Fluorescentie Live-cel beeldvorming van de Complete vegetatieve celcyclus van de langzaam groeiende sociale bacterie Myxococcus xanthus

Samenvatting

Bacteriële cellen zijn ruimtelijk zeer georganiseerd. Volg deze organisatie na verloop van tijd in traag groeiende Myxococcus xanthus cellen en werd een set-up voor fluorescentie live-cel beeldbewerking met hoge Spatio resolutie gedurende enkele generaties ontwikkeld. Met deze methode kon Spatio dynamiek van belangrijke eiwitten voor chromosoom segregatie en celdeling worden vastgesteld.

Samenvatting

Fluorescentie live-cel beeldvorming van bacteriële cellen is een belangrijke methode bij de analyse van de ruimtelijke en temporele dynamiek van eiwitten en chromosomen ten grondslag liggen aan de centrale celcyclus gebeurtenissen. Echter, imaging van deze moleculen in de langzaam groeiende bacteriën vertegenwoordigt een uitdaging vanwege photobleaching van fluorophores en fototoxiciteit tijdens Beeldacquisitie. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om te omzeilen deze beperkingen in het geval van Myxococcus xanthus (die heeft een generatietijd van 4-6 h). Te dien einde, M. xanthus cellen worden gekweekt op een dikke nutriënt-bevattende agar pad in een temperatuurgevoelig vochtige omgeving. Onder deze omstandigheden bepalen we de verdubbeling tijd van afzonderlijke cellen door de groei van afzonderlijke cellen op te volgen. Bovendien processen belangrijke cellulaire zoals chromosoom segregatie en celdeling image kunnen worden gemaakt door fluorescentie live-cel beeldvorming van cellen met relevante fluorescently geëtiketteerde marker eiwitten zoals mCherry-PomX, ParB-YFP en FtsZ-GFP over meerdere cel cycli. Vervolgens worden de verworven beelden verwerkt voor het genereren van montages en/of films.

Inleiding

Bacteriële cellen zijn ruimtelijk zeer georganiseerd met veel eiwitten lokaliseren asymmetrisch binnen cellulaire compartimenten^1,,^2,,^3,4. Deze lokalisatie is vaak zeer dynamisch en verandert na verloop van tijd in reactie op signalen van de celcyclus of externe signalen. Ook wordt het bacteriële chromosoom ruimtelijk zeer georganiseerd met individuele loci wordt gepositioneerd aan specifieke subcellular locaties vóór en tijdens de segregatie proces⁵. Deze dynamische ruimtelijke organisatie is belangrijk voor groei, divisie, celcyclus regelgeving, differentiatie, beweeglijkheid, signaaltransductie, alsmede chromosoom organisatie en segregatie; het beïnvloedt daarmee, in wezen alle aspecten van bacteriële functie.

De spatio dynamiek van deze cellulaire processen worden geanalyseerd in een verscheidenheid van verschillende bacteriesoorten met Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio choleraeen Caulobacter crescentus dienen zo belangrijk modelorganismen. Echter, deze vier soorten dekken slechts een klein spectrum van de enorme diversiteit van bacteriële en misschien niet verwonderlijk gezien de grote fylogenetische afstand tussen deze soorten, cellulaire mechanismen voor organisatie en polarisatie van de verschillen in deze bacteriën. Dit leidt tot de noodzaak voor het bestuderen van de extra bacteriesoorten om uiteindelijk uittreksel algemene beginselen ten grondslag liggen aan de spatio dynamiek van bacteriële cellen te kunnen.

De gram-negatieve delta-proteobacterium M. xanthus is een model-organisme in de studie van sociaal gedrag en samenwerking in bacteriën⁶. M. xanthus is een strikt aëroob en in aanwezigheid van voedingsstoffen, vormt het kolonies in die cellen naar buiten in een sterk gecoördineerde, woelen mode en prooien op andere micro-organismen^{7 verspreiden}. In reactie op de voedingsstoffen honger, initiëren cellen een ontwikkelings programma dat resulteert in de vorming van vruchtlichamen dat uit duizenden cellen, en binnen die bestaat sporenvormende staafvormige cellen differentiëren tot sferische diploïde sporen⁸. Beide soorten gedrag, dat wil zeggen, zwermen en de vorming van de fruiting body, worden alleen uitgevoerd door cellen die worden geplaatst op een harde ondergrond. Bovendien onder beide nutriënten voorwaarden deelnemen cellen aan processen die betrekking hebben op directe cel contacten met inbegrip van de uitwisseling van lipoproteins van de buitenmembraan dat kan stimuleren van de beweeglijkheid of fungeren als toxines in de ontvangende^9,10 , de uitwisseling van LPS¹¹, stimulatie van de motiliteit door exopolysaccharides op naburige cellen¹²en intercellulaire signalering door een cel oppervlak-verankerd signalering eiwitten^13,14.

Onlangs, M. xanthus geworden ook een modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de beweeglijkheid en de verordening¹⁵, celdeling^16,17,18en chromosoom organisatie^{19 2120, ,}. Kritische stappen in de M. xanthus celcyclus hebben in detail is geanalyseerd door fluorescentie microscopie gebruik van momentopname afbeeldingen of korte time-lapse opnames op spanningen uitvoering van relevante fluorescently geëtiketteerde eiwitten^{16, 17,18,19,20}. Ideaal, veel cellen moeten worden gevolgd met eencellige resolutie door fluorescentie levende cel imaging voor ten minste één volledige celcyclus te verkrijgen van robuuste kwantitatieve gegevens over de celcyclus parameters. Dit is echter een uitdaging in het geval van M. xanthus vanwege de relatief lange generatietijd van 4-6 h onder standaard laboratoriumomstandigheden en vanwege photobleaching van fluorophores en fototoxiciteit tijdens Beeldacquisitie.

