Het doel van dit protocol is voor het uitvoeren van in situ hybridisatie op volwassen koraal monsters die zijn ingesloten in paraffine en gesegmenteerd in glas dia's. Dit is een kwalitatieve methode gebruikt voor het visualiseren van de ruimtelijke uitdrukking van een sonde van de anti-zin RNA in paraffine-ingebedde weefsels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Situ Hybridisatie technieken voor paraffine-ingebedde volwassen koraal monsters
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Koralen zijn belangrijke Oceaan-ongewervelde dieren die kritisch zijn voor de algehele gezondheid van de Oceaan, alsmede de gezondheid van de mens. Echter, als gevolg van menselijke invloed zoals stijgende oceaan temperaturen en de verzuring van de Oceaan, koralen zijn steeds meer bedreigd. Om deze uitdagingen aan te pakken, vooruitgang in de cel- en moleculaire biologie gebleken doorslaggevend zijn voor de diagnose van de gezondheid van koralen. Wijzigen van aantal van de technieken die vaak gebruikt in de menselijke geneeskunde, kan onderzoekers kunnen behandelen en opslaan van koralen aanzienlijk verbeteren. Om aan te pakken dit, is een protocol voor in situ hybridisatie hoofdzakelijk gebruikt in de menselijke geneeskunde en evolutionaire ontwikkelingsbiologie aangepast voor gebruik in volwassen koralen onder stress.
Het doel van deze methode is om te visualiseren de ruimtelijke uitdrukking van een RNA-sonde in volwassen koraal weefsel dat is ingesloten in paraffine en gesegmenteerd in glas dia's. Deze methode richt zich op de verwijdering van paraffine en rehydratie van het monster, voorbehandeling van het monster te waarborgen van de permeabiliteit van de steekproef, de kruising van de pre-incubatie, kruising van de RNA-sonde en visualisatie van de RNA-sonde. Dit is een krachtige methode bij het gebruik van niet-modelorganismen om te ontdekken waar specifieke genen worden uitgedrukt, en het protocol kan gemakkelijk aangepast voor andere niet-model-organismen. De methode is echter beperkt, in die zin dat het vooral kwalitatieve, omdat de expressie intensiteit kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid tijd gebruikt tijdens de stap van visualisatie en de concentratie van de sonde. Geduld is bovendien vereist, als dit protocol kan nemen tot 5 dagen (en in veel gevallen, langere) afhankelijk van de sonde wordt gebruikt. Tot slot, niet-specifieke achtergrondkleuring is gemeenschappelijk, maar deze beperking kan worden overwonnen.
Inleiding
Koralen zijn kritische ecosysteem bouwers en belangrijk is voor de biodiversiteit in de Oceaan en de gezondheid van de mens1,2,3. Ze worden bedreigd als gevolg van de klimaatverandering en andere antropogene stressoren en vele soorten koraal worden beschouwd als kritisch bedreigde. Er is dus behoefte aan een belangrijke cellulaire en moleculaire tools voor de diagnose van koralen onder stress. Ook, er is weinig begrepen over waar de genen binnen volwassen koraal weefsel, en dus weinig begrip van de functies van deze genen worden uitgedrukt. Om dit probleem te verhelpen, hebben we het in situ hybridisatie (ISH) protocol, vaak gebruikt in de menselijke geneeskunde en evolutionaire ontwikkelingsbiologie, voor gebruik op paraffine-ingebedde weefselsteekproeven van volwassen koralen aangepast. Deze techniek is het meest krachtige wanneer gebruikt op volwassen koralen die een stressvolle gebeurtenis zoals blootstelling aan hittestress hebben ondergaan. Echter, deze techniek kan worden gebruikt op een breed scala van weefsels en levensfasen in koralen en is niet beperkt tot alleen warmte-benadrukt koralen4,6,7. Deze techniek kan bovendien worden gebruikt op weefsels of cellen van een metazoan, zolang er cDNA opeenvolgingsinformatie beschikbaar is.
