Method Article

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

DOI:

10.3791/57883

⸱

June 2nd, 2018

 ,  , 
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren multiplexed targeting van versterkers met de deactivering fusieproteïne SID4X-dCas9-KRAB, ook bekend als enhancer interferentie (Enhancer-i). Dit protocol stelt de identificatie van versterkers die regelen van genexpressie en vergemakkelijkt de dissectie van de relaties tussen de versterkers van regulering van een gemeenschappelijk doel-gen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerdere versterkers reguleren vaak een bepaald gen, maar voor de meeste genen, blijft het onduidelijk welke versterkers zijn nodig voor de expressie van genen, en hoe deze versterkers combineren om te produceren een transcriptionele reactie. Zoals miljoenen van versterkers zijn geïdentificeerd, zijn high-throughput hulpmiddelen nodig voor het bepalen van de versterker functie op de schaal van een genoom-brede. Huidige methoden voor het bestuderen van de versterker functie omvatten genetische verwijderingen met behulp van de nuclease-bedreven Cas9 maken, maar het is moeilijk te bestuderen van de combinatorische effecten van meerdere versterkers met behulp van deze techniek, zoals meerdere opeenvolgende klonale cellijnen moeten worden gegenereerd. Hier presenteren we Enhancer-i, een CRISPR storing gebaseerde methode waarmee voor functionele ondervraging van meerdere versterkers gelijktijdig op hun endogene loci. Versterker-i maakt gebruik van twee repressieve domeinen gesmolten tot nuclease-deficiënte Cas9, SID en KRAB, om enhancer deactivering via Histon deacetylation op gerichte loci. Dit protocol maakt gebruik van voorbijgaande transfectie van gids RNAs om voorbijgaande inactivatie van de beoogde regio's en is met name effectief op het weren van afleidbare transcriptionele reacties op stimuli in weefselkweek instellingen. Versterker-i is zeer specifiek, zowel in de genomische gericht op en de gevolgen voor mondiale genexpressie. De resultaten van dit protocol helpen te begrijpen of een versterker draagt bij tot de genexpressie, de omvang van de bijdrage, en hoe de bijdrage wordt beïnvloed door andere nabijgelegen versterkers.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grootschalige projecten zoals ENCODE1en routekaart Epigenomics2FANTOM sequencing3 hebben miljoenen van vermeende versterkers binnen het menselijk genoom geïdentificeerd over honderden celtypes. Geschat wordt dat elke promotor met een gemiddelde van 4,9 versterkers koppelt en elke enhancer contact op met een gemiddelde van 2,4 genen3, suggereert dat genexpressie vaak het resultaat van de integratie van meerdere gedistribueerde regelgevende interacties is. Een belangrijke resterende uitdaging is om te definiëren hoe afzonderlijke versterkers van niet alleen bijdragen tot genexpressie, maar hoe ze combineren om invloed op de expressie. Genetische benaderingen worden algemeen gebruikt als aanduiding van de relaties tussen versterkers in modelorganismen van Drosophila4 tot en met5van de muizen. Deze experimenten zijn echter tijdrovend en lage-doorvoer voor de studie van meerdere versterkers op meerdere genen.

Een benadering voor het bestuderen van de versterker functie op grote schaal houdt massaal parallelle verslaggever testen. Deze tests zijn voorzien van de gelijktijdige screening van duizenden van de opeenvolgingen van DNA om hun vermogen om de uitdrukking van een reporter gene6rijden. Terwijl deze tests is gebleken dat DNA-sequentie alleen voldoende zijn kan om overbrengen van gene verordening informatie7, komen ze met het voorbehoud van wordt uitgevoerd buiten de context van de inheemse chromatine en met een heteroloog promotor. Bovendien, is de grootte van de DNA-sequentie wordt geanalyseerd in massively parallel verslaggever testen meestal minder dan 200 basepairs, waarin relevante omliggende volgorde kunnen uitsluiten. Nog belangrijker is, als verslaggever testen alleen de activiteit van één opeenvolging tegelijk meten, doen ze niet rekening houden met de complexe relaties die tussen de versterkers optreden kunnen. Dus, hoewel massaal parallelle verslaggever testen kunnen informatief over de intrinsieke activiteit van een DNA-sequentie, ze doen niet per se mee te delen van de functie van dat DNA-sequentie in het kader van het genoom.

Onlangs hebben ontwikkelde CRISPR/Cas9 tools8 vergemakkelijkt de studie van genregulatie zoals zij toestaan voor de verwijdering van versterkers op de endogene locus. Echter tegelijkertijd verwijderen van meerdere versterkers kan leiden tot instabiliteit van het genoom, en het is tijdrovend voor het genereren van opeenvolgende enhancer verwijderingen in de lijn van een enkele cel. Bovendien, nieuwe genomic volgorde wordt gemaakt op de site van de verwijdering na reparatie, en deze reeks kan winnen regulerende functie. Een alternatieve versie van Cas9 is speciaal ontwikkeld voor modulerende genexpressie, vertrouwen op fusies van9,10 te activeren of onderdrukken van11,12 domeinen aan de nuclease-deficiënte formulier van Cas9 (dCas9). Deze fusie-eiwitten zijn ideaal voor het bestuderen van meerdere loci gelijktijdig als ze niet fysiek de opeenvolging van DNA veranderen, en in plaats daarvan het moduleren van epigenetica om het ondervragen van een regelgevende regio. De meest gebruikte repressieve fusie is KRAB, die het KAP1 mede onderdrukker complex werft, bevordering van de afzetting van de repressie-geassocieerde Histon H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, ook bekend als CRISPR interferentie14, is gebruikt om afzonderlijke versterkers van target en scherm voor hun bijdragen aan gen expressie15,16; echter, het is niet geoptimaliseerd voor het targeten van meerdere regio's tegelijkertijd. Één versie van multiplex CRISPR interferentie voor enhancers, mozaïek-seq17, eencellige RNA-seq gebruikt als een uitlezing, maar deze technologie is duur en enkel geschikt voor de studie van zeer uitgesproken genen vanwege de lage gevoeligheid van één cel RNA-seq.

We gestreefd naar de ontwikkeling van een CRISPR storing gebaseerde methode voor het ontleden van combinatoriële enhancer functie in het kader van een transcriptionele reactie op oestrogeen. Ongeveer de helft van de oestrogeen-responsief genen bevatten 2 of meer versterkers gebonden door de oestrogeen receptor-alpha (ER) in de buurt van18, suggereren dat meerdere versterkers kunnen worden deel te aan de oestrogeen-reactie nemen, en begrijpen dat de regelgevende logica zou vereisen gelijktijdig meerdere versterkers gericht op. Zoals de aanvankelijke studies met behulp van CRISPR-interferentie bij initiatiefnemers voorgesteld dat niet alle initiatiefnemers even reageren op KRAB-gemedieerde repressie19 zijn, redeneerde we dat de toevoeging van een afzonderlijke repressieve domein dCas9 het deactiveren van vergemakkelijken kan de versterkers van het divers. We kozen de Sin3a interactie domein van Mad1 (SID)20 omdat het leidt tot de aanwerving van Histon deacetylases21, waarvan verwijderen acetylgroepen op histonen die geassocieerd met een transcriptionele activiteit worden. Nog belangrijker is, het domein-SID was effectief in het verminderen van genexpressie wanneer gesmolten dCas922 te verhalen23, en Sin3a heeft aangetoond dat een krachtige repressieve co-factor in een verscheidenheid van contexten24van de volgorde van de versterker. We SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) gebruikt om te richten van 10 verschillende versterkers gebonden aan de ER, en ER bandplaatsen (ERBS) die nodig voor de oestrogeen transcriptionele reactie op 4 genen18 zijnidentificeren. Wij ook de combinaties van versterkers te identificeren van de sites die in de productie van het oestrogeen transcriptionele antwoord samenwerken gericht. We vonden dat maximaal 50 sites kan mogelijk worden gericht gelijktijdig met detecteerbare gen expressie veranderingen. Met behulp van ChIP-seq en RNA-seq, we laten zien dat Enhancer-i een zeer specifieke techniek is voor het bestuderen van meerdere versterkers gelijktijdig.