Hier beschrijven we een protocol te volgen M. xanthus cellen met eencellige resolutie door fluorescentie live-cel imaging gedurende ten minste 24 uur en die betrekking hebben op verschillende cel cycli. Nog belangrijker is, tijdens het gehele protocol, cellen worden bijgehouden op een agar-pad en in nauwe contact met de contact-afhankelijke activiteiten waardoor essentieel is voor de sociale leven stijl van M. xanthus. Het protocol tevens verstrekken verbruiker voor monitor vorm, grootte, divisies en fluorescerende sondes met een hoge temporele resolutie en met eencellige resolutie, en dus, in staat stelt de kwantificering van cel naar cel variabiliteit en correlaties van de celcyclus gebeurtenissen.

Protocol

1. voorbereiding en groei van M. xanthus stammen

Opmerking: Zie tabel 1 en tabel 2.

1. Bereiden 1% casitone Bouillon (CTT) groei gemiddeld 1% (m/v) alvleesklier digest van caseïne (b.v., Bacto casitone), 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KH₂PO₄ pH 7,6, 8 mM MgSO₄²², aangevuld met kanamycine (50 µg/mL) of oxytetracycline (10 µg/mL). Voeg gentamycine (10 µg/mL) toe aan alle media om het risico van besmetting met andere bacteriën, aangezien M. xanthus cellen zijn natuurlijk bestand tegen het.
2. Inoculeer 5 mL van de 1% CTT met de relevante antibiotic(s) met een enkele vers geteelde kolonie van wilde Typ (WT) DK1622 ²³, SA4420 (ΔmglA)²⁴, SA4797 (ΔmglA, ΔpomX/P_pomZ mCherry-pomX )¹⁶, SA8241 (ΔmglA, ftsZ⁺/P_natftsZ-gfp), of SA4749 (ΔmglA, parB⁺/P_natparB-yfp) in de ochtend van dag 1.
   1. Resuspendeer een honkslag M. xanthus kolonie in 500 µL van 1% CTT aangevuld met antibiotica in een steriele buis en overdracht van de volledige schorsing naar een 50 mL conische kolf met 5 mL van de 1% CTT.
      Opmerking: Gebruik een erlenmeyer met 10 maal het volume van de cultuur om voldoende aeriation en optimale groei te garanderen.
3. De cellen groeien voor acht generaties (ongeveer 40-48 h met een generatietijd van 4-6 h) bij 32 ° C, schudden bij 220 rpm, in het donker. Handhaven van cellen in de exponentiële groeifase (OD₅₅₀ < 1.2) en te voorkomen dat het bereiken van de stationaire fase. Indien nodig, Verdun de cellen in vers 1% CTT opslagmedium met de relevante antibiotic(s) aan een OD₅₅₀ van 0,1 - 0,2.
   Opmerking: Een optimale OD₅₅₀ voor een enkele cel microscopie is 0,5 - 0,7. Bij deze OD₅₅₀is een voldoende aantal cellen per beeld dat kwantificering evenals statistische analyse van cellulaire parameters aanwezig.

2. bereiding van de monsters van de microscopie

Opmerking: Cellen worden bekeken door microscopie zijn geplaatst op een Microscoop dekglaasje aan en vervolgens bedekt door een agarose pad met voedingsstoffen. Het dekglaasje aan is gelijmd op een plastic of metalen frame te bieden mechanische ondersteuning. Ter voorbereiding van de microscopie, een grote pad van 1% agarose/TPM/0.2% CTT moet worden voorbereid zoals beschreven in stappen 2.1-2.3. Zie ook de Tabel van de materialen voor specifieke producten die hier worden gebruikt.

1. Bereiden van 500 mL buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM KH₂PO₄ pH 7,6, 8 mM MgSO₄) van de TPM en autoclaaf of filter steriliseren met behulp van het bovenste filter van een fles.
   Opmerking: De steriele buffer kan worden opgeslagen voor enkele maanden bij kamertemperatuur.
2. Bereiden van 1% agarose microscopie oplossing met 0,2% CTT (mix 1 g agarose met 80 mL TPM buffer en 20 mL voor 1% CTT medium). Verwarm in de magnetron totdat het agarose gesmolten is.
   Opmerking: De 0,2% CTT is voldoende om de cellen om te groeien en te voorkomen dat de hongerdood toestaan. Hogere concentraties van CTT in het medium van de microscopie zal resulteren in hoge achtergrond fluorescentie.
3. Vul een petrischaal met de gesmolten agarose met een dikte van 0,5 cm (voor een 11,5 x 11,5 cm vierkant petrischaal, ongeveer 60 mL gesmolten agarose vereist is) en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
   Opmerking: De agarose pad kan worden achtergelaten bij 4 ° C in een vochtige omgeving tot maximaal 2 dagen.
   1. Vooraf warm de 1% agarose/TPM/0.2% CTT pad bij 32 ° C gedurende ten minste 15 min. voorafgaand aan gebruik.
      Opmerking: De cellen om voor te bereiden microscopie, stappen 2.4-2.8.
4. Plaats een steriele glazen dekglaasje aan (60 mm x 22 mm, dikte: 0,7 mm) op een plastic of metalen frame met een gat in het midden (Figuur 1A); Dit frame fungeert als een mechanische ondersteuning voor de dunne dekglaasje aan en draagt bij aan vermindering van drift tijdens microscopie. Fix het dekglaasje aan naar het frame met tape.
   1. Ter voorbereiding van het frame, Knip een 75 mm × 25 mm frame uit een dikke metalen plaat 1 mm, knip dan uit een gepaste afmetingen gat (20 mm × 30 mm in dit experiment) in het midden.
5. Voeg 10-20 µL van exponentieel volwassen M. xanthus cellen in het dekglaasje aan.
6. Fluorescerende 0,5 µm microsferen als fiducial markeringen toevoegen aan de cellen om te vereenvoudigen tracking van cellen of eiwitten in time-lapse opnamen.
   1. Verdun de microsferen 1:100 in TPM buffer en bewaren bij 4 ° C voor tot enkele maanden. Goed schudden voor gebruik en 5-10 µL van de verdunde microsferen toe te voegen aan de cellen.
      Opmerking: Hier microsferen die zijn fluorescerende in alle gemeenschappelijke blauw, groen, geel en rood fluorescerende kanalen werden gebruikt.
7. Knip uit een kleine pad ongeveer de grootte van het dekglaasje aan van de grote voorverwarmde 1% agarose/TPM/0.2% CTT pad en plaats het op de top van de cellen (Figuur 1B). Plaats een dekglaasje aan op de top van de 1% agarose/TPM/0.2% CTT agarose pad ter voorkoming van verdamping en om de cellen in een vochtige omgeving.
   Opmerking: Het dekglaasje aan alleen zal voorkomen dat belangrijke verdamping gedurende ten minste 2 uur. Voor meer time-lapse opnamen, worden de 1% agarose/TPM/0.2% CTT stootkussen en dekglaasje aan sandwich verzegeld met paraffine film ter voorkoming van verdamping.
8. Incubeer het monster microscopie bij 32 ° C gedurende 15-20 min. te laten de cellen koppelen aan de onderkant van de agarose pad. Start de time-lapse microscopie opnames.

3. Microscoop Set-up en Time-lapse overname

Opmerking: Het protocol hier beschreven is ontwikkeld voor een omgekeerde widefield Microscoop met autofocus, een 100 X / 1.30 NB olie PH3 doelstelling, een X, Y, gemotoriseerd stadium, een sCMOS camera, een lichtbron, filters voor groen-fluorescerende, rood-fluorescerende of geel-TL eiwitten, en een temperatuur gecontroleerde incubatie kamer. Deze kamer houdt cellen beschermd tegen licht en bij constante temperatuur.

1. Verwarm de incubatie-kamer en de Microscoop tot 32 ° C gedurende ~ 1-2 uur voordat microscopie.
   Opmerking: Afhankelijk van de opbouw van de Microscoop, Verwarming kan langer duren. Voorverwarmen is essentieel om drift en stabiliseert het controlesysteem van de autofocus.
2. Zet de Microscoop en start de software van de controle van de Microscoop. Selecteer de juiste doelstelling en de juiste spiegels en filters te verwerven fase contrast beelden evenals beelden van groen-fluorescerende, rood-fluorescerende of geel-belichting fluorescerende eiwitten.
   Opmerking: Een microscoop wordt meestal geleverd met een gewenste software voor Microscoop verwerving voor controle en afbeelding. Hier werd (Zie de Tabel van materialen) een commercieel beschikbare software gebruikt voor de controle van de Microscoop en afbeelding overname.
3. Voeg een druppel olie van hoge kwaliteit onderdompeling op de lens van de doelstelling en naar de onderkant van het monster vooraf bij 32 ° c geïncubeerd Plaats de doelstelling op de laagste mogelijke Z-positie om te voorkomen beschadiging van de objectief als het monster in het werkgebied van de Microscoop is geplaatst. Plaats het metaal-frame met het monster op het podium van de Microscoop en het "gat-side" op weg naar het doel. Fast het monster stevig in de houder van de fase.
4. Focus op de cellen door het werkgebied te verplaatsen in de Z-richting dichter naar de doelstelling. Verplaatsen van het werkgebied trager als de olie druppels op de onderzijde van de steekproef en het objectief contact. De fase verplaatsen in het X / Y-richting tot meerdere afzonderlijke cellen zichtbaar zijn in de regio van weergave, wanneer cellen in het brandvlak. Zorg ervoor dat ten minste één fluorescerende microsfeer is in de regio van weergave om later de verworven afbeeldingen uitlijnen.
   Opmerking: Onder optimale omstandigheden, een celdichtheid van 15-30 cellen per regio van weergave (2048 x 2048 pixel of 133.1 x 133.1 µm) moet worden bereikt.
5. Open de wizard Multidimensionale verwerving van de besturingssoftware van de Microscoop op te zetten een tijd vervallen experiment waarmee de Microscoop te verwerven van beelden bij verschillende golflengtes en podium posities, indien nodig.
   1. In de hoofdtabel door Timelapse en Meerdere golflengteste activeren. Extra tabbladen zal aan de linkerzijde van het venster verschijnen.
   2. Klik op het tabblad Opslaan en Map selecteren om te selecteren op een lege map op de vaste schijf van de computer de verworven afbeeldingen op te slaan. Activeer de basisnaam van Increment als bestand bestaat om ervoor te zorgen dat opeenvolgende datasets niet eerdere richtlijnen overschrijven. Geef het experiment een naam met de datum en de naam van de stam of de titel van het experiment.
   3. Klik op het tabblad Timelapse de time-lapse parameters aanpassen. Duur ingesteld op 24 h en ingesteld Tijdsinterval op 20 min. Het Nummer van de punten van de tijd zal automatisch veranderen.
      Opmerking: Het optimale tijdsinterval hangt af van het experiment en de cellulaire functie om te worden geanalyseerd. Frequente afbeelding acquisities kunnen photobleaching veroorzaken. Zo moet een trade-off tussen temporele resolutie en photobleaching empirisch worden gevonden. Tegelijkertijd verdubbeling van 4-6 h, kunnen beelden worden gemakkelijk verworven met een interval van 5 minuten (of zelfs kleinere intervallen indien gewenst) voor fase contrast microscopie. Als fluorescentie microscopie in een time-loop van de 24 h is gewenst beelden opgenomen moeten worden met een tussenpoos van ongeveer 15-30 min.
