Methodenartikel
De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.
Een werkgroep gestart binnen de Franse Cytometry Association (AFC) werd ontwikkeld om het harmoniseren van de toepassing van multiparameter stroom cytometry (MFC) voor myeloïde ziekte diagnose in Frankrijk. Het hier gepresenteerde protocol was overeengekomen en toegepaste tussen September 2013 en November 2015 in zes Franse diagnostische laboratoria (universitaire ziekenhuizen van Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, en Lille en Institut Paoli-Calmettes in Marseille) en de standaardisatie van het beenmerg monster voorbereiding en gegevens overname toegestaan. Drie rijping databases werden ontwikkeld voor neutrofiele, monocytic, en erythroid lineages met beenmerg van "gezonde" donor personen (individuen zonder enig bewijs van een hematopoietische ziekte). Een robuuste analysemethode voor elke myeloïde lineage moet gelden voor routinematige diagnostische gebruik. Nieuwe gevallen kunnen worden op dezelfde manier geanalyseerd en vergeleken met de gebruikelijke databases. Dus, kwantitatieve en kwalitatieve fenotypische afwijkingen kunnen worden geïdentificeerd en personen boven 2SD vergeleken met gegevens van normale beenmerg monsters moeten worden beschouwd als indicatieve van pathologie. De belangrijkste beperking is de hogere variabiliteit tussen de gegevens die zijn bereikt met de monoklonale antilichamen verkregen met de methoden op basis van hybridoma technologieën en momenteel gebruikt in de klinische diagnose. Vaststelling van de criteria voor de technische validering van de verkregen gegevens kan helpen verbeteren van het nut van MFC voor MDS diagnostiek. De vaststelling van deze criteria vereist analyse tegen een database. De vermindering van de onderzoeker subjectiviteit in data-analyse is een belangrijk voordeel van deze methode.
Bij gebrek aan fenotypische markeringen specifiek voor de dysplastische veranderingen in myeloïde cellen tijdens de initiatie van de MDS en progressie, is een nieuwe aanpak voorgesteld in de afgelopen jaren op basis van de evaluatie van de rijping trajecten (gewijzigde uitdrukking van myeloïde antigenen tijdens de productie van volwassen myeloïde cellen) of van de abnormale verdeling van de verschillende soorten cellen in het beenmerg (BM) cel compartimenten1,2.
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor gestandaardiseerde toepassing van MFC oog op de opsporing van dysplastische veranderingen in BM myeloïde cel compartimenten betrekking hebben op myelodysplastisch syndromen (MDS) of andere myeloïde hematologische ziekten. Deze studie toont ook het nut van het gebruik van rijping databases voor MFC data-analyse.
Standaardisatie van de voorbereiding voorbeeldprocedure, data-acquisitie en analyse met behulp van de databases zou de identificatie van de meest relevante fenotypische afwijkingen die verband houden met dysplastische veranderingen in BM myeloïde cellen. Daarom zijn statistisch geselecteerde deelverzamelingen gebaseerd op goed gelabeld en goed erkende formaten (automatische bevolking scheidingsteken (APS) diagrammen, histogrammen, en dot plots) vereist voor de ontwikkeling van een analyse-strategie die kan worden gebruikt in latere analyse rondes. De ontdekking van robuuste fenotypische afwijkingen in MDS zou verlichten de diagnose in gevallen met of zonder minimale morfologische dysplasie en zonder cytogenetische aberrancies. Identificatie van discriminerende parameters rekening houdend met de vermindering van de immunophenotypic panelen kan vereenvoudigen de huidige scores2, toe te staan hun toepasbaarheid in de laboratoria van de klinische pathologie.
Deze methode beperkt de subjectieve interpretaties van cytometry gegevens, zoals in MDS diagnose3hebben zijn gesignaleerd. Deze stap is een voorwaarde voor de ontwikkeling van de geautomatiseerde hulpmiddelen voor het verwerken en analyseren van stroom gegevens4.
MDS bestaat uit een heterogene groep van aandoeningen van de klonen hematopoietische stamcellen (HSC) waarin het spliceosoom mutaties met specifieke epigenetische modifiers werken opleveren van het fenotype van de MDS. Het is nu bekend dat, samen met HSC mutaties, andere mechanismen zijn betrokken bij MDS pathofysiologie, zoals abnormale immuun-gemedieerde ontsteking en interacties tussen kwaadaardige HSCs en de stromale communicatie van de BM. Deze mechanismen blijven echter slecht begrepen. De brede klinische en biologische heterogeniteit van MDS maakt de diagnose en de selectie van de optimale therapie een uitdaging. In het laatste decennium, in meerdere studies hebben aangetoond dat MFC vaak meer is gevoelig voor het opsporen van dysplasie2 dan morfologie, maar technische en economische beperkingen deze techniek moeilijk maken om te standaardiseren, met resultaten vaak afhankelijk van de ervaring van de tolk3. Bovendien, is het onduidelijk hoe MFC de balans naar MDS in gevallen met of zonder minimale morfologische dysplasie en bij gebrek aan cytogenetische afwijkingen of in grensgevallen zoals hypocellular MDS, met een lage blast tellen, kan tip van andere niet-klonen BM stoornissen zoals beenmerg mislukking (dwz., aplastic bloedarmoede). Ook blijft het moeilijk om te onderscheiden grensgevallen van MDS met een overmaat van ontploffingen van acute myeloïde leukemie (AML). Om al deze redenen opnemen de klinische richtsnoeren niet MFC testen in de uiteindelijke diagnose van MDS. In 2011, heeft de Amerikaanse nationale uitgebreide kanker netwerk (NCCN) voor de schatting van het percentage CD34 + cellen, detectie van paroxismale nachtelijke hemoglobinurie klonen en aanwezigheid van cytotoxische T-cel-klonen in hypocellular MDS5MFC aanbevolen. Deze twee laatste gevallen ook betrekking hebben op een therapeutisch doel omdat klinische gegevens hebben aangetoond een goede reactie van deze patiënten op immunosuppressieve therapie6. De 2017 NCCN richtsnoeren, onder vermelding van de aanbevelingen van de International Working Group (IWG) vermeld afwijkende immunophenotyping detectie door MFC behoort tot de co criteria voor de diagnose van de MDS, maar zonder eventuele specificaties6. Bovendien, bepaalt de onlangs gepubliceerde WHO-indeling dat MFC bevindingen alleen volstaan niet om een primaire diagnose van MDS bij gebrek aan afdoende morfologische en/of cytogenetische gegevens7. MFC kan echter worden gebruikt als een aanvullende proef tonen de disregulatie van myeloïde cel rijping patronen en kwantificeren van de "afstand van normale" voor een patiënt op een bepaald tijdstip in de loop van de ziekte.