In dit protocol beschrijven we de stappen betrokken bij het uitvoeren van Enhancer-i, een flexibele techniek waarmee de functionele studie van meerdere versterkers gelijktijdig in de instelling van een weefselkweek. Versterker-i is sterk gecorreleerd met genetische schrappen maar biedt tijdelijke deactivering die afhankelijk is van Histon deacetylases (HDACs). Door het leveren van gids RNAs via voorbijgaande transfectie in tegenstelling tot stabiele integratie via virale vectoren, vermijdt dit protocol afzetting en potentiële verspreiding van H3K9me3. Dit protocol details gids RNA ontwerp en klonen via assemblage van Gibson, de transfectie van gids RNAs met behulp van lipofection en de analyse van de resulterende genexpressie verandert door qPCR. Wij omvatten ook de methoden voor de evaluatie van de specificiteit van de Enhancer-i gericht op op het niveau van het genoom en de transcriptome. Hoewel deze techniek werd ontwikkeld om te bestuderen Genregulering door ER gebonden versterkers in menselijke kanker cellijnen, is van toepassing op de dissectie van alle zoogdieren versterker.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. generatie van cel lijnen stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB

Opmerking: De transfectie voorwaarden en concentraties van de drug die hier gepresenteerd zijn geoptimaliseerd voor Ishikawa cellen, een cellijn van endometriumkanker, geteeld in RPMI 1640 media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine (volledige RPMI). Andere cellijnen kunnen vereisen verschillende transfectie voorwaarden en concentraties van de drug. Gebruikers kunnen ook voorbijgaande transfectie experimenten uitvoeren in wild-type cellen, in plaats van het genereren van een stabiele cellijn, met een plasmide uiting van SID4X-dCas9-KRAB samen met gids RNA uiting van plasmiden; resultaten van voorbijgaande transfections kunnen echter moeilijk het reproduceren van SID4X-dCas9-KRAB niveaus variëren door transfectie.

  1. Plaat Ishikawa cellen in ten minste 2 putjes van de plaat van een 6-well aan 30-50% samenvloeiing (ongeveer 300.000 Ishikawa cellen) in 3 mL van volledige RPMI.
    1. De media van de cellen gecombineerd. Wassen van de cellen een keer met 1 x PBS (pH 7.4). De PBS gecombineerd en trypsine (4 mL voor een schotel van 10 cm of 5 mL voor een T-75 kolf) toe te voegen.
    2. Incubeer de cellen gedurende ~ 5 minuten bij 37 ° C, controleren elke 2 min voor vrijstaande cellen en voorzichtig schudden het vaartuig.
    3. Zodra de cellen hebben losgemaakt, Pipetteer trypsinized cellen boven en beneden een paar keer, en pipet zachtjes langs de zijkant van het schip om alle gekoppelde cellen vrij te geven.
    4. De cellen overbrengen in een conische tube van 15 mL en de cellen naar beneden draaien voor 5 min op 250 x g.
    5. De trypsine gecombineerd en resuspendeer de cellen in 5-10 mL van de media. Gebruik een pipet P1000 te distantiëren van cel bosjes indien nodig.
    6. Cellen tellen, en bepalen het volume nodig om de plaat ~ 300.000 cellen per putje in een totaal volume van 3 mL. De cellen toevoegen aan 2 aparte putjes van de plaat van een 6-well. Vul elk goed tot 3 mL met volledige RPMI.
    7. Zachtjes schud de plaat elke 5 min in de eerste 15 min na beplating om ervoor te zorgen dat de cellen zijn gelijkmatig verdeeld op de plaat. Gebruik een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen uit het midden van de put hebben verspreid.
  2. Binnen de 24u van plating, voeren de volgende transfections met behulp van een passende transfectiereagens voor de cellijn van belang. Voor Ishikawa cellen, gebruikt u de procedure zoals hieronder beschreven.
    Nota: Dit protocol veronderstelt het gebruik van kationische liposoom gebaseerde transfectie reagentia. Electroporation biedt een alternatieve methode voor celtypes die zijn zeer gevoelig voor deze reagentia of die vertonen lage transfectie efficiëntie met lipofection. Transfectie voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor de cellijn van belang vóór probeert Enhancer-i experimenten.
    1. In een 1,7 mL Eppendorf buis, Verdun 2,5 μg van SID4X-dCas9-KRAB plasmide en 800 ng van plasmide uiting van een fluorescente proteïne in serumvrij media zodanig dat het uiteindelijke volume in de buis 155 µL is en de uiteindelijke concentratie van plasmide 0.020 µg/µL is.
    2. In een andere buis, verdunde 3.3 µg van een plasmide die bevat geen een neomycine weerstand cassette, zoals pCMV-GFP, in serumvrij media zodanig is dat het uiteindelijke volume in de buis 155 µL en de uiteindelijke concentratie van plasmide is 0.020 µg/µL.
    3. Vortex elk tube kort en spin down met behulp van een microfuge.
    4. Voeg 9.9 µL van het transfectiereagens (Tabel van materialen) aan elke buis. Meng door vortexing kort bij een lage snelheid. Draai de buizen naar beneden met een microfuge.
    5. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur voor minstens 5 min, maar niet meer dan 20 min.
    6. Voeg 150 µL van het mengsel bereid DNA: reagens ontkleuring aan één putje op de plaat 6-well in het biosafety kabinet. Herhaal deze stappen voor de andere buis voor bereid DNA: reagens mix. Meng de platen door voorzichtig te zwenken en de plaat terug te keren naar de incubator.
  3. Op dag 2 post transfectie, wijzigen van de media en aan te vullen met G418 om een eindconcentratie van 600 ng/μL. Deze concentratie moet worden geoptimaliseerd voor het celtype.
  4. Volledige RPMI media wijzigen en aan te vullen met G418 om de andere dag voor 2-4 weken totdat de controle transfected cellen dood zijn en de putjes met SID4X-dCas9-KRAB confluente worden. De exacte hoeveelheid tijd die nodig is voor de cellen te herstellen zal afhangen van de verdubbeling tijd van de cellen.
  5. Wanneer de cellen worden confluente, overgang naar een T-25 of T-75 schip in RPMI compleet met een lagere dosis van G418 (300 ng/μL voor Ishikawa cellen). Tijdens deze passage maken 2 aliquots van ~ 100.000 cellen elke (ongeveer 1/10th van een 6-well-plate) in 2 aparte 1,7 mL Eppendorf buizen voor isolatie van RNA en DNA, respectievelijk. Draai deze buizen naar beneden (5 min, x 250gr), trypsine verwijderen door pipetteren en bevriezen van de buizen bij-20 ° C voor toekomstig gebruik.
  6. Isoleer genomic DNA met behulp van commercieel beschikbare kits en uitvoeren van PCR met behulp van de "pAC95_PCR" of "SID4X_PCR" inleidingen (tabel 1) om te controleren of de aanwezigheid van de fusieproteïne binnen in de cellijn. Genomic DNA geëxtraheerd uit de ouderlijke lijn als een negatieve controle, en SID4x-dCas9-KRAB plasmide DNA gebruiken als positieve controle. Een master mengeling van HiFi-polymerase met 50-100 ng van genomic DNA en de volgende fietsen voorwaarden gebruiken: 98 ° C gedurende 30 s, 25 cycli van (98 ° C gedurende 10 s, 58 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 2 minuten), 72 ° C gedurende 5 minuten , houden bij 4 ° C.
  7. Uitvoeren om te controleren of de expressie van het fusie-eiwit op het niveau van RNA, qPCR met RNA gehaald uit de cellijn met behulp van commercieel beschikbare kits. Gebruik de "dCas9_qPCR" inleidingen (tabel 1), en het protocol van de qPCR één stap in stap 6.3 van dit protocol.
  8. Uitvoeren om te controleren of de expressie van de eiwit-niveau van de fusie, een westelijke vlek op lysates uit de cellijn. Gebruik Dizzee RASCAL of anti-HA antilichamen om de fusie proteïne te ontdekken.

