Dit witboek beschrijft een gedetailleerde en zeer effectieve protocol voor één sensillum opnamen van de sensilla basiconica op de ook voor insecten monddelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Enkele Sensillum opnames voor Locust Palp Sensilla Basiconica
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ook van locust monddelen worden beschouwd als conventionele smaak organen die een belangrijke rol in het een sprinkhaan voedsel selectie, met name voor de opsporing van niet-vluchtig chemische signalen via sensilla chaetica spelen (voorheen genaamd terminal sensilla of crested sensilla). Er is nu een groeiende hoeveelheid bewijs dat deze ook ook een olfactorische functie hebben. Een odorant receptor (LmigOR2) en een odorant-bindend-proteïne (LmigOBP1) hebben vertaald in de neuronen en accessoire cellen, respectievelijk, in de basiconica van de sensilla van het ook. Enkele sensillum opname (SSR) wordt gebruikt voor het vastleggen van de antwoorden van odorant receptor neuronen, die is een effectieve methode voor het screenen van actieve liganden op specifieke odorant receptoren. SSR is in functionele onderzoeken van odorant receptoren in palp sensilla gebruikt. De structuur van de basiconica van de sensilla gelegen op de koepel van de ook verschilt enigszins van de structuur van die op de antennes. Dus, bij het uitvoeren van een SSR ontlokte door reukstoffen, sommige specifieke advies nuttig kan zijn voor het verkrijgen van optimale resultaten. In deze paper wordt een gedetailleerde en zeer effectieve protocol voor een SSR van insecten palp sensilla basiconica geïntroduceerd.
Inleiding
Dieren zijn een aantal aanwezig organen die exogene chemische signalen zin geëvolueerd. Bij insecten zijn de belangrijkste aanwezig organen de antennes en de ook. Op deze organen, zijn verschillende soorten aanwezig haren, genaamd chemosensorische sensilla, geïnnerveerd door aanwezig neuronen (CSNs) binnen de haren. CSNs in chemosensorische sensilla herkennen specifieke chemische signalen via signaaltransductie van chemische prikkels aan elektrische potentiaal die vervolgens worden overgedragen aan de centrale zenuwstelsel1,2,3 .
CSNs express verschillende aanwezig receptoren [bijvoorbeeldodorant receptoren (ORs)], ionotropic receptoren (IRs), en de smaak receptoren (GRs) op hun membranen, die coderen van exogene chemische signalen die is gekoppeld aan verschillende soorten chemosensation 4,5,6. De karakterisering van CSNs is de sleutel tot het ontrafelen van cellulaire en moleculaire mechanismen van insecten chemoreceptie. Nu één sensillum opname (SSR) is een veel gebruikte techniek voor de karakterisering van insect CSNs in de antennal sensilla van vele insecten, waaronder vliegt7, vlinders en8, kevers, bladluizen10,9, sprinkhanen11, en mieren12. Echter weinig studies hebben toegepast een SSR op insecten ook13,14,15,16,17, omdat de bijzondere structuur van hun sensilla maken een elektrofysiologische opname moeilijk18.
Zwermen sprinkhanen (Orthoptera) veroorzaken vaak ernstige gewas schade en economisch verlies19. De ook worden verondersteld een belangrijke rol spelen in de voedsel-selectie van treksprinkhanen20,21,22,23,24. Twee soorten aanwezig sensilla worden onderzocht door een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Meestal, worden 350 sensilla chaetica en 7-8 sensilla basiconica waargenomen op elke koepel van de Sint-jansbrood ook18. Sensilla chaetica zijn smaak sensilla die zin niet-vluchtig chemische signalen, terwijl sensilla basiconica hebben een olfactorische functie, sensing vluchtige chemische signalen.
Op Sint-jansbrood ook, de diameter van de haar voeten van de sensilla basiconica (ca. 12 µm), zijn veel groter dan die van sensilla chaetica (ca. 8 µm)18,25. De cuticular muur van de basiconica van de sensilla op de ook is veel dikker dan die van antennal sensilla18. Daarnaast heeft de koepel van de palp vloeibare inhoud binnen een flexibele schubbenlaag. Deze eigenschappen betekenen dat een penetratie met een micro-elektrode en een overname van goede elektrofysiologische signalen moeilijker dan voor antennal sensilla is. In deze paper wordt een gedetailleerde en zeer effectieve SSR protocol voor locust palp sensilla basiconica gepresenteerd met een video.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding van instrumenten en Insect
-
Voorbereiding van wolfraam elektroden en stimuli oplossingen
- Los van een nieuwe draad van de wolfraam (diameter van 0,125 mm, lengte 75 mm) in een micromanipulator en het verscherpen in een 10% (m/v) natrium nitriet (NaNO2) oplossing in een injectiespuit op 10 V geboden door een voeding voor ongeveer 1 minuut onder een stereomicroscoop (40 X vergroting).