Deze methode is van toepassing op klinische laboratoria ook geïnteresseerd in de evaluatie van dysplasie in BM myeloïde cellen met behulp van MFC immunophenotyping, ter verfijning van de diagnose in MDS of andere myeloïde aandoeningen met dysplastische afwijkingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Het onderstaande protocol is goedgekeurd door het "Comité de bescherming des Personnes" (onafhankelijk ethisch comité) Sud-Est 1 from University Hospital van Saint-Etienne, Frankrijk.
1. Cytometer instellingen
Opmerking: De cytometer-instellingen werden uitgevoerd volgens Frankrijk stroom aanbevelingen, EuroFlow procedure "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) voor Instrument Setup en compensatie (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
2. BM monstervoorbereiding
Opmerking: De cel wassen protocol net vóór de kleuring procedure uitvoeren
3. data-acquisitie
4. de gegevensanalyse
Opmerking: Voor de bouw van de normale BM databases gebruikte bestanden van gezonde donoren en van personen zonder enig bewijs voor een hematopoietische ziekte als volgt werden 11 van 18 bestanden voor de Neutrophils_NM database, 10 uit 18 bestanden voor Monocytes_NM database en 14 van 18 bestanden voor NRC_NM database. De bestanden verwijderd toonde van verschillende technische problemen, zoals beschreven in de sectie vertegenwoordiger resultaten. De bestanden zijn afzonderlijk geanalyseerd met behulp van de Infinicyt software (Tabel of Materials), die voldoen aan de verschillende strategieën afgebeeld in figuur 1A(1-3) voor neutrofiele afkomst (profiel Neutrophils_Maturation.inp), Figuur 2 A voor monocyt afkomst (profiel Monocytes_Maturation.inp), en Figuur 3A(1-2) voor erythroid cel afkomst (profiel NRC_Maturation.inp).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De 54 BM monsters in K-EDTA antistollingsmiddel geoogst werden opgenomen in de studie. De MFC-gegevens werden geanalyseerd in het ontbreken van informatie over de patiënten. Retrospectieve studie toonde aan dat de BM monsters van 7 gezonde donoren (5 mannetjes en 2 vrouwtjes met een gemiddelde leeftijd van 47.4 [35-48], 11 personen met geen bewijs van een hematopoietische ziekte (8 reutjes en 3 teefjes met een gemiddelde leeftijd van 57,9 [35-72]) en 36 gevallen met verschillende waren p...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De kwaliteit van BM aspirate kan gevolgen hebben voor de eindresultaten. De hemodilution van de BM-aspirate kan de verdeling van de cellen in verschillende stadia van rijping te wijten aan de afwezigheid van de progenitoren of precursoren cellen verstoren. Waarschijnlijk een bulk lysing methode in dienst kan helpen bij de normalisering van BM aangeblazen voor hemodilution in stroom cytometrische analyses. Daarnaast zijn de kritische stappen voor de evaluatie van BM myeloïde dysplasie van stroom cytometry de monster verwe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. De Flow-Cytometry Afdeling Hematologie Laboratory van de Universiteit ziekenhuis van Saint-Etienne is een lid van EuroFlow Consortium.
De antilichamen die gebruikt in deze studie werden verstrekt door BD Biosciences. De auteurs bedank hun collega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, van het Department of Molecular Biology, laboratorium hematologie, Universiteit ziekenhuis van Saint-Etienne (Frankrijk), die deskundigheid voor interpretatie voor NGS data voor de tweede MDS geval. De auteurs zijn dankbaar voor de clinicus Haematogen voor hun belangstelling en betrokkenheid in deze studie en voor de patiënten en gezonde donoren voor hun toestemming om deel te nemen in deze studie. De auteurs ook bedank de "Les Amis de Rémi" Stichting voor financiële steun voor publicatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuratie, Details over filters en spiegels: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | lage snelheid centrifuges; capaciteit 60 FACS buizen |
| Pipetten van 10µL en 200µL | |||
| Pasteur pipetten | |||
| 15 mL Falcon buizen | |||
| polypropyleen buis voor FACS | |||
| Muis Anti-Menselijke HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Muis BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Muis IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Muis BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Muis BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Muis BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Muis BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Muis BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Muis Anti-Menselijke CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Muis BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Muis IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Muis BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Muis BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Muis BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Muis IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Muis BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Muis Anti-Menselijke CD33 | 345800 | clone P67.6 Muis BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) | |
| Muis Anti-Menselijke CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Muis BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versies 6.1.2 en 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Fosfaat gebufferde zouttabletten | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen