cellulaire gedrag van dergelijke zeldzame cellen in druppels, is het noodzakelijk om te voorkomen dat cel verlies tijdens cel zaaien en inkapseling22. Er zijn verscheidene ontwerpen van daarmee verband houdende ontwikkelingen die hebben gezorgd voor de inkapseling van afzonderlijke cellen in druppeltjes referentiemethoden die gebruik maken van verschillende fysieke krachten zoals akoestische of elektrische invloeden voor generatie van druppels met actieve inkapseling single-cellen23,24. Deze methoden hebben echter hun eigen beperkingen in termen van druppel productie16.

In deze studie werd opgericht wij een robuuste en eenvoudige methode die de tekortkomingen van de traditionele methoden omzeilt voor het laden van één of meerdere cellen tot microfluidic apparaten. Onze methode, geïnspireerd door Rho et al., maakt gebruik van anders-sized Pipetteer tips voor het zaaien van kleine hoeveelheden van zeldzame immuuncellen druppel microfluidic platforms zonder significante steekproef verlies en resultaten die met theoretische stroken opgeleverd voorspellingen25. Deze methodologie kan gemakkelijk en met succes aangepast voor verschillende toepassingen waarbij druppel gebaseerde microfluidics en toegepast voor een breed scala aan celtypes of zelfs microdeeltjes.

Protocol

1. 3-inlaat Polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat Fabrication

  1. Meten van 40 g voor PDMS base in een mixer conditionering cup en 4 g voor PDMS uithardende agent toe te voegen het basis reagens in de cup zorgvuldig, met behulp van een druppelaar.
  2. Plaats de cup in de houder van de conditionering mixer en meten van het totale gewicht van de cup met de houder. Stel de waarde van de centrifuge evenwicht gewicht op de conditionering mixer dienovereenkomstig.
  3. Mix van de base en genezen van agent in de mixer van de conditionering van 2.000 toeren per minuut gedurende 2 minuten gevolgd door de schuimvorming van 2.000 toeren per minuut gedurende 2 minuten.
  4. Bereiden een aluminium boot, met een diameter van ongeveer dezelfde grootte als die van een 100 mm silicium wafer. Plaats van het silicium wafer, vervaardigd voor de replica molding proces, in de aluminium boot en zet deze opstelling in een petrischaal (diameter = 120 mm, hoogte = 20 mm).
    Opmerking: De grootte van de petrischaal is afhankelijk van de grootte van het silicium wafer.
  5. De cup van de houder verwijderen en giet het vooraf uitgeharde PDMS mengsel (inhoud van de cup), zorgvuldig op de silicium wafer.
  6. Plaats de petrischaal, met het silicium wafer met het vooraf uitgeharde PDMS mengsel in een exsiccator gedurende ongeveer 20 minuten tot het verwijderen van alle de luchtbellen.
  7. Verwijder de petrischaal na 20 min en controleren op eventuele resterende luchtbellen die kunnen worden verwijderd.
  8. Plaats de petrischaal in een oven, ingesteld op 65 ° C, gedurende ten minste 3 uur.
  9. Verwijder de petrischaal uit de oven na 3 h en zorgvuldig schil de uitgeharde PDMS van het silicium wafer.
  10. Gesneden PDMS apparaten langs de cut lijnen, met behulp van een mes of een scalpel. Punch gaten op de inhammen en uitlaat van elk apparaat met behulp van een 1.2 mm perforatie. Elk apparaat PDMS met scotch tape te verwijderen elke stof of resterende stukken voor PDMS schoon.
    1. Optioneel, klap met stikstof te verwijderen residuele PDMS stukken.
  11. Glas dia's voor te bereiden door het reinigen met zeep-water, gevolgd door isopropanol en droog met stikstof.
  12. Obligatie een schone PDMS apparaat met een schone glasplaatje in een plasma asher te sluiten van de lijnen van de stroom. Gebruik de volgende instellingen: Power: 50 W, tijd: 45 s, afloopgebied vertragingstijd: 2 s, proces gas: Gas 1 (Air), uitlaat: beide kleppen, beperkte vent tijd: 60 s, pomp spin down tijd: 10 s, Vent houden tijd: 0 s, Gas uitschakeling tijd: 1 s, Turbo pompen ingeschakeld : 0. los van alle andere gas regels.
    Opmerking: De instellingen die worden gebruikt voor het plasma asher kan variëren naar gelang het merk van het plasma asher gebruikt.
  13. Bereid de silane oplossing door 50 µL van silane (1H 1U, 2U, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) toe te voegen aan 950 µL van gefluoreerde olie.
    Opmerking: Silane is giftig. Gelieve te opereren onder de zuurkast.
  14. Tekenen de bereid silane-oplossing in een injectiespuit, die is verbonden met een Teflon slangen.
  15. Salinize het apparaat door te spoelen de bereid silane oplossing door de uitlaat van het apparaat.
  16. Plaats het apparaat in een oven, ingesteld op 65 ° C, gedurende 30 min.
  17. Verwijder het verzout apparaat uit de oven en overtollige silane uit het apparaat met gefluoreerde olie spoelen.
  18. Plaats het apparaat terug in een oven, ingesteld op 65 ° C, gedurende ten minste 1 uur om de hechting-proces te voltooien.
    Opmerking: Het Protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. verlies-loze cel inkapseling

  1. Cel oogsten
    1. Resuspendeer Jurkat T-cellen in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium bij concentraties van 1.0x106 cellen/mL, 2.0x106 cellen/mL, 4.0x106 cellen/mL en 8.0x106 cellen/mL; PDC's in hematopoietische serumvrij voedingsbodems (bijvoorbeeld X-VIVO 15) bij concentraties van 1.3x106 cellen/mL, 3.0x106 cellen/mL en 13.0x106 cellen/mL; A549 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met een concentratie van 1.0x106 cellen/mL.
      Opmerking: Het type van cellen en de concentratie van cellen kan variëren op basis van het experiment. Etikettering van cellen kan ook worden gedaan op basis van het experiment.
  2. Tip-laden voor waterige druppel generatie
    1. Bereiden gefluoreerde olie met 3% biocompatibele oppervlakteactieve stof mengsel door 3 mL oppervlakteactieve stof tot 2 mL van gefluoreerde olie toe te voegen.
      Opmerking: De concentratie van de oppervlakteactieve stof toegevoegd aan de gefluoreerde olie bepaalt de stabiliteit van de emulsie voor verschillende incubatie periodes. De concentratie van de oppervlakteactieve stof is afhankelijk van de media die worden gebruikt voor specifieke celtypes.
    2. Trekken de olie fase mengsel in een injectiespuit (1 mL). Verwijderen van luchtbellen uit de spuit en het verbinden met een Teflon-buis van de juiste lengte.
    3. Bereiden een monster spuit met tekening biocompatibel minerale olie in een spuit. Verwijderen van luchtbellen en verbinding van de spuit met een Teflon-buis van de juiste lengte.
    4. Punch een PDMS plug met een diameter van 5 mm van een uitgeharde PDMS plaat.
      Opmerking: De uitgeharde PDMS plaat kan bereid worden met behulp van stappen 1.1 tot en met 1.9. Gebruik een duidelijke silicium wafer in plaats van een verzonnen silicium wafer.
    5. Punch een gat in het midden van de stekker met een 1 mm perforatie.
    6. Steek de stekker in een 200 µL pipette uiteinde, vanaf het grotere einde, zodanig dat er stevig zit.
      Opmerking: Gebruik een pipet 1.000 µL tip voor grotere monstervolume en grotere cellen. Voor 1.000 µL pipette uiteinde, kunnen stekkers van diameter variërend tussen 5 en 7 mm worden gebruikt. Met een stekker met diameter 5 mm, een monstervolume van ongeveer 400 µL aanzuiging kan worden in het uiteinde van de pipet. Als een stekker van grotere diameter gebruikte (7 mm) is, kan meer monstervolume worden aanzuiging (rond 900 µL).
    7. Plaats de buis, die is aangesloten op de spuit, in de PDMS stekker, die is ingevoegd in het uiteinde van de pipet. Duw de plunjer van de injectiespuit langzaam te vullen het aangesloten pipette uiteinde met minerale olie. Alle resterende lucht uitduwen vanaf de punt van de pipet.
    8. Het uiteinde van de pipet, aangesloten op de spuit, in de oplossing van het monster Verlaag en gecombineerd ongeveer 150 µL van het monster in de tip.
    9. Herhaal stap 2.2.4 naar 2.2.8 te bereiden een tweede monster spuit.
    10. Alle de drie bereid spuiten op de spuitpomp zorgvuldig te plaatsen.
    11. Plaats beide de pipet tips, met het monster, in de twee binnenste inhammen van de PDMS-chip. Plaats de buis die de olie fase mengsel in de buitenste inlaat.
    12. De waarde van de stroomsnelheid in de spuitpomp als volgt instellen: continu fase oplossing: 600 µL/h, celsteekproeven: 100 µL/h, elke. Voer en instellen van de afmetingen van de spuit.
      Opmerking: De diameter instellingen zullen variëren afhankelijk van het type van de spuit.
    13. Start de pomp om te spoelen van de oplossing van het monster door de innerlijke kanalen van de fase van het apparaat en de olie door het buitenste kanaal van het apparaat.
    14. Sluit in een buis van de juiste lengte tot de uitlaat te beginnen met het verzamelen van de druppels wanneer de druppel vorming stabiel is. Het tijdstip van de winning is afhankelijk van het experiment.
    15. Verzamelen druppels in een lock-buis. Voeg 200 µL van RPMI medium (zonder serum) op de top van de verzamelde druppels en Incubeer het monster.
      Opmerking: Incubatie tijd van de verzamelde druppels varieert afhankelijk van het experiment. Druppels zijn verzameld in een buis vergrendelen wanneer stroom cytometry gebaseerde analyse of isolatie wordt uitgevoerd na het ophalen van de cellen van de druppels door het breken van de emulsie. Het is mogelijk om te verzamelen van de druppels in een glas kamer als het experiment in-droplet microscopische analyse vereist.
  3. Emulsie breken en cel ophalen voor flow cytometrische analyse
    1. Bereiden van 20% 1H, 1U, 2U, 2H-Perfluoro-1-octanol (PFO) oplossing (v/v) in gefluoreerde olie door toevoeging van 2 mL van PFO 10 ml van HCFs olie.
    2. Verwijder overtollige olie uit de onderkant van de buis van de collectie, met de druppels, met behulp van een injectiespuit.
    3. Voeg 100 µL van 20% PFO-oplossing om de emulsie te breken van de emulsie en de vrijgave van de ingekapselde cellen in de waterige fase. Tik op en meng kort. Doen op dit punt niet vortex. Incubeer gedurende 1-2 min.
      Opmerking: De hoeveelheid PFO toegevoegd afhankelijk van de hoeveelheid druppels geproduceerd. Houd het toevoegen van extra PFO totdat de olie laag volledig is opgelost. Houd in gedachten dat PFO giftig voor de cellen is, en dat ook hoge concentraties van PFO of te lang incubatie in PFO tot leiden kan verhoogd celdood.
    4. Draai de oplossing kort bij de laagste mogelijke rcf voor 30 s.
    5. Bereid de koude Phosphate-Buffered zoutoplossing (PBS) 100 mL oplossing aangevuld met 2% foetale kalf Serum (FCS) (2 mL van FCS in 98 mL PBS).
    6. Pipetteer 550 µL van de waterige breuk, onmiddellijk na het centrifugeren en overbrengen naar een nieuwe sluis buis met 500 µL van koude PBS oplossing aangevuld met 2% FCS, zoals voorbereid in stap 2.3.5. Laat eventuele residuele oil zinken naar de bodem van de nieuwe sluis buis.
    7. Gecombineerd 950 µL van de waterige fase met de cellen van dit slot buis, zorgvuldig, zonder eventuele residuele oil aspirating en breng de oplossing over in een nieuwe sluis buis.
    8. Spin down de cellen in de nieuwe sluis buis gedurende 10 minuten.
    9. Resuspendeer de cellen in 300 µL van koude PBS oplossing aangevuld met 2% FCS, zoals voorbereid in stap 2.3.5.
      Opmerking: De cellen kunnen worden ook opnieuw geschorst in enige andere passende oplossing zoals media afhankelijk van het experiment. De cellen, op basis van het experiment, voor analyse met behulp van stroom cytometry vlek.

3. cel in paren rangschikken

  1. Cel oogsten en vlekken
    1. Jurkat T-cellen, uit cultuur kolf, tellen en spin down de cellen bij 1500 t/min gedurende 5 minuten.
    2. Verwijder het supernatant en resuspendeer 1.0x106 cellen in 1 mL PBS om een concentratie van 1.0x106 cellen/mL. Het bedrag van PBS toegevoegd, is afhankelijk van het aantal cellen.
    3. Herhaal stap 3.1.1 aan 3.1.2 te bereiden een tweede monster van Jurkat T-cellen met dezelfde cel concentratie.
    4. Beide monsters tweemaal met 1 mL PBS bij 1500 t/min gedurende 5 minuten wassen.
    5. Resuspendeer één cel monster met 1,25 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) kleurstof en de andere cel monster met 1,25 µM veel rode kleurstof of 1,25 µM cel proliferatie kleurstof bij een concentratie van de cel van 1.0x106 cellen/mL. De totale kleurstofoplossing is 1 mL voor 1.0x106 cellen.
      Opmerking: Cellen kunnen worden geëtiketteerd met verschillende kleurstoffen afhankelijk van de filters die beschikbaar zijn in de cytometer van de stroom of de fluorescentie Microscoop.
    6. Incubeer de celsteekproeven met kleurstoffen gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
    7. Stop de kleuring reactie door toevoeging van 1 mL van ijs koud FCS na 10 min.
    8. De celsteekproeven tweemaal met 1 mL PBS bij 1500 t/min gedurende 5 minuten wassen.
    9. Resuspendeer de celsteekproeven in RPMI media bij een concentratie van 10.0x106 cellen/mL, voor elke kleur.
  2. Tip-laden voor productie van agarose hydrogel druppels voor cel koppelen
    Opmerking: Voor cel in paren rangschikken met behulp van agarose hydrogel druppels, houden de temperatuur van het systeem tussen de 27 ° C en 37 ° C gedurende de druppel generatie en collectie proces ter voorkoming van de hydrogels gelerend en garandeert cellulaire levensvatbaarheid9.
    1. Los van ultra-lage gelerend temperatuur agarose door verwarming het tot 75 ° C in PBS met een concentratie van 4% (m/v) en roer het mengsel gedurende 20 minuten.
    2. Meng de agarose-oplossing met gelabelde Jurkat T cellen zodanig dat deze een agarose concentratie van 2% (g/v). Herhaal dit voor de andere steekproef met anders gelabelde cellen.
    3. Bereiden gefluoreerde olie met 2% oppervlakteactieve stof mengsel door het toevoegen van 20 mL van de oppervlakteactieve stof tot 30 mL van gefluoreerde olie (olie fase mengsel).
    4. Volg de stappen 2.2.2 - 2.2.14.
      Opmerking: Vanwege de viskeuze aard van lage smeltende agarose en om te zorgen voor stabiele druppel productie, de waarde van de stroomsnelheid in de injectiespuit pompen als volgt instellen: olie fase mengsel: 2.000 µL/h, celsteekproeven: 200 µL/h. Voer en instellen van de afmetingen van de spuit.
    5. Verzamel de druppels in een lock-buis en Incubeer de druppels bij 4 ° C gedurende 60 minuten.
  3. Emulsie te breken en agarose kraal ophalen FACS p.a.
    1. Na incubatie van druppeltjes voor 60 min, overtollige olie uit de lock-buis, met de druppels, met behulp van een injectiespuit te verwijderen.
    2. Voeg 200 µL van PFO de interfase olie verwijderen uit de druppels.
      Opmerking: De hoeveelheid PFO toegevoegd aan de buis is afhankelijk van de hoeveelheid druppels geproduceerd. Houd het toevoegen van extra PFO totdat de olie laag volledig is opgelost.
    3. Wassen van de verzamelde agarose kralen tweemaal met 1 mL koude PBS olie om volledig te verwijderen door middel van centrifugeren bij 1500 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten.
    4. Analyseer verzamelde agarose kralen met behulp van stroom cytometry.
      Opmerking: Het is ook mogelijk om te observeren de kralen onder een fluorescentie Microscoop.

Resultaten

Voor onze experimenten gebruikten we een 3-inlaat PDMS gebaseerde microfluidic apparaat met de hoogte van 25 micron (Figuur 1). In dit apparaat instellen gebruikten we de buitenste inlaat voor het spoelen van de olie met oppervlakteactieve stof en de twee binnenste inhammen voor het spoelen van de waterige fase met cel suspensies of media. Na generatie en collectie, worden de druppels gedurende een paar uur uit chip geïncubeerd voordat downstream analyse met behulp van stroom cytometry. Tijdens de incubatietijd, kunnen serum onderdelen aanwezig zijn in de media interactie met de oppervlakteactieve stof en veroorzaken druppels instabiel te desintegreren. Het is daarom belangrijk een geoptimaliseerde concentratie van de oppervlakteactieve stof aan de gefluoreerde olie toevoegen. We testten de stabiliteit van de monodispersed druppels met hematopoietische serumvrij voedingsbodems aangevuld met 2% menselijk serum met verschillende concentraties van de oppervlakteactieve stof in gefluoreerde olie. Kan worden afgeleid uit Figuur 2 die deze monodispersed-druppels zeer zijn stabiel voor maximaal 24 uur wanneer ten minste 3% oppervlakteactieve stof wordt toegevoegd aan de fase van de olie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met RPMI media met en zonder de toevoeging van 10% FCS (gegevens niet worden weergegeven). Druppel stabiliteit is daarom sterk afhankelijk zijn van optimale oppervlakteactieve stof concentraties bij het werken met verschillende bronnen van cultuurmedia en serum componenten.