- Dompel de aangescherpte wolfraam draad herhaaldelijk in de 10% NaNO2 -oplossing, ongeveer 4 mm bij 5 V in < 1 min (figuur 1A).
- De diameter van het uiteinde van de aangescherpte wolfraam vaak onder de stereomicroscoop onderzoeken totdat is het fijn genoeg is om doordringen van de epidermis van een sprinkhaan palp olfactorische sensillum (figuur 1B).
- De stimulans oplossingen voor te bereiden. Elk van de stimulans van de chemische stof in minerale olie verdunnen. Verdunnen 1-nonanol en nonanoic zuur op 10% verdunnen. Verdun E-2-hexenal en hexanal op 10-2, 10-3, 10-4en 10-5.
- Bereiden van Pasteur buizen die de prikkels: invoegen filtreerpapier strips (lengte van 2 cm, breedte van 0,5 cm) in de Pasteur-buizen, de stimulans van de verdunde oplossingen (elke 10 µl) toevoegen aan de filtreerpapier strips en sluit vervolgens de Pasteur buizen met tips van de Pipet (1 ml).
-
Voorbereiden van het insect
- Achterste sprinkhanen (Locusta migratoria) met verse tarwe zaailingen onder drukke omstandigheden bij een relatieve vochtigheid van 60%, een temperatuur van 28-30 ° C en een fotoperiode van 18:6 h (licht: donker). Kies 1 - tot 3-dagen oude 5th instar locust nimfen en verwijder de antennes met fijne schaar elke om storing te voorkomen bij het opnemen.
-
Voorbereiding van de houder van de maxillaire palp locust
- Een glasplaatje (25 x 75 mm) gebruiken als de basis van de maxillaire palp houder (MPH). Een plastic stuk (1 mm hoog, 10 mm breed, 35 mm lang) hechten aan een hoek van het glasplaatje met dubbelzijdig plakband, en ten slotte bevestigen een cover-glas (18 mm x 18 mm) op de top van het plastic stuk met dubbelzijdig plakband. Plaats een klein stukje rode rubber tape op het glas van de cover als een antislip-laag. Het plastic stuk en het glas cover vormen het platform voor de palp van het Sint-jansbrood. De hoogte van het platform is ongeveer 1,5 mm.
- Installeren van een wolfraam draad (diameter van 0,125 mm, lengte van 36 mm) op een afstand van 1,5 mm parallel aan de binnenkant rand van het platform. Het herstellen van de twee uiteinden van de draad op het platform met dubbelzijdig plakband.
2. voorbereiding van de maxillaire ook Locust
- Een centrifugebuis (1,5 ml) verticaal in tweeën gesneden en de onderkant afgesneden. Plaats de sprinkhaan in de bereid buis. Laat de ventrale regio en het hoofd van de sprinkhaan blootgesteld. Herstellen van de vergadering aan het glasplaatje met dubbelzijdig plakband (figuur 2A).
- Trek de juiste maxillaire palp op het platform.
- Zet de wolfraam-draad op het vierde segment van de palp. Plaats lijm putty aan weerskanten van de draad van wolfraam, ongeveer 2 mm van de maxillaire palp (figuur 2A en 2B).
3. interne Sensillum opnames
- Plaats de locust maxillaire palp voorbereiding onder een microscoop bij een lage vergroting (100 X). Pas de positie van de voorbereiding tot de palp loodrecht op de opname-elektrode (figuur 3A is).
- De referentie-elektrode (wolfraam elektrode) invoegen in het oog van de sprinkhaan met behulp van een micromanipulator. Verplaats de opname-elektrode (wolfraam elektrode) dicht bij de maxillaire palp met de micromanipulator (figuur 3B en 3 C).
- Stel het geur-levering-apparaat tot ongeveer 1 cm van de maxillaire palp (figuur 3B).
- Open de opnamesoftware Auto Spike 32. Stel de opnameparameters als volgt: de schaal van de opname op 500 µV; de hoge cutoff van het filter op 300 Hz, de lage cutoff op 200 Hz; en de pretrigger op 10 s.
- De opname-elektrode verbinden met een 10 x universele AC/DC versterker.
- De Microscoop overschakelen naar een hoge vergroting (500 X). De opname-elektrode in de basis van een basiconic sensillum op de maxillaire palp invoegen en tactvol aanpassen van de opname-elektrode voor goede spontane spikes (figuur 3D).