   4. Klik op de golflengten tab. Selecteer het aantal golflengtes te verwerven voor elke afbeelding op elk tijdstip door het veranderen van het nummer.
      Opmerking: voor elke golflengte, een nieuw tabblad wordt weergegeven aan de linkerzijde van de multidimensionale overname " wizard en golflengten zal worden verworven in de order van boven naar beneden. Voor elke golflengte, kunnen de overname-instellingen afzonderlijk worden gewijzigd.
   5. Klik op het eerste tabblad van de golflengte vanaf de bovenkant. Selecteer fase contrast in de verlichting drop-down lijst. Selecteer 100 ms voor blootstelling en selecteer Telkens als punt in de ophaal drop-down lijst. Deactiveren Automatische bloot door nooit in de drop-down lijst te selecteren.
   6. Herhaal stap 3.5.5 voor elke golflengte die moet worden verworven op elk tijdstip. Voor de experimentele opstelling en fluorescently geëtiketteerde eiwitten beschreven hier, gebruik de volgende parameters voor blootstelling: 250 ms voor mCherry fusion eiwitten, 200 ms voor YFP fusion eiwitten en 1000 ms voor GFP fusion eiwitten.
      Opmerking: De optimale verlichting instellingen voor elke stam en fluorescerende eiwit moeten worden bepaald op voorhand door het veranderen van de intensiteit van de lamp en de afbeelding Acquisitietijd voor elke golflengte. Te lang afbeelding overname keer zal verhogen van het fototoxische effect en uiteindelijk leiden tot groei arrestatie en cel dood. Dus moet een trade-off tussen beeld kwaliteit en cel levensvatbaarheid gebeuren.
   7. Beelden van meerdere podium posities te verhogen van het aantal cellen opgenomen in hetzelfde experiment te verwerven.
      1. Activeren om te halen beelden uit meerdere podium posities, Meerdere podium posities in de hoofdtabel . Dan klik op het tabblad fase en klik op de knop Live te kijken naar het gezichtsveld.
      2. Het podium in de X/Y-richting verplaatsen, totdat een gebied van belang (ROI) in het gezichtsveld. Opslaan de X - en Y-coördinaten door te klikken op verplaatsen de "+" in de fase -tab. het podium weer in de X/Y-richting totdat er een nieuwe ROI wordt gevonden en sla de coördinaten weer door te klikken op de "+". Ga op totdat het gewenste aantal regio's wordt opgeslagen.
         Opmerking: In het geval van fluorescentie Beeldacquisitie, ervoor te zorgen dat regio's van belang (ROIs) zijn niet te dicht bij elkaar om te minimaliseren van fototoxiciteit.
6. Controleer nogmaals of de cellen in focus zijn door te klikken op de verschillende opgeslagen X - en Y-posities en de autofocus hardware starten door te klikken van AFC houden de opgeslagen Z-positie om constant te houden in de loop van het experiment.
7. Start de time-lapse opnames in de software van de controle van de Microscoop door Acquire in de wizard Multidimensionale overname te klikken.
   Opmerking: Één venster verschijnt voor elke golflengte die wordt verworven en een extra venster verschijnt waarin het aantal verworven tijdstippen en de tijd tot de volgende foto-overname.
8. Controleer of de cellen nog steeds in beeld na de eerste paar keer-points in de time-lapse opnames om te maximaliseren van de kwaliteit van de beelden en heroriënteren zijn indien nodig.

4. generatie van Time-lapse films en uitlijning van afbeelding

Opmerking: De verschillende commerciële en vrij beschikbare softwarepakketten zijn beschikbaar voor Beeldacquisitie en beeldanalyse. We gebruiken een commercieel beschikbare software (Zie de Tabel van materialen) met meerdere vooraf geïnstalleerde plug-ins en extra's.

1. De individuele beelden behoeden voor time-lapse opnamen op een computer waarop de afbeelding analyse/verwerking software is geïnstalleerd.
2. Start de software en open de afbeeldingen als een stapel door te klikken op Review multidimensionale gegevens | Selecteer basis bestand | Selecteer map. Open de map met de multidimensionale gegevens. Controleer de dataset en klik op View; de dataset wordt getoond als enkelvoudige opnamen vanaf moment dat tot het einde punt. Activeren van de golflengte (voor het maken van een stapel), selecteert u alle afbeeldingen die moeten worden in de stack en klik op Load afbeelding(en). Herhaal deze stap voor alle golflengten en sla ingevulde stapels.
3. (Optioneel) Alle afbeeldingen die zijn vereist voor de film met behulp van bestand openen | Open.
   Opmerking: Het is aangeraden moet u afbeeldingen openen door één verworven golflengte tegelijkertijd niet de computer vertragen als rekenkracht beperkt is. Als bepaalde delen van de time-lapse opnames, bijvoorbeeld, het begin, het einde of verschillende tijdstippen moeten worden overgeslagen, kan dan dit worden aangepast in de voltooide film.
4. Activeer de stack van beelden die moeten worden gecorrigeerd voor drift. Openen van het hulpmiddel van de uitlijning door Apps | Auto uitlijnen... selectievakje Stack als bron voor de beelden en het vliegtuig/eerst punt als het referentievlak. Selecteer de stapel met de bron stapel -knop en klik op toepassen.
   Opmerking: De automatische uitlijning duurt enige tijd en rekenkracht, maar is een goede manier om te corrigeren grote stacks voor drift van de Microscoop set-up. Deze automatische aanpassing werkt goed als microsferen opgenomen worden, maar ook zou kunnen zonder hen werken.
5. Sla de uitgelijnde stack.
6. Gebruik ROIs.
   Opmerking: TL time-lapse microscopie gemakkelijk maakt grote sets van gegevensbestanden die nemen veel rekenkracht in beslag en vertragen de downstream processing van deze films. Daarom raden wij isoleren cellen werken met kleinere bestanden te identificeren ROIs.
   1. Selecteer het gereedschap Rechthoekig gebied . Maak een ROI rond de cellen van belang door handmatig een ROI puttend uit de fase contrast-afbeelding. Zorg ervoor dat de cellen van belang zichtbaar en aandacht gedurende de hele time-lapse film zijn.
   2. Open de time-lapse film voor de tweede golflengte van de dezelfde dataset. De ROI van de fase contrast foto's overbrengen naar de fluorescentie beelden van de tweede golflengte hulpprogramma Overdracht regio's met regio's | Overdracht van de regio's. Selecteer de fase contrast dataset Bronafbeelding als de tweede golflengte dataset als de Doelafbeelding. Selecteer Alle regio's en druk op OK.
   3. Herhaal stap 4.6.2 voor elke golflengte verworven voor de dezelfde dataset.
   4. Selecteer de ROI en dupliceren als een stapel met bewerken | Dupliceren | Stapel... of druk op Shift + Ctrl + D toetsen. Sla de dubbele stack met bestand | Opslaan in dezelfde map als de oorspronkelijke gegevens.
   5. Herhaal stap 4.6.4 voor elke ROI van elke golflengte verworven voor de dezelfde dataset
7. Voor het genereren van een film in MOV- of AVI-indeling, opent de Film maken functie via Stack | Film maken. Selecteer de time-lapse opnames met de knop Bron Stack . Selecteer het outputformaat, de framesnelheid het aantal frames en klikt u op Opslaan.

Resultaten

M. xanthus is een traag groeiende bacterie die op vaste oppervlakken beweegt. Om te testen onze experimentele opstelling, wij uitgevoerd een time-lapse experiment met motile DK1622 WT cellen. Fase contrast beelden werden verkregen met tussenpozen van 5 minuten gedurende 24 uur (Figuur 2A, B). De meerderheid van de cellen uitgelijnd in groepen. Zoals verwacht, cellen weergegeven van de motiliteit en overwegend verhuisde in groepen. We hebben verder vastgesteld die cellen af en toe verlegd richting van de beweging. Deze bevindingen stellen voor dat de WT cellen onder de geteste voorwaarden zich normaal in termen van de beweeglijkheid van de cel gedragen. Toch, zelfs wanneer de cellen zijn vastgelegd om 5 min, de identificatie van afzonderlijke cellen is moeilijk. Bovendien, omdat cellen sporenvormende zijn, veel cellen ontsnappen of voer het gezichtsveld waardoor het moeilijk is te volgen van cellen voor langere perioden.

Om te traceren hetzelfde M. xanthus cellen voor verschillende rondes van de celcyclus door live-cel imaging, afzonderlijke stammen kunnen worden verwijderd voor het mglA -gen, die essentieel is voor de beweeglijkheid van²⁵. Hiermee voorkomt u dat cellen uit het gezichtsveld bewegen tijdens het imaging protocol. In-frame verwijderingen worden gegenereerd, zoals beschreven door Shi et al. ²⁶

Zoals verwacht, in fase contrast live-cel beeldbewerking met niet-sporenvormende ΔmglA cellen (Figuur 3), heeft actieve beweging niet weergegeven in cellen. We konden de groei en de verdeling van afzonderlijke cellen tijdens microcolony vorming volgen. Gebaseerd op de time-lapse opnames waarin beelden werden verkregen met tussenpozen van 5 minuten gedurende 24 uur, bleek het mogelijk te kwantificeren van de interdivision tijd (de tijd tussen twee celdeling gebeurtenissen) met één cel resolutie. Cellen van de ΔmglA mutant had een tijd van de Inter division van 235 ± 50 min (n = 97 cellen). Met ongeveer 4 uur is de interdivision tijd vergelijkbaar met de verdubbeling tijd gemeten in schorsing culturen voor WT cellen. Dit geeft bewijs dat M. xanthus cellen groeien optimaal onder deze experimentele omstandigheden.

Om te onderzoeken of onze set-up cellen toestaat groeien normaal terwijl het bijhouden van YFP-label eiwitten over lange perioden, we uitgevoerd fluorescentie time-lapse imaging met M. xanthus cellen die uitdrukking geven aan een eiwit YFP-gelabeld. Te dien einde, we gevolgd ParB-YFP als een marker voor de oorsprong van de replicatie (ori). ParB is als onderdeel van het systeem van de ParABS in M. xanthus en bindt aan de parS sites proximale aan de ori; Daarom kunnen de oorsprong duplicatie en chromosoom segregatie gevolgd^19,20,21. Met image acquisitie (fase contrast en fluorescentie, 200 ms acquisitietijd in YFP kanaal) iedere 20 min, cellen groeide, verdeeld en groei zelfs bij 24 h (Figuur 4A) weergegeven. Aan het begin van de opnamen, ParB-YFP gevormd twee clusters in de subpolar provincies in de meerderheid van de cellen (Figuur 4A). Kort voor of na de celdeling cluster de subpolar ParB-YFP op de oude cel paal gedupliceerd. Één van de twee clusters bleef op de oude cel paal terwijl de tweede kopie translocated naar de nieuwe cel pool, haar definitieve subpolar standpunt bereiken na ongeveer 40-60 min (Figuur 4A, B). Deze opmerkingen zijn in overeenstemming met eerdere gegevens gegenereerd op basis van korte time-lapse opnamen met behulp van dunne agar pads¹⁹. We concluderen dat dit experimentele opstelling fluorescentie time-lapse microscopie chromosoom segregatie bijhouden over verschillende cel cycli kunt in de langzaam groeiende M. xanthus cellen, zonder storende celgroei of het chromosoom segregatie machines.

In een soortgelijk experiment, dat wij willen volgen markeringen voor celdeling door time-lapse fluorescentie microscopie. Vergelijkbaar met bijna alle andere bacteriën, M. xanthus FtsZ, een bacteriële tubuline-achtige GTPase, vereist voor celdeling^16,17,18. FtsZ vormt een ring-achtige structuur op midcell, de zogenaamde Z-ring, die helpt bij het werven van alle andere eiwitten die nodig zijn voor de celdeling^27,28. In M. xanthus, de vorming van de Z-ring en de positionering op midcell wordt gestimuleerd door de drie PomXYZ eiwitten^16,17. Deze drie eiwitten vormen een chromosoom-geassocieerde complex dat de overdracht over de nucleoïde van de site van de afdeling van de cel in de cel "moeder" naar het midden van de nucleoïde in de twee dochtercellen. Het midden van de nucleoïde samenvalt met midcell, voordat het chromosoom segregatie, en hier de PomXYZ complexe rekruten FtsZ en stimuleert vorming van Z-ring.

Hier, we eerst niet-sporenvormende cellen uiten van ftsZ-gfpgevolgd. Omdat FtsZ-GFP algemene toont een zwakkere fluorescentie signaal dan ParB-YFP, we de belichtingstijd 5-voudig verhoogd naar 1 s in het GFP-kanaal. Zoals verwacht, sterke accumulatie van FtsZ-GFP alleen werd waargenomen bij midcell en deze lokalisatie dicteerde de positie van de celdeling vernauwing (Figuur 5A). Een cluster FtsZ-GFP voornamelijk gevormd in midcell in langere cel. Het was ook duidelijk dat dit cluster in intensiteit na verloop van tijd toegenomen. Na de celdeling vastgesteld we hebben dat FtsZ-GFP opnieuw opgebouwd op midcell in de twee dochter cellen ongeveer 2 uur later (Figuur 5B). Dit komt overeen met de vaststelling dat ongeveer 50% van de cellen in een populatie FtsZ lokalisatie tijdens midcell op basis van de analyse van de momentopname^{16,17 weergegeven}.

We hebben gevolgd in een tweede experiment, niet-sporenvormende ΔmglA cellen voor 24 h, die uitdrukking geven aan mCherry-pomX. Als onderdeel van het PomXYZ-systeem helpt PomX bij het begeleiden van Z-ring vorming en positionering, waardoor het stimuleren van celdeling op midcell¹⁶. Het signaal van de fluorescentie van mCherry-PomX is sterk en kan een belichtingstijd in het kanaal van de fluorescentie van 250 ms. nog belangrijker is, alle cellen groeide in grootte en een celdeling gebeurtenis weergegeven in de loop van het experiment, vormen van microcolonies na 24 h ( Figuur 6A). Als eerder gemeld¹⁶bevatte bijna alle cellen een cluster van mCherry-PomX. De meerderheid van deze gelokaliseerd op midcell en clusters van midcell translocated te midcell in de loop van het experiment. Tijdens celdelingen, mCherry-PomX clusters speelden, met elke cel van de dochter een cluster ontvangen. In tegenstelling tot FtsZ-GFP, mCherry-PomX gelokaliseerd op midcell 80-90% van de celcyclus en dit standpunt spoedig na de celdeling (Figuur 6B) bereikt.

Figuur 1 : Schematische van de experimentele opstelling in deze studie gebruikt. (A) A metaal of kunststof frame fungeert als een ondersteuning voor het monster. Een dekglaasje aan is met tape om de beweging van het monster op het metalen frame bevestigd. (B) kant bekijken van de experimentele monster set-up. Cellen zijn gemonteerd op het dekglaasje aan weergegeven in (A). De agarose pad dat voedingsstoffen en vocht aan de cellen levert wordt geplaatst op de top van de cellen. De agarose pad wordt gedekt door een extra dekglaasje aan om verdamping. Voor afbeeldingen van hoge kwaliteit, wordt een 100 X olie-immersie fase contrast-doelstelling gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Fase contrast time-lapse microscopie van WT M. xanthus cellen. Cellen werden gevolgd gedurende 24 uur en afbeeldingen werden verworven elke 5 min. (A) representatieve beelden van het hetzelfde gezichtsveld elke 5 minuten staan. Gekleurde pijlen geven aan directionaliteit verkeer van afzonderlijke cellen. Dezelfde kleur markeert dezelfde cel na verloop van tijd. Aantallen wijzen op tijd in minuten. Schaal bar: 5 µm. (B) beelden van het hetzelfde gezichtsveld na elk uur staan. Merk op dat het hetzelfde gezichtsveld wordt weergegeven maar omdat cellen, cellen voortdurend zijn binnenvaren en verlaten van het gezichtsveld. Aantallen wijzen op tijd in uren. Schaal bar: 5 µm. PH: fase contrast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Fase contrast time-lapse microscopie van niet-sporenvormende M. xanthus cellen. ΔmglA cellen werden gevolgd voor 24 h. beelden werden verkregen elke 5 min en representatieve beelden na elk uur worden getoond. Geselecteerde celdeling beperkingen zijn gemarkeerd met oranje pijlen. Aantallen wijzen op tijd in uren. PH: fase contrast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Fluorescentie time-lapse microscopie van ParB-YFP in niet-sporenvormende M. xanthus cellen. Cellen van een ΔmglA mutantwaarin parB-yfp in aanwezigheid van inheemse parB (SA4749; ΔmglA; parB ⁺/P_natparB-yfp) gedurende 24 uur werden gevolgd door de fase contrast- en fluorescentie microscopie. (A) beelden werden verworven iedere 20 min en vertegenwoordiger afbeeldingen elk uur tot 10u worden weergegeven, samen met dezelfde cellen na 24 h. beelden worden getoond in fase contrast (PH) en als overlay van fase contrast en de YFP signaal. Geselecteerde celdelingen zijn gemarkeerd met oranje pijlen. Witte en groene pijlen geven aan ParB-YFP dubbel clustergebeurtenissen, met de groene pijlen markering van de translocating cluster. Aantallen wijzen op tijd in uren. Schaal bar: 5 µm. (B) beelden werden verworven in (A) maar worden weergegeven met hogere temporele resolutie. Aantallen wijzen op tijd in minuten. Pijlen zijn zoals in (A). Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : De time-lapse microscopie van de fluorescentie van FtsZ-GFP in niet-sporenvormende M. xanthus cellen. Cellen van een ΔmglA mutant ftsZ-gfp uiten in aanwezigheid van inheemse ftsZ (SA8241; ΔmglA; ftsZ ⁺/P_natftsZ-gfp) gedurende 24 uur werden gevolgd door de fase contrast- en fluorescentie microscopie. (A) beelden werden verworven iedere 20 min en representatieve beelden elk uur tot 10 uur worden getoond, samen met dezelfde cellen na 24 h. beelden worden getoond in fase contrast (PH) en als bedekking van fase contrast en GFP signaal. Geselecteerde celdelingen zijn gemarkeerd met oranje pijlen. Witte pijlen geven aan FtsZ-GFP clusters op midcell. Aantallen wijzen op tijd in uren. Schaal bar: 5 µm. (B) beelden werden verworven in (A) maar worden weergegeven met hogere temporele resolutie. Aantallen wijzen op tijd in minuten. Groene en witte pijlen mark FtsZ-GFP clusters in de linker- en cellen, respectievelijk. Oranje pijlen geven aan celdelingen. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Fluorescentie time-lapse microscopie van mCherry-PomX in niet-sporenvormende M. xanthus cellen. Niet-sporenvormende ΔpomX cellen accumulatie van mCherry-PomX (SA4797; ΔmglAΔpomX/P_pomZ mCherry-pomX) werden gevolgd gedurende 24 uur door fase contrast en fluorescentie microscopie elke 20 min. (A) representatieve beelden elk uur tot 10 uur worden getoond, samen met dezelfde cellen na 24 h. beelden worden getoond in fase contrast (PH) en als overlay van fase contrast en mCherry signaal. Geselecteerde celdelingen zijn gemarkeerd met oranje pijlen. Witte en groene pijlen geven aan mCherry-PomX clusters vóór en na de splitsing van gebeurtenissen, respectievelijk. Aantallen wijzen op tijd in uren. Schaal bar: 5 µm. (B) beelden werden verworven in (A) en op hogere temporele resolutie te zien zijn. Pijlen zijn zoals in (A). Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Bacteriële stam	Relevante genotype1	Referentie
DK1622	Wildtype	23
SA4420	ΔmglA	24
SA4749	ΔmglA; parB+/attB:: PnatparB-yfp (pAH7)	Deze studie
SA4797	ΔmglA; ΔpomX / attB::PpomZ mCherry-pomX (pAH53)	16
SA8241	ΔmglA; ftsZ+/ mxan18-19::PnatftsZ-gfp (pDS150)	Deze studie
Plasmiden haakjes bevatten aangegeven gene fusies en werden intergated op de aangegeven locaties in het genoom. Plasmiden geïntegreerd op de site van de attB of de mxan18-19 -intergenic-regio waren uitgedrukt uit hun oorspronkelijke promotor (Pnat) of de oorspronkelijke promotor van pomZ (PpomZ).

Tabel 1: Lijst van bacteriestammen gebruikt in deze studie.

Plasmiden	Relevante kenmerken	Referentie
pAH7	PnatparB-yfp; Mx8 attP; TetR	19
pAH53	PpomZ mCherry-pomX; Mx8 attP ; KmR	16
pDS150 1	PnatftsZ-gfp ; mxan18-19 ; TetR	Deze studie
pMR3691	Plasmide voor vanillate afleidbare genexpressie	18
pKA51	PnatftsZ-gfp ; Mx8 attP; TetR	17
1 pDS150: pDS150 is een derivaat van pKA51 waarin de Mx8 attP site werd vervangen door de intergenic regio mxan18-19 . Hiervoor werd de mxan18-19 intergenic regio versterkt uit pMR3691 met inleidingen Mxan18-19 fwd BsdRI (GCGATCATTGCGCGCCAGACGATAACAGGC) en Mxan18-19 rev BlpI (GCGGCTGAGCCCGCGCCGACAACCGCAACC) en gekloonde in pKA51.

Tabel 2: Lijst van plasmiden gebruikt in deze studie.

Discussie

Fluorescentie live-cel imaging is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de spatio dynamiek van bacteriecellen geworden. Time-lapse fluorescentie microscopie van motile en traag groeiende bacteriën zoals M. xanthus, echter, is uitdagend en alleen voor korte tijdsduur werd uitgevoerd. Hier presenteren we een easy-to-use en robuuste methode voor beeldvorming van de bijzondere live-cel M. xanthus door time-lapse fluorescentie microscopie. Deze methode kan de gebruiker cellen en fluorescently geëtiketteerde eiwitten voor verschillende rondes van de celcyclus met eencellige resolutie te volgen.