Het doel van deze methode is om te visualiseren van RNA sondes binnen volwassen koraal weefsel dat is bewaard gebleven en ingebed in paraffine en gesegmenteerd in dia's. Deze methode is een krachtig diagnostisch hulpprogramma waarmee voor de visualisatie van nucleïnezuren binnen volwassen koraal weefsel. In eerste instantie deze methode werd ontwikkeld voor medische diagnostiek, en het is sindsdien een populaire tool op gebieden zoals ontwikkelingsbiologie en evolutionaire ontwikkelingsbiologie8,9,10. ISH is ook een kritische methode, met name in de niet-modelsystemen, wanneer genomic en transcriptomic sequencedata zijn beschikbaar maar ruimtelijke gen expressiepatronen zijn onbekend. Voor diagnostische werk in niet-modelsystemen is deze techniek krachtig omdat het aangeven kunt welke cellen en weefsels express een gen van belang en tot meer gerichte therapeutische benaderingen8,9,10leiden kunnen, 11,12. Tot slot, deze techniek is kwalitatieve en krachtiger wanneer in paren gerangschikt met kwantitatieve gen expressie gegevens11.
De in dit document geschetste benadering zal van belang zijn voor onderzoekers die reeds een heksenkruid (DIG) ontworpen-label RNA sonde (zowel de betekenis en antisense sondes) en zijn nu klaar om uit te voeren in situ hybridisatie van de sondes op een steekproef. Voor het uitvoeren van deze methode, zal twee seriële secties van een paraffine koraal weefsel nodig zijn voor elke sonde wordt getest. Één sectie zal worden gebruikt voor de zin sonde en de andere voor de antisense sonde. De sonde zin zullen een besturingselement aan niet-specifieke binding. Als de kleuring wordt waargenomen in de sonde zin, vervolgens is de antisense sonde niet specifiek voor het RNA van belang. Sondes kunnen worden ontworpen voor elk gen uitgedrukt. In dit protocol, verschillende voorbeelden worden gebruikt die eerder werden gevonden tijdens hittestress in koralen worden uitgedrukt: FBJ lymfkliertest Osteosarcoom virale oncogen homolog B (Fos-B), Activator eiwit (AP1), en Tumor necrose factor receptor (TNFR 41) – 4111. ISH met behulp van de DIG-geëtiketteerden RNA sondes heeft de voorkeur boven het gebruik van radioactieve sondes, omdat de behandeling veel veiliger10 is. Bovendien, deze techniek is zeer gevoelig en kan worden uitgevoerd op een breed scala van weefsels en de embryo's dan warmte-benadrukt volwassen koralen13,14,15,16.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. verwijdering van paraffine
Let op: Voer de volgende stappen uit onder een zuurkast.
- Dewax de dun-gesegmenteerd paraffine-ingebedde dia's met 100% xyleen onder de motorkap in glazen potten van de Coplin gedurende 10 minuten. Gebruik geen plastic potten van de Coplin, zoals xyleen plastic smelt. Het steriliseren van de potten van de Coplin in een autoclaaf vóór gebruik.
- Bereiden van vier steriele glazen potten van de Coplin met devolgende: 100% ethanol, 80% ethanol, ethanol 70% en 60% ethanol. Verdun de ethanol met RNase-gratis water.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 100% ethanol en geniet ze gedurende 10 minuten. Na 10 min, de glazen Coplin pot leeg en vervangen door nieuwe 100% ethanol. Geniet van de dia's weer voor 10 min.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 80% ethanol voor 1 min.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 70% ethanol voor 1 min.
- De dia's overbrengen naar de steriele glazen Coplin pot met 60% ethanol voor 1 min.
2. voorbehandeling van dia's voor bereiding van RNA sonde hybridisatie
- Voer de volgende wast bij kamertemperatuur, tenzij anders is bepaald. Kamer temperatuur wast op een roteerschudapparaat op een langzame snelheid uitvoeren. Steriele dia mailers met ruimte voor maximaal vijf dia's voor het wassen van de dia's gebruiken
- De dia's overbrengen in een steriele dia mailer met 18 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Wassen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Giet af de PBS 1 x, en het weefsel onmiddellijk te behandelen op de dia's met proteïnase K om sonde penetratie van het weefsel. Ongeveer 18 mL proteïnase K-oplossing toevoegen aan de dia-mailer (Zie tabel 1 voor concentratie voorraadoplossing werken). Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Niet schudden.
- Terwijl de dia's aan het broeden zijn, bereiden de prehybridization buffer (Prehybe Buffer). Plaats de Prehybe Buffer in een kokend waterbad voor 10 min, dan koel op een ijsbad gedurende 5 minuten. Voor een recept van de Buffer van de Prehybe, Zie tabel 1.