Om aan te tonen van de inkapseling efficiëntie van onze aanpak zaadjes we eerst de cellen met behulp van slangen aangesloten op spuiten, oftewel de meeste conventionele aanpak voor het zaaien van de cellen (Figuur 3A). We Jurkat T-cellen in verschillende concentraties van 1.0x106 cellen/mL, 2.0x106 cellen/mL en 4.0x106 cellen/mL geoogst en verkregen een inkapseling efficiëntie die lager dan de voorspelde waarden (Figuur 3B was). De Fractie van druppeltjes die een enkele cel was bij 1.0x106 cellen/mL, 2,5%, hetgeen niet verhogen zelfs op het gebruik van hogere concentraties van de cel. Het vergroten van de efficiëntie van de cel-laden, we onze eerdere aanpak gewijzigd de slang op de helft van de lengte op een verhoogde statief gemonteerd en geladen van de celsuspensie in de helft die is verbonden aan het PDMS apparaat (Figuur 4A). Met behulp van deze aanpak, we ingekapseld Jurkat T cellen in verschillende concentraties van 1.0x106 cellen/mL, 2.0x106 cellen/mL, en 4.0x106 cellen/mL, en ook zeldzame PDC's in verschillende concentraties van 1.0x106 cellen/mL, 2.0x106 cellen/mL, en 12.0x106 cellen/mL. We hadden verwacht betere inkapseling tarieven door cel sedimentatie te voorkomen dat met deze methode. Echter bij alle de concentraties getest, waren de experimentele resultaten veel lager dat de voorspelde Poisson waarden (Figuur 4B en Figuur 4C).

Met behulp van onze aanpak van de tip-laden we onze cel inkapseling tarieven om het verkrijgen van experimentele resultaten stroken met de statistisch voorspelde waarden (Figuur 5A) geoptimaliseerd. Voor verschillende concentraties van Jurkat T-cellen gematched de verkregen inkapseling efficiëntie onze berekende waarden bij alle concentraties (Figuur 5B). Opmerkelijk, zelfs met aanhangend cellen zoals A549 tumorcellen, die de neiging om het groepje, zien we een licht verbeterde inkapseling-efficiëntie op een cellulaire concentratie van 1.0x106 cellen/mL (Figuur 5C). Wij ook beoordeeld de doeltreffendheid van ons systeem om in te kapselen minder beschikbaar en schaarse PDC's bij andere cel concentraties van 1.0x106 cellen/mL, 3.0x106 cellen/mL en 13.0x106 cellen/mL (Figuur 5D). Ter vergemakkelijking van het laden van eventueel grotere volumes meer dan 200 µL, bijvoorbeeldbij het werken met cellijnen of meer overvloedig primaire immune cellen, we onderzocht ook de efficiëntie van de inkapseling cel met behulp van 1000 µL tips (blauw). We toonden aan dat deze 1.000 µL tips gaf een vergelijkbaar inkapseling efficiëntie in vergelijking met de 200 µL tips (geel) (Figuur 5E).

Afhankelijk van de chip ontwerp en onderzoek vraag bij de hand, onze tip laden techniek kan worden gebruikt om te laden cellen via één aansluiting, voor indringende in cellulaire heterogeniteit, of meerdere inhammen in parallel, voor het decoderen van cellulaire interacties. Wij vergeleken het laden van Jurkat T-cellen (bij een concentratie van 10.0x106 cellen/mL) van een inlaat aan twee anders gelabelde populaties van Jurkat T-cellen (bij een gecombineerde concentratie van 10,0 x106 cellen/mL) van de twee baaien (Figuur 6 A en Figuur 6B). Tijdens de inkapseling, waren de druppels gegenereerd met behulp van ultra-lage gelerend temperatuur agarose en gegeleerde na productie naar formulier agarose hydrogel kralen waardoor latere downstream analyse via microscopie en stroom cytometry (Figuur 6 C en Figuur 6D). Microscopische analyse kwam naar voren dat cel koppeling werd bereikt op verschillende combinaties met de vermelding voor hoge doorvoer cel koppelen (Figuur 6C). Bovendien, analyse van de dezelfde populatie van hydrogel parels door stroom cytometry geopenbaard dat kralen zonder cellen kunnen worden gescheiden van kralen met cellen op basis van de verschillende vooruit (FSC, grootte) en boven (SSC, granulariteit) spreiding patroon (Figuur 6 D). Gating op de bevolking van kralen zonder cellen bevestigd een gebrek aan cel inkapseling door het ontbreken van fluorescerende signalen. Bovendien onthulde gating op de bevolking van de kraal met cellen het bestaan van meerdere subpopulatie indicatief voor de inkapseling van anders gelabelde Jurkat T-cellen. Onze resultaten tonen aan dat efficiënte cel in paren rangschikken kan worden bereikt, op basis van beide microscopische cytometrische analyse stromen en een licht verhoogd inkapseling efficiëntie ten opzichte van de Poisson voorspelling (Figuur 6E toonden).