2. gids RNA Design

Opmerking: Dit protocol is ontworpen voor gebruik met de U6 gids RNA klonen vector gecreëerd door de kerk lab en beschikbaar op Addgene (Addgene 41824). Voor het maken van een versie van deze vector met puromycin weerstand die mag voor dezelfde klonen strategie als 41824, verruilt we de meerdere klonen site deze vector in de vector pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin (Addgene 51133). Addgene 41824 of onze versie met puromycin (Addgene 106404) zijn compatibel met de klonen strategie zoals hieronder beschreven.

  1. Verkrijgen van 600-900 basepairs van DNA-sequentie voor elk regelgevend gebied van belang. Transcriptie factor bandplaatsen en/of chromatine Toegankelijkheid gebruiken voor aanwijzingen over waar te definiëren van de regio van belang (figuur 2A).
    Opmerking: Terwijl het voorbeeld in figuur 2A de versterkers van de upstream- en downstream beschikt, het is ook mogelijk te richten regelgevende elementen introns bevinden.
  2. Plaats alle reeksen in een enkel tekstbestand met behulp van de indeling FASTA verkregen.
  3. Identificeren van ten minste één negatieve controle-regio die niet naar verwachting zal veranderen in de experimentele omstandigheden, zoals een promotor van een gen dat niet wordt uitgedrukt in de cellijn van belang. Aanvragen van DNA-sequentie voor deze regio en toevoegen naar de tekstbestand in FASTA formaat.
    Opmerking: We gebruiken gids RNAs gericht op de IL1RN promotor25 als een negatieve controle voor alle regio's die wij richten. Gebruikers kunnen ook selecteren op intergenic volgorde in de buurt van de regio van belang dat geen transcriptie factor bandplaatsen als negatieve controle. Echter als meerdere loci gelijktijdig gericht worden, vereenvoudigt een enkele negatieve controle regio proefopzet en interpretatie van resultaten. Als de gerichte enhancer intronic is, is het wellicht nuttig te richten een intronic gebied op de zelfde locus die geen een vermeende regelgevende element als een extra negatieve controle, als de dCas9-fusion bevat met de transcriptie interfereren kan.
  4. Identificeren van positieve controle gebieden, zoals de initiatiefnemers die de vermeende doelstellingen van de regelgevende gebieden van belang zijn, of de initiatiefnemers van genen die zeer worden overgezet in de cellijn van belang. Aanvragen van DNA-sequentie voor deze regio's en toevoegen naar de tekstbestand in FASTA formaat.
  5. Gebruik een programma zoals e-scherpe26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) op de DNA-sequenties gegenereerd vind je gids RNAs met lage af-doelen (idealiter 0-3). Gids RNAs bestaan uit 20 nucleotiden stroomopwaarts van een protospacer aangrenzende motief (PAM), waarin het formulier "NGG" voor de dCas9 van S. pyogenes.
    1. Op de website van e-crisp, selecteer het organisme van belang met behulp van het drop-down menu. De genoom-vergadering verschijnt rechts van de soortnaam.
    2. Selecteer het keuzerondje Input is FASTA opeenvolging . De FASTA sequenties van bovenaf kopiëren en plakken in het dialoogvenster. Ervoor zorgen dat de kop van een FASTA opgenomen voor elke sequentie.
      Opmerking: Maximaal 50 sequenties kunnen worden opgevraagd gelijktijdig.
    3. Selecteer het Medium radio knop en enkele grafische vorm geldt in het drop-down menu.
    4. Klik op de knop Start sgRNA zoeken. Een nieuw tabblad wordt geopend, en de resultaten worden weergegeven. De kandidaat-sequenties downloaden door te klikken op de knop downloaden van een rapport in tabelvorm Excel opgemaakt voor alle query reeksen samen.
    5. Open het rapport in tabelvorm met behulp van Excel of een tekstverwerkingsprogramma.
  6. Gebruik de UCSC genome browser aan BLAT kandidaat full-length gRNA sequenties (23 basepairs) aan het genoom.
    1. In een browser, ga naar de UCSC genome browser website (http://genome.ucsc.edu). Zoek het woord BLAT onder de sectie onze toolsen tikken daarop. De BLAT Search Tool wordt geopend.
    2. Gebruik de drop-down menu's bevindt zich onder de tekst BLAT Zoek genoom te selecteren van de vergadering van het organisme en genoom van belang.
    3. De gids RNA-sequenties van het rapport in tabelvorm gegenereerd door e-scherpe kopiëren en plakken in het dialoogvenster. Ervoor zorgen dat elke sequentie een unieke FASTA header heeft, klikt u op verzenden onder aan het dialoogvenster.
      Opmerking: Maximaal 25 sequenties kunnen worden onderzocht in een keer. Op de pagina Zoekresultaten BLAT wordt uitlijning van elke gids sequentie van het RNA weergegeven, waarbij voor elke lijn vertegenwoordigt een uitlijning. In het ideale geval moet er één uitlijning voor elke gids RNA, met vermelding van de uniciteit van die gids RNA.
    4. De gidsen die zijn afgestemd op meerdere locaties in het genoom indien mogelijk te vermijden.
    5. Om te controleren gids RNA lokalisatie en distributie binnen de regio van belang, klik op de link van de Browser onder de sectie acties voor een van de RNAs opgevraagde gids. De genoom-Browser zal verschijnen en zal worden gecentreerd op het geselecteerde hulplijn RNA. Gebruik de Zoom uit knoppen aan de bovenkant van de pagina te visualiseren van de verdeling van andere gids RNAs geïdentificeerd door e-scherpe binnen de regio van belang.
  7. Selecteer 4 bij voorkeur niet-overlappende gids RNA-sequenties die zijn verspreid over de regio van belang (figuur 2B). Als de regio van belang groter is dan 600 bp, overwegen het toevoegen van 1-2 extra gidsen. Vermijd gids RNAs met homopolymeric rek en extreme GC inhoud, omdat deze functies kunnen een belemmering vormen voor de gids-RNA klonen proces en verminderen gids RNA gericht op efficiëntie.
  8. Zodra de gidsen hebben geselecteerd is, maak een bestand met de volledige gids opeenvolging van RNA (23 nucleotiden) voor elke gewenste gids, en verwijder de nucleotide 5' evenals de PAM (NGG) uit de 3'-eind. Deze stap vergemakkelijkt oligo bestellen.
  9. De volgende reeks toevoegen aan het einde 5' van de oligonucleotide volgorde: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
  10. De volgende reeks toevoegen aan de 3' einde van de reeks van oligonucleotide: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    Opmerking: De uiteindelijke volgorde moet 59 nucleotiden lang en kijk net als dit: GTGGAAAGGACGAAACACCG-target (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
  11. Zorg ervoor dat elk regelgevend element te worden gericht met de Enhancer-i ten minste 4 unieke oligonucleotides ontworpen voor het. Bestel deze sequenties samen met de "U6_internal" inleidingen vermeld in tabel 1.

3. gids RNA klonen

Opmerking: Gids RNA klonen via Gibson vergadering heeft bewezen zeer efficiënt in onze handen, honderden kolonies per plaat, met weinig of geen koloniën aanwezig in de enige vectorbestrijding oplevert. Dergelijke efficiëntie is essentieel voor het handhaven van complexiteit tijdens de gepoolde klonen. Een ander voordeel van Gibson vergadering klonen is dat gebruikers niet hoeft te maken over de aanwezigheid van een restrictie-enzym gesneden site in de handleiding RNA ze proberen in te voegen in de U6 klonen vector. Niettemin, dit protocol kan worden aangepast voor traditionele restrictie-enzym gebaseerd klonen indien gewenst.

  1. Reconstrueren gids RNA oligos op een eindconcentratie van 100 μM in ultrazuiver water (RNase-gratis, DNase-gratis). Er moet ten minste 4 aparte gids RNA oligos voor elk gebied van belang.
  2. Maak voor elke regelgevende regio van belang, een pool van alle oligos die overeenkomt met de regio van belang. Combineren in een buis Eppendorf, 5 μL van elke individuele gereconstitueerde gids RNA oligo voor elke regio. Meng het zwembad goed door vortexing, 1 μL haal hem eruit en Verdun deze aliquoot 1:200 in ultrazuiver water.
    Opmerking: Indien gewenst, deze zwembaden gericht op individuele regelgevende gebieden kunnen worden verdere gecombineerd voor het genereren van een complexe pool targeting op meerdere gebieden. Tot 50 regelgevende gebieden kunnen het doelwit gelijktijdig in een enkele pool (Figuur 3 c).
  3. Voer een korte PCR met de U6 inleidingen om te koppelen homologie regio's aan de oligos voorafgaand aan de vergadering van de Gibson. Ongeveer 40 grondslagen zullen worden toegevoegd aan elke oligo, opbrengst een ~ 100 bp product dat bevat voldoende homologie naar de U6 vector aan beide uiteinden.
    1. Voor elke gids RNA zwembad, instellen van een 20 μL PCR met een hifi-polymerase master mix en de volgende onderdelen: 1 μL van verdunde oligo zwembad vanaf stap 3.2, 1 μL van U6 voorwaartse primer (10 μM), 1 μL van U6 reverse primer (10 μM) , en water van maximaal 20 μL.
    2. Incubeer in een thermische cycler met de volgende voorwaarden: 98 ° C gedurende 30 s, 10 cycli van (98 ° C gedurende 10 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 2 minuten), 72 ° C gedurende 5 minuten, en houd bij 4 ° C.
    3. Voer 5 μL van de reactie op een 1-2% agarose gel met een laag molecuulgewicht ladder. Het eindproduct moet ~ 100 basepairs (figuur 2C).
    4. Opruimen van de reactie van de uitbreiding met een kolom gebaseerde DNA zuivering kit, en elueer in 20 μL van elutie buffer geleverd in de kit.
      Opmerking: Als het product kort is, Vermijd het gebruik van de kraal gebaseerde schoon-ups, die zijn ontworpen om uit te sluiten van kleine fragmenten kleiner is dan 100 bp.
    5. Kwantificeren van de gezuiverde DNA met een Fluorimeter of spectrofotometer (verwacht rendement is 10-20 ng/μl). Gids RNA inzetstukken kunnen worden achtergelaten bij-20 ° C, of onmiddellijk in Gibson vergadering met een gelineariseerde U6-vector kunnen worden gebruikt.
  4. Ter voorbereiding van de ontvanger U6 klonen vector voor Gibson montage, opgezet een restrictie-enzym-digest. Als vele Gibson vergadering Reacties dienen te worden uitgevoerd, instellen meerdere verteert om voldoende rendement van gesneden vector.
    1. 20 eenheden van AflII enzym en 1 μg plasmide gebruiken in een 20 μL reactie met de juiste restrictie-enzym-buffer. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur.
    2. Opruimen van de digest met kralen of een kolom gebaseerde kit voor DNA zuivering en elueer in 20 μL van elutie buffer. Kwantificeren van de gezuiverde DNA met een Fluorimeter of spectrofotometer. Monsters kunnen worden bevroren bij-20 ° C voor later gebruik.
  5. Gibson vergadering uit te voeren op de voorbereide vector en invoegen.
    1. Gibson vergadering reacties instellen op ijs. Gebruik 50 ng van de vectoren en 7 ng van het donormateriaal in een 20 μL reactie. De inserts 1:10 verdunnen in ultrazuiver water om pipetteren. Instellen van een vector enige Gibson vergadering-reactie, 50 ng van de vector en het donormateriaal te vervangen door water.
    2. Incubeer de Gibson vergadering reacties voor 15 min bij 50 ° C, gevolgd door een wachtruimte bij 4 ° C.
    3. Overdracht van de geassembleerde producten aan ijs. Verdun de geassembleerde producten 1:4 in ultrazuiver water op het ijs. Bijvoorbeeld, 5 μl van Gibson vergadering product aan 15 μL van ultrazuiver water toevoegen.
  6. Transformeren de verdunde Gibson vergadering producten.
    1. Hoogrenderende bevoegde cellen op ijs ontdooien en 25 μL aliquots voor elke transformatie te maken. Als een complexe pool targeting op meerdere sites wordt gewenst, ontdooi genoeg cellen in verschillende buizen voor het uitvoeren van meerdere onafhankelijke transformaties van dezelfde groep met complexe gRNA.
    2. Toevoegen voor elk verdunde product, 1 μL met deze tweevoudige verdunning een 1,7 ml Eppendorf buis met 25 μL van bevoegde cellen. Meng door kort flicking de buis. Incubeer de buizen op het ijs gedurende 30 minuten.
    3. Warmte schok de cellen voor 30 bij 42 ° C, s Breng onmiddellijk om het ijs gedurende 2 minuten.
    4. Voeg van 300 μL SOC media (2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4en 20 mM glucose) en laat de cellen herstellen gedurende 1 uur bij 37 ° C met schudden (300 rpm). Gedurende deze tijd, warm de agar platen met ampicilline/carbenicillin tot 37 ° C in een broedstoof. Een plaat voor elke transformatie gebruiken.
    5. Typeplaatje 50 μl van cellen en plaats de platen in een incubator 37 ° C's nachts. Voor de zwembaden gericht op afzonderlijke sites, plaatst u rechtstreeks in 3-5 mL van de pond-Bouillon (Tabel of Materials) met ampicilline/carbenicillin (1 mg/mL) en na een nacht bebroeden met schudden bij 250 omwentelingen per minuut bij 37 ° C gedurende minipreps.
  7. Oogsten van de cellen en DNA te isoleren.
    1. Gebruik voor grote gids RNA bibliotheken targeting op meerdere sites, een schraper plaat om te verzamelen van alle kolonies van elke afzonderlijke plaat in één maxiprep (150 mL vloeibare cultuur). Dit kan worden vergemakkelijkt door gieten ~ 5 mL LB met de juiste antibioticum in een tube van 50 mL falcon en schrapen de kolonies in de buis. Voor bibliotheken gericht op afzonderlijke sites, schraap de platen in een miniprep (3-5 mL vloeibare cultuur).
    2. Incubeer deze culturen met de juiste antibioticum gedurende 3-5 uur bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.
    3. DNA-extractie met behulp van een kit die in een endotoxine-vrije preps resulteert uitvoeren
    4. Kwantificeren van DNA met een Fluorimeter of spectrofotometer. Plasmiden kunnen worden onmiddellijk in Transfectie gebruikt of opgeslagen bij-20 ° C voor toekomstig gebruik.
  8. Ter bevestiging van de aanwezigheid van de volgorde van de RNA van de gids in de U6 vector voor kleine zwembaden gericht op enkele sites, gebruik Sanger rangschikken op de voorbereide miniprep met de "U6_PCR_R" primer vermeld in tabel 1. Door bundeling van gids RNAs, de 19 basepair gRNA doel reeks gemengde honken zal opleveren, maar de U6 promotor en gids RNA steiger rondom deze volgorde moet intact.

4. de transfectie van Enhancer-i

Nota: Voor de succesvolle blokkade van een reactie van de oestrogeen Enhancer-i, waarbij in Ishikawa cellen, is het noodzakelijk om te beroven van de cellen van oestrogeen voor 5-7 dagen vóór de transfectie door te handhaven hen fenol red gratis RPMI met 10% houtskool-ontdaan FBS en 1% penicilline/streptomycine. Cellen moeten in deze media worden gekweekt tijdens en na de transfectie als proberen te blokkeren van een oestrogeen-reactie. Wij raden het gebruik van fenol red gratis trypsine voor passage van de cellen in het volledige fenol rood gratis RPMI.

  1. De dag voor transfectie, plaat de cellen (wild-type of stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB) in een 24-well plaat duikt met 30-50% confluentie (~ 60.000 cellen per putje voor Ishikawa cellen). Plaat voldoende cellen zodanig dat transfections kan worden uitgevoerd in twee exemplaren, en omvatten putten om te zijn transfected met controleaanwijzing RNAs.  Zorg ervoor dat de cellen worden gelijkmatig verdeeld over de put door zachtjes schudden de plaat na cel plating zoals in stap 1.1.7.
    Nota: Dit protocol veronderstelt het gebruik van kationische liposoom gebaseerde transfectie reagentia. Electroporation biedt een alternatieve methode voor celtypes die zeer gevoelig voor deze reagentia zijn. Transfectie voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor de cellijn van belang vóór probeert Enhancer-i experimenten.
  2. De volgende dag, bereiden transfections volgens instructies van de transfectiereagens van keuze. Voor Ishikawa cellen, gebruik 550 ng van totale plasmide voor elk putje van de plaat van een 24-well. Verdun de plasmiden om een eindconcentratie van 0.020 μg/μL in serumvrij media (1.1 μg van DNA in 52 μL van totale volume voor transfecting 2 putten). 3 μL van transfectiereagens gebruiken voor elke 1 μg van DNA, vortex en zoals beschreven in stap 1.2 uit te broeden. 25 μL van het uiteindelijke mengsel toevoegen aan elk putje.
    Opmerking: Tot doel combinaties van sites, gebruiken hetzelfde gewicht van plasmide voor elke individuele site, en vul vervolgens het overgebleven gewicht met een besturingselement plasmide (lege gids RNA klonen vector- of gids RNAs gericht op een gebied van de negatieve controle zoals de IL1RN Promotor). Voor tijdelijke transfections, gebruikt u een verhouding van 3:2 Cas9 fusion: gids RNA plasmide. Plasmiden met fluorescerende verslaggevers kunnen worden toegevoegd aan het controleren van de transfectie efficiëntie.
  3. Bij 36 h post transfectie, veranderen de media met behulp van fenol red gratis RPMI met 10% houtskool-ontdaan FBS en 1% penicilline/streptomycine (voor Ishikawa cellen) en leveren van puromycin (eindconcentratie: 1 μg/mL) en neomycine (eindconcentratie: 300 ng/mL). Als cellen gevoelig voor transfectiereagens zijn, de media kan eerder worden gewijzigd, maar niet eerder dan 24 h post transfectie antibiotica moeten worden toegevoegd.
    Opmerking: Wacht ten minste 24 uur na het toevoegen van antibioticum vóór het oogsten van de cellen. Expressie veranderingen als gevolg van Enhancer-i kunnen worden gedetecteerd als spoedig 48u transfectie boeken en omhoog tot 5 dagen transfectie boeken. Als werken met Ishikawa-cellen die gebleven van oestrogeen verstoken zijn, voert u een 8-h 10 nM 17β-estradiol (E2) inductie de dag na behandeling met antibiotica en vervolgens onmiddellijk oogst cellen.

5. cel oogst en RNA extractie

  1. Lysis-buffermengsel met 1% β-mercaptoethanol (BMT) voor te bereiden. Zorg ervoor dat er genoeg lysis-BME mengsel (300 μL voor elk goed wordt geoogst).
  2. De media met behulp van een vacuüm aspirator gecombineerd.
  3. Wassen van de cellen een keer met een gelijk volume 1 x PBS (500 μL) en aspirate te verwijderen van zo veel PBS mogelijk.
  4. Voeg 300 l lysis-BME oplossing aan elk putje met behulp van een meerkanaalspipet. Pipetteer de lysis oplossing omhoog en omlaag 8 - 10 keer, en overdracht aan een diep-well plaat of 1,7 mL Eppendorf buizen op ijs. RNA kan onmiddellijk worden geëxtraheerd, of lysates kunnen worden bevroren bij-80 ° C voor toekomstige verwerking.
  5. Om RNA van lysates, gebruikt u een commercieel beschikbare kit waarin een DNase behandeling. Elueer in de kleinste aanbevolen hoeveelheid ultrazuiver water (RNase-gratis, DNase-gratis) of elutie buffer en kwantificeren van RNA. Voor kleine aantallen monsters, gebruik een Fluorimeter of spectrofotometer. Gebruik voor grote aantallen monsters, een fluorescente sonde die RNA en maat op een afleesapparaat detecteert. Monsters kunnen worden bevroren bij-80 ° C voor of na de kwantificering.

6. het kwantificeren van gen expressie veranderingen met behulp van One-step qPCR en RNA-seq

  1. QPCR inleidingen voor de genen van belang en voor ten minste één huishouden-gen dat wordt uitgedrukt in de buurt van het niveau van gerichte genen en verandert niet over experimentele omstandigheden te verkrijgen. In het ideale geval wordt deze inleidingen verdeeld over een knooppunt van de exon-exon Voorkom versterking van genomic DNA.
    1. Test deze inleidingen op RNA verkregen uit de cellijn van belang. Gebruik smelten kromme analyse om te controleren of de productie van één product. Als een enkel product wordt niet geproduceerd, testen extra primerparen.
  2. Voor elk Enhancer-i en controle gids RNA behandeld monster, identificeren hoe vele genen moeten worden bepaald in dat monster. Deze set genen moet bevatten genen van de huishouding, zoals CTCF of GAPDH.
  3. Instellen qPCR reacties.
    1. Alle monsters dezelfde concentratie in water, verdund zodat 50 ng van totale RNA is gemakkelijk afgepipetteerde, en er is genoeg verdund RNA voor elke reactie. Bijvoorbeeld, RNA Verdun tot ~16.6 ng/l en gebruikt 3 μL van RNA in elke reactie. RNA op ijs tijdens het opzetten van meester mixen houden.
    2. Aparte master mixen voor elk gen worden gemeten met behulp van commercieel verkrijgbare one-step qPCR kits voor te bereiden. Gebruik een 20 μL reactie volume met 1 μL van elke primer (10 μM stockoplossing). Deze reacties instellen op ijs.
    3. In een reactie plaat die geschikt is voor de thermische cycler, toevoegen van RNA monsters gevolgd door meester mixen. Zegel met een sealer plaat en meng zachtjes door vortexing of pipetteren. Kort centrifugeren van de plaat (140 x g voor 60 s) om ervoor te zorgen dat vloeibaar is bij de bodem van de putten.
    4. Incubeer de plaat in een thermische cycler als volgt (of als bouwpakket gelast): 48 ° C gedurende 30 minuten, 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli van (95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 min).
  4. Ct waarden voor elk gen gemeten binnen elk monster te verkrijgen. Gebruik de vergelijkende Ct methode om veranderingen in de expressie van genen te identificeren.
    1. Aftrekken van de Ct van het huishouden-gen van de Ct van elk gen van belang voor elk monster voor het genereren van genormaliseerde Ct-waarden.
    2. Voor de behandelde controlemonsters, neem een gemiddelde van de genormaliseerde Ct-waarden voor elk gen. Log base 2-schaal vouw repressie kan vervolgens worden berekend door aftrekken van de genormaliseerde Enhancer-i behandeld monster Ct voor elk gen van dezelfde waarde voor de behandeld controlemonster voor het bijbehorende gen.
  5. Om te bepalen van globale wijzigingen in genexpressie na Enhancer-i behandeling, voorbereiden op de monsters RNA sequencing met behulp van een commercieel beschikbare kit compatibel met de technologie van de volgorde van de gebruiker. Gebruik ~ 500 ng van RNA voor de grondstof en bibliotheken voor ten minste 2 biologische replicatieonderzoeken te bereiden.

7. de verificatie van specifieke Genomic gericht op door met behulp van SID4X-dCas9-KRAB ChIP-seq

Opmerking: De SID4X-dCas9-KRAB fusieproteïne bevat zowel een vlag epitoop tag en een HA epitoop tag, maar de beste resultaten voor ChIP-seq werden verkregen met Anti-Flag antilichamen. Indien gewenst, kan de gebruiker extra ChIP-seq experimenten uitvoeren voor transcriptiefactoren potentieel getroffen door Enhancer-i, of H3K27ac, een merk van enhancer-activiteit die wordt verlaagd door Enhancer-i. Elke ChIP-seq-experiment vereist echter 10 x 106 cellen, zo plan dienovereenkomstig.

  1. Transfect cellen met Enhancer-i zwembaden.
    1. Plaat 10 x 106 cellen in een 15 cm weefselkweek schotel. Elk gerecht vertegenwoordigt 1 ChIP-seq experiment voor 1 factor van belang.
    2. De volgende dag, transfect de cellen met behulp van totale DNA 20 μg per schotel. Voor transfections in cellijnen stabiel SID4X-dCas9-KRAB uitdrukken, moet het DNA worden van een plasmide pool van gids RNAs gericht op alle sites van belang, en optioneel een plasmide uiting van fluorescente proteïne. Voor tijdelijke transfections, gebruikt u een verhouding van 3:2 dCas9 fusion protein: gids RNA zwembad. Voor ChIP-seq van andere TFs of Histon modificaties, door ten minste één extra controle gids RNA Transfectie te verrichten op een andere schotel.
    3. Behandelen de gerechten met puromycin (1 μg/mL) en neomycine (300 ng/mL) op 24-48 h post transfectie. Wacht ten minste 24 uur vóór het oogsten van de chromatine.
  2. Oogst chromatine van gerechten.
    Opmerking: Een 1 h 10 nM E2 behandeling uitvoeren op gerechten te bestuderen van de effecten van Enhancer-i de genomic bindende ER in Ishikawa cellen transfected met controleaanwijzing RNAs en Enhancer-i prior te oogsten. Studie van de effecten van Enhancer-i op H3K27ac-, een 8 h 10 nM E2 inductie uitvoeren op gerechten transfected met controleaanwijzing RNAs en Enhancer-i prior te oogsten.
    1. Toepassing 500 μL van 37% formaldehyde op elk gerecht (eindconcentratie van 1%). De platen kort wervelen. Laat de platen zitten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    2. Voeg vervolgens 1 mL van 2,5 M glycine (eindconcentratie van 125 mM). De platen kort wervelen.
    3. Giet af de media met formaldehyde en glycine. Voeg een gelijk volume (~ 20 mL) van koude 1 x PBS.
    4. Giet af de PBS. Gecombineerd met een vacuüm aspirator zoveel PBS mogelijk verwijderen. Plaats de gerechten op het ijs.
    5. Voeg 3-5 mL koude 1 x PBS of Farnham lysis-buffermengsel (5mM buizen pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) met 1 x proteaseinhibitor (toegevoegd net voor gebruik) op elke plaat. Schraap de schotel met een plaat schraper en breng de oplossing over in een conische tube van 15 mL op ijs.
    6. Pellet chromatine door spinnen neer buizen in een centrifuge voor 5 min bij 4 ° C op 1000 x g. negeren het supernatant en opslaan van de pellets bij-80 ° C voor toekomstig gebruik, of doorgaan met het protocol van de ChIP-seq van keuze met behulp van een Dizzee RASCAL-antistoffen of antilichamen gericht op andere transcriptiefactoren of Histon modificaties van belang (H3K27ac, H3K9me3).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont een schematische voorstelling van de werkstroom die is beschreven in het protocol. Om te bepalen dat de bijdragen van ER-gebonden versterkers in de buurt van het oestrogeen-gereglementeerde gen MMP17, die heeft 3 bandplaatsen in de buurt zoals gedefinieerd door ChIP-seq (figuur 2A), begeleiden RNAs werden ontworpen voor elke regio. Te ontwerpen gids RNAs, een 600-900 bp venster van sequentie rond elke ER was bindende site van belang geselecteerd en zet in het programma voor het ontwerpen van een gids-RNA. Als gevolg van gids sequenties RNA met 0-2 uit doel sites werden aangepast aan het menselijk genoom met behulp van BLAT voorspeld. Vier niet-overlappende begeleiden RNAs die de regio gedefinieerd door ChIP-seq overspannen en DNaseI overgevoeligheid werden gekozen voor targeting (figuur 2B). Aanvullende reeks (tabel 1) werd toegevoegd aan elk uiteinde om downstream klonen en de daaruit voortvloeiende 59 fragmenten van de nucleotide werden besteld. Bij aankomst, werd gids RNAs waren verdund en gebundeld door site, en een korte PCR uitgevoerd om toe te voegen homologie regio's voorafgaand aan de vergadering van de Gibson. Figuur 2C toont de verwachte gids RNA product na een korte PCR met behulp van de "U6_internal" inleidingen (tabel 1), die 20 basepairs van sequentie aan elk uiteinde van de 59 basepair toevoegen zal begeleiden RNA fragment, wat resulteert in een reeks van ~ 100 basepair. Na assemblage van Gibson, deze gids RNA zwembaden werden omgevormd tot bacteriën en plasmide minipreps de volgende dag werden voorbereid. Figuur 2D ziet u resultaten van een versterker dissectie experiment, waar meerdere versterkers in de buurt van MMP17 alleen zijn gericht en in combinatie met de Enhancer-i. Sites gericht door Enhancer-i worden aangeduid met een zwarte zeshoek. Gids RNA plasmiden, gericht op de aangegeven locaties zijn transfected in een oestrogeen-beroofd Ishikawa cellijn stabiel SID4X-dCas9-KRAB te uiten. Twee dagen later, de media werd veranderd en puromycin werd toegevoegd om te verrijken voor transfected cellen. De volgende dag, zijn de cellen geoogst na een behandeling van 8 h 10 nM estradiol. RNA werd geïsoleerd, en een one-step-qPCR werd uitgevoerd. In dit voorbeeld zijn sites 1 en 2 nodig voor een volledige oestrogene reactie van MMP17, terwijl de site 3 draagt niet onder deze omstandigheden (figuur 2D, rijstroken ii-iv). Wanneer alleen de sites 2 of 3 actief zijn (vi en vii), de oestrogeen-reactie is vergelijkbaar met wanneer geen sites zijn actief (viii), wat suggereert dat deze sites onafhankelijk kunnen niet bijdragen. Site 1 enkele expressie kan bijdragen door zelf (v), maar de grootste activiteit wordt gezien wanneer sites 1 en 2 zijn actieve (iv).

Om te manipuleren 10 versterkers in de buurt van 4 verschillende genen tegelijk (figuur 3A), complexe zwembaden van begeleiden RNAs werden gegenereerd met 42 enhancer gidsen en 16 promotor gidsen. Gids RNA oligos werden samengevoegd voordat de eerste gids RNA extensie PCR (stap 3.3), en de resulterende PCR producten werden gezuiverd en gecombineerd met de lege puromycin U6 klonen vector met behulp van Gibson vergadering. Na de vergadering van de Gibson, meerdere onafhankelijke transformaties werden uitgevoerd en verguld. De platen zijn geschraapt in LB en toegestaan om te groeien uit voor 2-4 uur voorafgaand aan de maxiprep. Figuur 3B toont representatieve reducties in genexpressie door qPCR wanneer deze gids RNA zwembaden waren transfected in een oestrogeen-beroofd Ishikawa cellijn stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB en behandeld zoals beschreven hierboven (figuur 2D). Inkomstenbelastingsverlagingen Enhancer-i zijn vergelijkbaar met die welke zijn verkregen door de promotor van het vermeende target-gen richten. Figuur 3 c toont de effecten van verdunning van gids RNAs op vermindering van de reactie van de oestrogeen met behulp van Enhancer-i. Een 1:50 verdunning van een pool van de gids RNA gericht op de versterker in de buurt van G0S2 nog steeds aanzienlijke vermindering van genexpressie levert, suggereren dat Enhancer-i kan worden gebruikt voor het richten van maximaal 50 sites tegelijk. Echter kan de deactivering worden verdund, die aangeeft dat honderden sites tegelijk kunnen niet worden gericht, tenzij gevoeliger detectiemethoden werkzaam zijn.

figure-results-1
Figuur 1. Protocol schematische voor multiplex enhancer dissectie met behulp van Enhancer-i. Gids RNAs (rood en blauw) zijn ontworpen met behulp van e-knapperig en geselecteerde de UCSC genome browser gebruikt. Vier gids RNAs worden gekozen dat de regio's van belang (transcriptie factor bandplaatsen zoals gedefinieerd door ChIP-seq) omvatten. Gids RNA oligonucleotides, die door de regio van belang (rood en blauw) hebben zijn gebundeld ondergaan een PCR om toe te voegen homologie regio's (oranje) voorafgaand aan de vergadering van de Gibson en transformatie. Resulterende plasmide zwembaden zijn transfected via lipofection naar cellijnen stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB of wild-type cellen in combinatie met SID4X-dCas9-KRAB plasmide. Gids RNA plasmide zwembaden kunnen individueel zijn transfected te richten op één plaats tegelijk, of in combinatie te richten op meerdere sites tegelijk. Transfected cellen worden behandeld met antibiotica te verrijken voor cellen met gids RNAs. Op ~ 72 h post transfectie, worden de cellen geoogst. Nucleic zuren kunnen worden geëxtraheerd voor qPCR, RNA-seq of ChIP-seq. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2. Begeleiden van RNA ontwerp en enhancer dissectie voor MMP17. (A) Genome browser screenshot van de alpha-gebonden ER versterkers (grijs) worden gericht in de buurt van MMP17. Dit cijfer is gewijzigd vanaf Carleton, et al.. 18. (B) gids RNA ontwerpt voor de 3 sites18bindend. De bindende site voor ER zoals gedefinieerd door ChIP-seq is het doel, en de tegel van de RNAs 4 gids over deze streek. Het DNaseI gevoeligheid signaal, dat de bindende site omspant, kan ook worden gebruikt om doel reeks definiëren voor gids RNA ontwerp. ChIP-seq zowel DNaseI HS gegevens werden verkregen uit Ishikawa cellen behandeld met 10 nM estradiol voor 1 h. (C) vertegenwoordiger gids RNA-sequenties die klaar zijn voor de assemblage van Gibson, een korte PCR om toe te voegen homologie regio's hebben ondergaan. (D) relatieve uitdrukking van MMP17 gemeten via qPCR na gericht op specifieke regio's met de Enhancer-i en een 8-h10 nM estradiol behandeling. Expressie is ten opzichte van CTCF en expressie niveau van MMP17 in cellen niet behandeld met estradiol. Controleaanwijzing RNAs de promotor van richten IL1RN. Alle foutbalken vertegenwoordigen SEM, dubbele sterretjes geven p < 0.01 en één sterretjes geven p < 0.05 in een gepaarde t-toets. Dit cijfer is gewijzigd vanaf Carleton, et al.. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3. Targeting op meerdere versterkers in de buurt van verschillende genen tegelijk met gebundeld Enhancer-i. (A) schema van de bandplaatsen en initiatiefnemers in gepoolde Enhancer-i worden gericht. (B) de effecten op expressie zoals gemeten door qPCR na E2 behandeling op Ishikawa cellen transfected met Enhancer-i plasmide zwembad (groen), de promotor-i plasmide zwembad (blauw) of de controle gRNAs (wit)18. Een aanzienlijke vermindering in alle genen wordt waargenomen met de Enhancer-i. Dit cijfer is bewerkt vanaf Carleton, et al.. 18. (C) de effecten op G0S2 meningsuiting niveaus na E2 behandeling op Ishikawa cellen transfected met verschillende hoeveelheden gids RNAs gericht op G0S2. Een aanzienlijke vermindering kan worden gezien zelfs met kleine hoeveelheden gids RNA (1:50 verdunning), suggereren dat maximaal 50 plaatsen kan gericht gelijktijdig. Alle foutbalken vertegenwoordigen SEM, dubbele sterretjes geven p < 0.01 en één sterretjes geven p < 0.05 in een gepaarde t-toets. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

NaamVolgorde
U6_internal_FTTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_RGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_FCCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_RAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_FGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_RAAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_FGTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_RAGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_FAGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_RCGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_FCAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_RTCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

Tabel 1. Inleidingen gebruikt voor gids RNA extensie en sequencing, qPCR, en detectie van de fusie-eiwit.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en flexibele methode voor het ontleden van versterker functie op de endogene genomic locus zonder te fysiek veranderen de opeenvolging van DNA. Terwijl gelijkaardig in concept aan de eerder gepubliceerde CRISPR interferentie protocollen met behulp van dCas9-KRAB27, verschilt Enhancer-i op 3 belangrijkste punten van deze protocollen. Eerst, Enhancer-i maakt gebruik van het domein SIN3A interactie van MAD120 tot deactivering van de versterker. Versterker deactivering kan worden gered met behulp van HDAC-remmers, suggereert dat het primaire mechanisme van deactivering HDAC afhankelijk is. In tegenstelling tot de interferentie van de CRISPR met dCas9-KRAB leidt Enhancer-i niet tot de afzetting van H3K9me3. Dit is waarschijnlijk vanwege het feit dat Enhancer-i is afhankelijk van de tijdelijke invoering van gids RNAs, met de cellen worden geoogst op 3 dagen transfectie post. In CRISPR de storing, wordt een toename van de H3K9me3 waargenomen op 7 dagen post transductie12. Tot slot biedt het Enhancer-i-protocol een strategie om te richten op meerdere sites tegelijk en bewaken van de efficiëntie van targeting. DCas9-KRAB wordt gebruikt tegelijkertijd richten op meerdere versterkers in mozaïek-seq17, maar deze techniek is afhankelijk van eencellige RNA sequencing om expressie veranderingen te identificeren, en vele genen (zoals oestrogeen-responsief genen) onopgemerkt blijven als gevolg van de lage gevoeligheid van eencellige RNA-seq. Enhancer-i biedt een betrouwbare methode om te studeren versterkers afzonderlijk en in combinatie voor elke gen.

De meest kritische stap van Enhancer-i is transfectie, die moet worden geoptimaliseerd voor de cellijn van belang. Dit protocol is gebaseerd op puromycin behandeling te verrijken voor transfected cellen, maar het is mogelijk dat mede transfecting gids RNAs met een fluorescente proteïne en sorteren voor fluorescerende cellen met behulp van stroom cytometry kan blijken te zijn een betere methode voor verrijking voor sommige cel typen. Het is raadzaam om toezicht op het niveau van de expressie van gids RNAs en SID4x-dCas9-KRAB door qPCR oplossen en bevestigen van transfectie. Als RNA richtniveaus laag zijn (cyclus drempel > 30), gebruikers kunnen ook overwegen alternatieve gids RNA productiestrategieën zoals in vitro transcriptie28. Het is ook mogelijk dat ondanks de hoge gRNA niveaus, gids RNA richten van het eiwit SID4x-dCas9-KRAB is inefficiënt, in welk geval selecteren verschillende begeleiden RNA-sequenties kunnen het nodig zijn. Door het uitvoeren van ChIP-seq op de fusieproteïne met chromatine uit Enhancer-i behandeld cellen, kan de efficiëntie van targeting worden gecontroleerd. Als er hoog signaal van SID4x-dCas9-KRAB in de regio van belang is, en geen expressie veranderingen in haar vermeende target-gen zijn waargenomen, dan bijdraagt de regio waarschijnlijk niet tot de uitdrukking van dit gen onder de voorwaarden die studeerde.

Een mogelijke beperking van Enhancer-i is dat af-target effecten zich ophopen kunnen als te veel sites tegelijkertijd zijn gericht. Toch hebben CRISPR interferentie strategieën voor knockdown minder af target effecten dan RNAi29, met name wanneer een polyclonal cellijn uiting van dCas9-KRAB wordt gebruikt. Terwijl we hebben gezien de genomic bindende uit-target van SID4X-dCas9-KRAB bij het uitstippelen van 10 sites tegelijk, hebben we gen expressie veranderingen als gevolg van deze bindende gebeurtenissen niet geïdentificeerd. Zoals sommige versterkers kunnen contact opnemen met meerdere initiatiefnemers en/of andere versterkers, is het mogelijk dat vele genen expressie op het richten van een interne versterker, veranderen kunnen, maar het is onduidelijk of deze vorm van genexpressie gemeenschappelijk is. Om te bevestigen dat de expressie veranderingen waargenomen zijn te wijten aan gericht op een specifieke versterker, en niet uit-target effecten, kunnen gebruikers Enhancer-i uitvoeren met twee verschillende sets van niet-overlappende gids RNAs gericht op hetzelfde gebied. Daarnaast kan de genetische schrapping van de regio met behulp van de nuclease-bevoegde Cas9 verder te bevestigen de effecten ervan op de genexpressie.

Als Enhancer-i functies door Histon deacetylation, is het mogelijk dat de deactivering capaciteiten beperkt zijn tot versterkers die aanzienlijke niveaus van Histon acetylation hebben. Er zijn een verscheidenheid van alternatieve repressieve fusies die meer effectief op gericht op specifieke versterkers kan zijn. DNA methyltransferase fusies te dCas9 kunnen worden gebruikt voor het verminderen van genexpressie wanneer gericht op de versterkers van de distale30, maar deze repressie is vaak niet van voorbijgaande aard. Een andere repressieve fusion gebruikt het domein van de vriend van GATA1 (FOG1), die leidt tot Histon H3 lysine 27 trimethylation en verdringt genexpressie op niveaus die vergelijkbaar is met dCas9-KRAB over een verscheidenheid van cel lijnen en initiatiefnemers31. Interessant, verminderd toe te voegen meer kopieën van FOG1 aan dCas9 het repressieve potentieel aan initiatiefnemers, suggereren dat één exemplaar van het domein-SID meer enhancer deactivering dan de 4 exemplaren die momenteel worden gebruikt in Enhancer-i kan leveren. Het is mogelijk dat sommige loci profiteren kunnen van de dual richten door verschillende combinaties van de bovenstaande dCas9 fusies. Stabiel op lange termijn onderdrukking kan bijvoorbeeld worden bereikt door gelijktijdige transductie van dCas9-DNMT3a en dCas9-KRAB32. De meeste van deze repressieve fusies hebben alleen is gericht op een interne locus tegelijk, en blijft het onduidelijk welke is het meest effectief in het manipuleren van meerdere versterkers gelijktijdig.

Versterker-i, terwijl een geschikte methode voor het bestuderen van combinaties van versterkers voor een handvol genen, is nog enigszins beperkt in doorvoer, als de gebruiker wenst te studeren putatief versterkers voor honderden genen. Toekomstige toepassingen van deze techniek zal imaging gebaseerde technologieën om te kwantificeren van meerdere genen in meerdere monsters tegelijk opnemen. Nog belangrijker is, zijn deze technologieën compatibel met directe detectie van molecules van RNA van lysate, eliminerend de behoefte aan tijdrovende RNA isolatie. Deze aanpassingen vergemakkelijkt de ondervraging van grotere soorten versterkers.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de NIH/NHGRI R00 HG006922 en NIH/NHGRI R01 HG008974 aan J.G. en de jager Cancer Institute. J.B.C. werd gesteund door de NIH trainingsprogramma in genetica T32GM007464.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ZR 96-well Quick-RNA KitZymo ResearchR1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-StepApplied Biosystems4389986
AflII restriction enzymeNEBR0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNEBM0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621L
FuGENE HDPromegaE2312
DNA Clean & Concentrator KitZymo ResearchD4013
Buffer RLT PlusQiagen1053393
b-estradiolSigma-AldrichE2758
Human: Ishikawa cellsECACC99040201
H3K27ac rabbit polyclonalActive Motif 39133
H3K9me3 rabbit polyclonalAbcam ab8898
FLAG mouse monoclonalSigma-Aldrich F1804
ER alpha rabbit polyclonalSanta Cruzsc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmidAddgene 51133Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmidAddgene 41824Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmidAddgene 106404Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmidAddgene 106399Carleton et al., 2017
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermoFisher Scientific10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture BeadsKapa BiosytemsKK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermoFisher ScientificA32959
Formaldehyde solutionSigma-Aldrich252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131035
LB BrothThermoFisher Scientific10855001
Quick-DNA Miniprep KitZymo ResearchD3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA LadderNEBN0050S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).">Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).">Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).">Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).">Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).">Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).
  6. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).">Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).">Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).">Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).">Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).">Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).">Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).">Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).">Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).
  14. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).">Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).">Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).">Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).">Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).">Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).">Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).">Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).">Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).">Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).">Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).">Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).">Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).">Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).">Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).">Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).
  29. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).">Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).
  30. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).">Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).">O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).">Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR InterferenceEnhancer FunctionGuide RNA DesignMultiplex Enhancer InterferenceTransient TransfectionGene Regulation AnalysisdCas9 RepressionEnhancer DeactivationTissue Culture SettingsGenomic Targeting

Related Articles