- Stoppen van vertering van het proteïnase K-reactie door gieten de proteïnase K-oplossing, en 18 mL van 0,2% glycine-PBS-oplossing onmiddellijk vergroten met de dia-mailer. Laat de dia mailer zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Giet de 0,2% glycine-PBS oplossing en 2 x zoute Natriumcitraat (SSC) oplossing 18 mL toevoegen aan elke dia mailer. Wassen van de dia's in de 2 x SSC gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, met het schudden van 100-150 toeren per minuut.
3. prehybridization van dia's in voorbereiding voor RNA sonde hybridisatie
- Terwijl de dia's worden gewassen met 2 x SSC, krijgen een nieuwe steriele dia-mailer en ongeveer 18 mL Prehybe Buffer in de dia-mailer. Plaats de dia mailer in de oven van de kruising bij kruising temperatuur.
Opmerking: De temperatuur van de kruising zal afhangen van de sonde wordt gebruikt maar meestal varieert van 50-60 ° C. - Zodra de 2 x SSC-wash wordt voltooid, het uitgieten van de 2 x SSC, en plaats de dia's binnen de dia mailer in de Buffer van de Prehybe in de kruising oven gedurende 1 uur.
4. de kruising van de RNA-sonde
- Terwijl de dia's worden aan het broeden met de Buffer van de Prehybe in de oven hybridisatie, bereiden hybridisatie-sonde oplossing.
- Verdun elk sonde in kruising buffer (0,5 µL van sonde met 24,5 µL van hybridisatie buffer).
Opmerking: Het recept voor hybridisatie buffer is gevonden in tabel 1. Een voorbeeld van sonde voorbereiding en concentraties kan worden gevonden in Traylor-Knowles et al. 11. - Plaats de verdunde sonde op een 86-90 ° C warmte blok voor 12 min en vervolgens afkoelen voor 1 min op ijs.
- Verdun elk sonde in kruising buffer (0,5 µL van sonde met 24,5 µL van hybridisatie buffer).
- Verwijder de mailer dia uit de kruising oven en dia's afzonderlijk te verwijderen uit de dia mailer steriel pincet gebruiken. De dia's leggen plat op een papieren handdoek, en zorgvuldig veeg overtollige Prehybe Buffer rond de weefselmonsters. Wees voorzichtig niet te raken van de monsters, en werken snel om te voorkomen dat het drogen van de weefselmonsters.
- Omcirkelen het weefsel met een pen van PAP. Breng 25 µL van verdunde sonde oplossing met een pipet en dekking van het monster met een kunststof dekglaasje aan.
- Leg de monsters in de dia vocht zaal met 4 x SSC + 50% formamide-oplossing in de bodem van de kamer.
- Zodra sondes zijn toegevoegd aan alle dia's, plaatst u de dia vocht zaal in de kruising oven gedurende ten minste 24 uur bij een temperatuur van de kruising van 50-60 ° C. De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de concentratie van de sonde, maar moet gedurende ten minste 24 uur.
- Na overnachting incubatie met de verdunde sondes, de dia vocht zaal van de kruising oven te verwijderen.
- Coverslips uit elk van de dia's, voorzichtig om niet te verplaatsen van het weefsel te verwijderen. Voeg 1000 µL van 2 x SSC-oplossing in een 1000 µL Pipet, en zachtjes de dia afwassen.
- Plaats de dia in een steriele dia mailer met 18 mL 2 x SSC oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en vervangen met 18 mL vers 2 x SSC. Herhaal de incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Giet de 2 x SSC-oplossing. Voeg 18 mL 1 x SSC oplossing en wassen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet de 1 x SSC-oplossing en vervangen met 18 mL vers 1 x SSC. Herhaal de incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Giet de 1 x SSC. Voeg 18 mL 0,5 x SSC en wassen gedurende 10 minuten bij 42 ° C zonder schudden. Giet de 0,5 x SSC en vervangen met 18 mL verse 0,5 x SSC. Weer wassen gedurende 10 minuten bij 42 ° C zonder schudden.
5. visualisatie van de RNA-sonde
Opmerking: Voor het visualiseren van de sonde, BM paars zal worden gebruikt tijdens het ontwikkelingsproces. Voor deze stap zijn echter meerdere wasbeurten nodig ter voorbereiding van de monsters van de kleuring.