figure-results-1
Figuur 1 . PDMS gebaseerd druppel microfluidic apparaat met drie inhammen en één afzet. Het apparaat bestaat uit drie inhammen voor continue olie fase, cel cultuurmedia en celsuspensie, respectievelijk. De gegenereerde druppels worden verzameld bij de uitlaat. De monsters stromen laminarly naar de stroom-focusing kruising waar ze zijn ingekapseld in druppeltjes. Bij de inhammen, filter structuren houden grote deeltjes zoals proteïne of cel aggregaten terug. De diameter van de gaten in de structuur van de filter worden aangeduid met blauwe lijnen. De diameter van de kanalen op het mondstuk van de productie worden aangegeven door rode lijnen. De hoogte van het kanaal op de gehele chip was 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 . Druppel stabiliteit gedurende 24 uur. De grafieken tonen het gebied van druppels met hematopoietische serumvrij voedingsbodems + 2% menselijk serum, na verloop van tijd voor drie verschillende concentraties van de oppervlakteactieve stof A) 0,5% B) 3% C) 5%. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3 . Buizen op basis van cel laden aanpak. Jurkat-T-cellen worden geladen met verschillende concentraties aan het apparaat met behulp van een injectiespuit aangesloten op buizen. A) de afbeelding ziet u de experimentele opzet B) de snelheid van cel inkapseling, zoals bepaald door de lichte microscopie. Stippen: experimenteel bepaald waarden; Gesloten lijnen: Poisson-verdeling. Foutbalk vertegenwoordigt de standaardfout van gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4 . Inkapseling van verschillende celtypes in verschillende concentraties met behulp van een verticale buis laden aanpak. Jurkat T-cellen en PDC's (van verschillende concentraties) werden ingekapseld om na te gaan van de efficiëntie voor de inkapseling van de cel. A) de afbeelding ziet u de experimentele opstelling voor de verticale buis laden aanpak. B) de grafiek toont de efficiëntie van de inkapseling van Jurkat T cellen. C) de grafiek toont de efficiëntie van de inkapseling van PDC's. Stippen: experimenteel bepaald waarden; Gesloten lijnen: Poisson-verdeling. Foutbalk vertegenwoordigt de standaardfout van gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-5
Figuur 5 . Tip laden aanpak om in te kapselen verschillende cellen typen. A) Schematische illustratie van de tip laden techniek. B) de grafiek toont de efficiëntie van de inkapseling van Jurkat cellen. C) de grafiek toont de efficiëntie van de inkapseling van A549 cellen. D) de grafiek toont de efficiëntie van de inkapseling van PDC's. E) de grafiek toont de efficiëntie van de inkapseling van Jurkat T cellen met behulp van 200 µL Pipetteer tips (geel) en 1.000 µL Pipetteer tips (blauw). Stippen: experimenteel bepaald waarden; Gesloten lijnen: Poisson-verdeling. Foutbalk vertegenwoordigt de standaardfout van gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-6
Figuur 6 . Cel in druppeltjes in paren rangschikken. A) Schematische illustratie van de tip laden aanpak voor het koppelen van afzonderlijke cellen uit 2 inhammen in druppeltjes. B) de grafiek toont de inkapseling van Jurkat T cellen met behulp van een inham of twee inhammen in parallel. De concentratie van de cel voor een tip is 2.0x106 cellen/mL en de concentratie van de cel voor twee tips beide 1.0x106 cellen/mL. Stippen: experimenteel bepaald waarden; Gesloten lijnen: Poisson-verdeling. C) de fluorescentie microscopische overlays van hydrogel kralen en geëtiketteerd Jurkat T-cellen. D) De grafiek toont de stroom cytometrische analyse van de gekoppelde cellen in agarose hydrogel kralen. De plot toont zowel voorwaartse scatter en zijwaartse scatter. E) vergelijking van cel nummers in agarose hydrogel kralen opgespoord door fluorescentie microscopie en stroom cytometry. Bars: gemiddelde waarde; Snorharen: de standaardfout van het gemiddelde, n ≥ 4. Foutbalk vertegenwoordigt de standaardfout van gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

In dit protocol hebben we een efficiënte en eenvoudige techniek om te laden en kapselen cellen in druppels voor high-throughput, eencellige analyse en voor het uitvoeren van gecontroleerde cel pairing voor cellulaire interactie studies aangetoond. Wij hebben bovendien ten opzichte van verschillende conventionele benaderingen om te laden cellen naar microfluidic apparaten en is gebleken dat onze tip laden aanpak een meer efficiënte techniek in vergelijking met andere methoden.