- Open de controller van de stimulans om te leveren van een continue luchtstroom bij 20 ml/s. de stimulatie tijd ingesteld op 1 s. Record signalen voor 10 s, vanaf 10 s vóór het intreden van de stimulus-pols.
- Gebruik maken van een 10 x universele AC/DC versterker aan het versterken van de signalen. De signalen worden meegenomen bij de IDAC 4. Analyseer de signalen met de software van de Auto Spike 32. AC signalen zijn band pass gefilterd tussen 200 tot 300 Hz. Gebruik Auto Spike 32 om te onderscheiden van de piek-tot-trog amplitudes van geluiden. Berekening van de antwoorden van de neuronen als de stijgingen van de actiepotentiaal frequenties (spikes per seconde) de spontane frequenties. Een statistische analyse met behulp van GraphPad prisma 7 uitvoeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Twee sensilla-subtypen (pb1 en pb2) op de locust maxillaire palp worden geïdentificeerd op basis van verschillende reactie dynamiek aan chemische odorant (10% 1-nonanol en 10% nonanoic zuur). De neuronen in pb1 produceren aanzienlijk meer spikes aan 1-nonanol dan nonanoic zuur terwijl de neuronen in pb2 zijn aanzienlijk dat minder geactiveerd door 1-nonanol in vergelijking met nonanoic zuur (Figuur 4). Hexanal en E-2-Hexenal kan roepen een sprinkhaan palp rea...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Insecten vertrouwen op ook te detecteren geuren van voedsel, en hun ook worden verondersteld een belangrijke rol spelen in soortvorming13,27. De ook zijn eenvoudige olfactorische organen en krijgen steeds meer aandacht als een aantrekkelijk model voor het onderzoek van de neuromolecular onderliggende chemosensation28 netwerken.
Insect labellar en palp SSRs zijn met succes uitgevoerd op de Drosophila melanoga...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (No.31472037). Elke vermelding van handelsnamen of commerciële producten in dit artikel wordt uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Wolfraamdraad | ADVENT | W559504 | Gebruikt voor het maken van de elektrode en het bevestigen van de palp |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | Gebruikt voor het slijpen van de wolfraamdraad |
| Wisselstroomvoeding | Syntech | A2-70 | Biedt de spanning bij het slijpen van de wolfraamdraad |
| Stereoscoop | Motic | SMZ-163 | Gebruikt voor het observeren van het slijpen van wolfraamdraad |
| Microscoop | Olympus | W-51 | Gebruikt voor het observeren van de sensilla op de maxillaire palp van de sprinkhaan |
| Intelligente data-acquisitiecontroller | Syntech | IDAC-4 | Realtime weergave op het scherm van alle signalen voor en tijdens het opnemen |
| Stimuluscontroller | Syntech | CS-55 | Gebruikt voor het regelen van de stimulustoepassing |
| Elektronische micromanipulator | C.M.D.T | CFT-8301D | Gebruikt voor kleine bewegingen van de opname-elektrode |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Gebruikt voor kleine bewegingen van de referentie-elektrode |
| Luidspreker | EDIFIER | R101T06 | Verbonden met IDAC-4 en levert geluid voor het signaal |
| Magneetbasis | PDOK | PD-101 | Gebruikt om de elektrode en de stimulusleveringsbuis vast te houden |
| Vibratie-isolatietafel | TianHe | HAP-100-1208 | Gebruikt voor het isoleren van de vibratie van de apparatuur |
| Glazen plaat | CITOGLAS | ZBP-407 | Gebruikt voor het maken van de basis voor de MPH |
| Blu-tack | Bostik | Blu-tack-45g | Bevestigen van de wolfraamdraad |
| Pasteurbuis | YARE | WITEG | Plaatsen van het filterpapier met stimulistimulusoplossingen |
Referenties
- Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 12987-12995 (2011).
- Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
- Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136 (1), 149-162 (2009).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
- Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7585-7589 (1987).
- Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47 (9), 1065-1076 (2001).
- Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27 (1), 55-61 (2017).
- Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77 (2), 45-57 (2011).
- Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12 (8), 1261-1271 (2015).
- de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19 (11), 4520-4532 (1999).
- Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32 (8), 727-738 (2007).
- Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725(2010).
- Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177 (4), 389-396 (1995).
- Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184 (3), 397-409 (1977).
- Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
- Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
- Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
- Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
- Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
- Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
- Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35 (1), 47-56 (2006).
- Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13 (6), 759-771 (2017).
- Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925(2016).
- Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355(2014).
- Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147(2017).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489(2011).
- Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139(2013).
- Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337(2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