- De dia's met 18 mL alkalische fosfatase buffer (AP-buffer) wassen zonder MgCl2 voor 1 min. de AP-Buffer zonder MgCl2uitstorten, en voeg 18 mL 1 x Boehringer-Mannheim blokkeerbuffer verdund met maleïnezuur buffer. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur in een dia mailer met zacht schudden.
Opmerking: De Boehringer-Mannheim blokkeerbuffer en maleïnezuur buffer gebruikt waren premade en gekocht in de DIG Wash en blok Buffer ingesteld (beschikbaar commercieel).- Als alternatief, incubatie 's nachts bij 4 ° C kan worden uitgevoerd. Een langer blokkeringstermijn zal het verminderen van de verschijning van niet-specifieke binding.
- Voorbereiden van de 20 mL van de verdunde DIG anti-heksenkruid-AP Fab-fragmenten (anti-DIG antilichaam = 2 µL van anti-DIG antilichaam + 20 mL 1 x Boehringer-Mannheim blokkeerbuffer). Dit is genoeg voor gebruik in 1 kunststof dia mailer. Meer van deze oplossing moet worden bereid als meer dan één dia mailer wordt gebruikt.
- Het anti-DIG antilichaam toevoegen aan een nieuwe steriele dia-mailer en overbrengen van de dia's naar de dia mailer met de anti-DIG antilichaam-oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur met zacht schudden.
- Na incubatie, uitstorten van het anti-DIG antilichaam en wassen van de dia's in de dia-mailer met 18 mL AP-Buffer zonder MgCl2 voor 5 min met zacht schudden.
- De AP-Buffer zonder MgCl2, uitstorten, en voeg 18 mL AP-Buffer. Wassen voor 5 min met zacht schudden. Na de incubatie van 5 min, giet af de AP-Buffer, 18 mL verse AP-Buffer te vervangen en wassen voor 5 min met zacht schudden.
- In het donker, uitstorten van de AP-Buffer en 18 mL BM paarse toevoegen aan de dia-mailer. Incubeer de dia's bij kamertemperatuur in het donker, controleren op paarse kleur ontwikkeling die elke ½ h. reactietijden voor visualisatie zal variëren op basis van de sonde die wordt ontwikkeld.
Opmerking: In plaats van BM paarse visualization, oplossing van de gegevensbestandontwikkeling kan worden gemaakt met behulp van 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BVIE) en nitro blauwe tetrazolium (NBT). Zie tabel 1 voor instructies. - Stop kleur ontwikkeling door de dia's naar een nieuwe steriele dia mailer met 18 mL Tris-EDTA (TE) buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, in het donker.
- Giet af de buffer TE en 18 mL RNase-gratis water toevoegen aan de dia mailer en wassen voor 1 min, in het donker.
- De dia's te verwijderen uit het water en droog ze rond de randen van het weefsel. Voegen glycerol montage van drager en de coverslips te plaatsen. De dia's bij 4 ° C worden opgeslagen totdat de foto's zijn klaar om te worden genomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na het voltooien van dit protocol, zal identificatie van cellen en weefsels die zijn uiting van de RNA-sonde van belang worden bereikt. De representatieve resultaten voor dit protocol zijn voor AP-1, FosB en TNFR41. Deze resultaten, eerder gepubliceerd door Traylor-Knowles et al. 11, Toon ruimtelijke uitdrukking van RNA sondes op volwassen koralen die werden blootgesteld aan hittestress. Twee voorbeelden van verschillende typen van de kleuring worden gepre...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in dit protocol beschreven methode is gewijzigd van eerdere werkzaamheden in medisch en evolutionaire developmental onderzoek8,9,10,12,17. Dit protocol is gericht op de nuances van een in situ -hybridisatie met een DIG-geëtiketteerden RNA anti-zin-sonde op volwassen koralen, die zijn bewaard en ingebed in paraffine. Deze methode kan gemakkelijk wor...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door award geen. OCE-1323652 door de National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship en award no.1012629 vanuit de Burroughs Wellcome Fonds postdoctorale verrijking programma.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
Referenties
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933(2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742(2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540(2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59(2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311(2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- In situ hybridization protocols. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization. , Oxford University Press. (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900(2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15(2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24(2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3(2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