Studie klinische monsters of zeldzame celtypes schaars in nummer door druppel gebaseerde microfluidics bezitten sommige inherente uitdagingen. Zoals we ook hebben aangetoond, cellen de neiging om sediment in spuiten en oppervlak van de buis, aldus, voorkomen van cellulaire inkapseling om te voldoen aan de voorspelde waarden. Om dit probleem te omzeilen, sommige groepen gebruik maken van opzwepende staven in de spuiten. Echter bij het gebruik van zeldzaam en beperkt cel populaties, is het volume van de cel Totaal ook beperkt, waardoor, beperking van het gebruik van grote spuiten en bars roeren. Bovendien, we ook meer gebruikte buizen vervangen door Teflon gecoate buizen om te voorkomen dat cel bijlage maar deze methode heeft niet de resultaten verbeteren en als de slang lang is, het probleem van de cel bijlage verergert (gegevens niet worden weergegeven). Als alternatief, gebruikten we een verticale buis laden aanpak waar de cellen in de buizen en niet in de spuit om te voorkomen dat het verlies van cellen in grote spuit volumes werden geladen. Met behulp van deze techniek, kan cellen met kleine monstervolume worden geladen, bijvoorbeeld PDC's die zijn zeldzaam en beperkt. Ook, het monster van de buis wordt geladen aan het apparaat verticaal om te voorkomen dat cel sedimentatie. De slang gebruikt voor cel zaaien kleine afmetingen heeft en kan worden vergeleken met microchannels. De stroom in de buis is druk gedreven en volgt een parabolische snelheid profiel26. Dit betekent dat de maximale stroomsnelheid in het midden van de buis is en minimale snelheid op de randen van de buis-27 is. Wanneer spoelen een bevolking van cellen via de buizen, het verloop van de snelheid zorgt ervoor dat de cellen te worden geduwd naar de randen waar ze settelen omdat de snelheid bij de grens dicht bij nul. De sedimentatie of afwikkeling van cellen in de buizen, vermindert daardoor de efficiëntie van de inkapseling zoals aangegeven in de representatieve resultaten waar de experimentele gegevens niet met het model voorspelde overeen deed.

Een ander vaak aangepast oplossing gebruikt door wetenschappers, werken met druppel microfluidics, is het verhogen van de dichtheid van de voedingsbodems van de cel door toevoeging van dichtheid bijpassende reagentia zoals Iodinaxol om te voorkomen dat cel sedimentatie in spuiten19. Echter dichtheid bijpassende reagentia cellulaire gedrag kan beïnvloeden en nadelige invloed op de cytokine secretie door cellen (gegevens niet worden weergegeven)28.

Hoewel verschillende kleine en grote wijzigingen in conventionele cel laden technieken lichte verbeteringen in de efficiëntie van de inkapseling vertoonden, de verkregen experimentele resultaten nog niet overeenkomt met de theoretische berekeningen. Echter, met het puntje laden aanpak kunnen we de overwonnen de beperkingen van eerdere methoden en inkapseling efficiëntie beheerst door Poisson statistieken. Deze techniek is niet alleen voordelig voor het laden van de cellen van de schorsing, maar kan ook worden toegepast voor het laden van Adherente cellen, zoals primaire keratinocyten en A549 met microfluidic chips. Bij het gebruik van overvloedige cellijnen, bijvoorbeeld A549, K562, etc., kan grotere monstervolume worden gebruikt. Daarom, afhankelijk van het volume van het monster, verschillende grote pipet-tips kunnen ook worden gebruikt en deze simpele techniek kan worden aangepast voor zowel eencellige inkapseling en meerdere cel inkapseling.

Terwijl lage cel concentratie nodig is om de inkapseling van afzonderlijke cellen in druppeltjes, gewenst zijn hogere concentraties van de cellen te verhogen van het gemiddelde aantal cellen ingekapseld in elke druppel voor studies met betrekking tot de koppeling van de cel. Er zijn verscheidene methodes van eencellige die eerder zijn beschreven voor paar immune cellen op microfluidic chips of microfabricated nanowells29,30,31. In de druppel microfluidics dicteert Poisson statistieken dat 1:1 cel pairing voor twee verschillende soorten cellen kan worden verwezenlijkt in optimale cel concentraties. Op basis van de voorspelling van de Poisson, is er ook een kans dat druppels andere combinaties bevatten. Terwijl 1:1 cel in paren rangschikken kan wenselijk zijn om te studeren cellulaire interacties op eencellige niveau en resulteert in verhoogde cellulaire begrip, heeft meerdere cel koppeling ook grote voordelen. U kunt begrijpen van de invloed van meerdere cellen van één celtype op het andere celtype. Cross talk tussen verschillende immune cellen helpen voor het genereren van een effectieve immuunrespons tegen verschillende infecties en ziekteverwekkers en voegt ook robuustheid naar ons immuunsysteem32. Cellulaire communicatie kan als zodanig worden ondervraagd met hoge precisie in verschillende contexten, bijvoorbeeld 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, enz. opbrengst meer begrip over hoe één of paren van cellen bepalen de inductie van de immuunrespons. Dit is met name interessant om te bestuderen bijvoorbeeld de capaciteit van natural killer cellen of cytotoxische T-cellen te doden serieel hun respectieve doelcellen.

Zoals besproken, voor meerdere inkapseling van cellen in druppeltjes, zijn hogere concentraties van de cel gewenst. Nochtans, tijdens het laden van cellen uit één inlaat voor de inkapseling van de cel, hogere concentraties van cel monster kunnen veroorzaken cellen tot totaal bij de inlaat. Dit resulteert in lagere inkapseling en hogere afwijking van de theoretische waarden. Om dit probleem te omzeilen, kunnen de cellen worden geladen uit twee aparte inhammen ook. Theoretisch zou het mogelijk zijn om andere microfluidic-apparaten met meerdere inhammen om nog hogere niveaus van cel inkapseling waar gemiddeld op x aantal cellen is gerechtvaardigd. In deze studie onderzocht we de efficiëntie van de inkapseling van Jurkat T-cellen wanneer geladen vanuit zowel een inlaat en twee inhammen met behulp van dezelfde totale concentratie en soortgelijke inkapseling efficiëntie verkregen. Deze wijziging kan onderzoekers aan paar verschillende soorten cellen op chip.

Hoewel deze methode helpt bij het laden van cellen naar microfluidic apparaten zonder een significant verlies van cellen, zijn er bepaalde voorzorgsmaatregelen die moeten worden gehouden in het achterhoofd. Bij het invullen van het spuiten met minerale olie en aspirating van het monster van de cel in de pipet tips, opneming van luchtbellen moet worden vermeden en het gehele systeem moet lucht-vrij. Het is ook belangrijk om in gedachten houden dat de minerale olie niet met het monster vermengen moeten. Pipetteer tips, met monsters, moeten stevig in de inhammen van het microfluidic-apparaat, met de grootste voorzorg, ter voorkoming van lekkage en de verdere integratie van luchtbellen worden opgenomen. Om samen te vatten, is tip-laden een eenvoudige, maar robuuste techniek die voor high-throughput analyse van cellulaire gedrag door inkapseling van de cel zonder een significant verlies van cellen op een kosteneffectieve manier toelaat. Wanneer gebruikt in combinatie met optimale monsterconcentraties bij de inlaat, deze aanpak van het laden van de cellen met de pipet-tips is zeer flexibel en kan worden aangepast voor verschillende soorten cellen, met name voor zeldzame primaire immune cellen, dicht bij het verkrijgen van hogere efficiëntie van de inkapseling, voorspelde modellen.

Openbaarmakingen

Wij hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de TU/e voor genereuze steun.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol Sigma-Aldrich171468-5G
1H,1H,2H,2H-PerfluorooctyltriethoxysilaneFluorochem/UKS13150Silane (giftig)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature)Sigma-Aldrich 9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-puntenFisher Scientific10630694Spuit
Biopsy Punch 1.2 mmHarris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670eBioscience65-0840-85
CellTrace CFSEInvitrogenC34554
CellTrace Far Red CellInvitrogenC34564
Eppendorf TubesEppendrof TubesSafe-Lok tubes 1 mL en 2 mL
Glass SlideSigma AldrichCLS294775X38-72EACorning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard PumpsHarvard ApparatusC-400750; C-400727Spuitpompen
HFE-7500 3M Novec Engineered fluidFluorochem/UK51243Gefluorineerde olie
Kai Biopsy Punch 5 mmAmstel Medical1980130
Luer stubInstechlabs/USALS20SLuer stub, 20ga (roze) x 0,5 inch (12mm), niet-sterieel
Mineral oil (Light)Sigma AldrichM8410-1L
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP4417-50TABTabletten
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500)Sphere Fluidics020317-09Oppervlakte-actieve stof
Plasma AsherEmitechK1050X Plasma asher
RPMI 1640 MediumGibco11875093
Silicone Elastomer Base 184Sylgard9355218PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent Sylgard9355218Hardingsmiddel 
Stainless steel catheter couplerInstechlab/USASC20/1520ga x 15mm, niet-sterieel
TFE Teflon TubingSigma-Aldrich58696-UPTFE buis  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0,031 in.
Thinky mixer ARE-250EX-4025FConditioneringsmengsel
```

Referenties

  1. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
  2. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
  3. Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
  4. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  5. Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
  6. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  7. Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
  8. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  9. Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740(2013).
  10. den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
  11. Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732(2009).
  12. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  13. Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43(2013).
  14. Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  15. Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).
  16. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  17. Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881(2012).
  18. Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110(2008).
  19. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  20. Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
  21. Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
  22. Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317(2018).
  23. Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898(2008).
  24. Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139(2007).
  25. Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
  26. Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
  27. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42(2001).
  28. Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
  29. Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
  30. Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
  31. Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175(2012).
  32. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DruppelmicrofluidicaCelinkapselingLaden van pipetpuntenPoisson verdelingFlowcytometrieMicroscopische analyseHydrogelkraaltjesEmulsiebrekingSpuitpompTeflon buisjes
Een pipet-Tip gebaseerde methode voor Seeding cellen Droplet Microfluidic Platforms
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.