Er zijn verschillende vereisten die invloed hebben op het succes van de live-cel beeldvorming van het langzaam groeiende M. xanthus cellen met inbegrip van: 1) een stevige ondergrond voor de bevestiging van de cel; 2) de beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstof; 3) constante vochtigheid en temperatuur; en 4) het optimaliseren van de experimentele omstandigheden zoals blootstelling tijd en afbeelding overname frequentie.

We gebruiken in onze experimentele opstelling, dikke agarose pads aangevuld met voedingsstoffen. Het gebruik van dikke agarose pads in tegenstelling tot microfluidic apparaten te volgen van afzonderlijke cellen heeft enkele fundamentele voordelen maar ook enkele nadelen. Ten eerste, de agarose pad niet alleen voorziet in een oppervlak voor M. xanthus cel bijlage en beweging, maar ook voldoende voedingsstoffen voor groei gedurende ten minste 24 uur. Ten tweede, snap shot analyses gebruikt bij het bestuderen van intracellulaire lokalisatie van fluorescently geëtiketteerde eiwitten werd voorheen gedaan op het zelfde type van agarose pads^16,17,29. Daarom kan gegevens uit module shot analyses rechtstreeks worden vergeleken met de gegevens die zijn verkregen met de hier beschreven methode. Ten derde, agarose pads kunnen gemakkelijk worden gewijzigd en aangevuld met antibiotica of andere supplementen zoals CuSO₄ en vanillate die worden vaak gebruikt voor gen expressie inductie^18,30. Ten slotte, omdat cellen formulier microcolonies in de loop van een experiment mogen, deze set-up maakt het ook mogelijk het bestuderen van het effect van directe cel interacties op de specifieke parameter wordt geanalyseerd. Dit aspect is met name belangrijk in het geval van M. xanthus omdat deze bacterie verschillende contact-afhankelijke interacties bevat. Het belangrijkste nadeel van deze methode is dat de experimentele omstandigheden zijn voorgeprogrammeerd voor de duur van een experiment. Microfluidic apparaten toestaan daarentegen over het algemeen de experimentele omstandigheden veranderen in de loop van een experiment door bijvoorbeeld antibiotica³¹toe te voegen.

Vrije Softwarepakketten (bijvoorbeeld, MicrobeJ, Oufti) zijn beschikbaar voor de groei van afzonderlijke cellen en eiwit localisatie binnen afzonderlijke cellen automatisch te analyseren. Deze software zijn echter alleen geschikt voor de analyse van afzonderlijke cellen of kleine groepen van cellen. Zo blijft het een uitdaging om automatisch het analyseren van de gegevens die zijn gegenereerd voor de opnames van de 24 h hier beschreven.

Kortom, we een easy-to-use en reproduceerbare protocol standaardinteracties live-cel beeldbewerking met traag groeiende beschreven M. xanthus bacteriën. We laten zien dat eenvoudige nutriënt-aangevuld agarose pads volstaan om groei gedurende ten minste 24 uur en observeren en analyseren van eiwitten lokalisatie en groei met eencellige resolutie gedurende enkele generaties mogelijk te maken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMI6000B met AFC	Leica microsystems	11888945	Geautomatiseerde geïnverteerde breedveldfluorescentiemicroscoop met adaptieve focusregeling
Universeel montageframe	Leica microsystems	11532338	Stagehouder voor verschillende monstersgroottes
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 olie PH3	Leica microsystems	11506197	Phasecontrastobjectief
Orca Flash 4.0 camera	Hamamatsu	11532952	4,0 megapixel sCMOS-camera voor beeldverwerving
Filterset TXR ET, k	Leica microsystems	11504170	Fluorescentiefilterset, Ex: 560/40 Em: 645/75
Filterset L5 ET, k	Leica microsystems	11504166	Fluorescentiefilterset, Ex: 480/40 Em: 527/30
Filterset YFP ET, k	Leica microsystems	11504165	Fluorescentiefilterset, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Prior	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Microscoopautomatiseringscontroller met interactief controlecentrum
EL 6000 lichtbron	Leica microsystems	11504115	Externe fluorescentielichtbron
Incubator BLX Black	Pecon	11532830	Zwarte incubatiekamer rond het microscoop
Tempcontrol 37-2 digitaal	Leica microsystems	11521719	Geautomatiseerde temperatuurregeling voor incubatiekamer
Gentmycinsulfaat	Carl Roth	0233.4	Gentamicine
Oxytetracylin dihydraat	Sigma Aldrich	201-212-8	Oxytetracycline
Kanamycinsulfaat	Carl Roth	T832.3	Kanamycine
Filtropur BT25 0.2 flesdopfilter	Sarstedt	831,822,101	Flesdopfilter voor sterilisatie van buffers
Deckgläser	VWR	630-1592	Glazen dekglas (60 x 22 mm, dikte: 0,7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Agarose voor microscoopglaasjes
Leica Metamorph AF	Leica microsystems	11640901	Microscoopbesturingssoftware en software voor beeldanalyse
Tetraspeck Microsperen, 0,5 µm	ThermoFisher	T7281	Fluorescente microspheren
Petrischaal	Greiner Bio-one	688102	120 mm x 120 mm x 17 mm vierkante petrischaal voor agarose pads
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casiton
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan	Carl Roth	AE15.2	Tris
Magnesiumsulfaat heptahydraat	Carl Roth	P027.2	Magnesiumsulfaat
Kaliumdiwaterstoffosfaat p.a.	Carl Roth	3904.1	Kaliumdiwaterstoffosfaat
1% CTT medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM kaliumfosfaatbuffer pH 7,6, 8 mM MgSO4			Kweekmedium voor M.xanthus
TPM-buffer: 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM kaliumfosfaatbuffer pH 7,6, 8 mM MgSO4			Buffer voor het bereiden van microscoopglaasjes voor M.xanthus