Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

7.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57890

⸱

12 augustus 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Intracellulaire ROS heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Hier beschrijven we een gevoelige assay voor het kwantificeren van ROS niveaus tijdens cellulaire senescentie. We bieden ook protocollen voor de beoordeling van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, die naar verluidt aan verschillende leeftijdsgebonden disfuncties bijdraagt.

Samenvatting

Cellulaire senescentie is beschouwd als een staat van onomkeerbare groei arrestatie na uitputting van de proliferatieve capaciteit of blootstelling aan verschillende benadrukt. Recente studies hebben uitgebreid de rol van cellulaire senescentie naar verschillende fysiologische processen, met inbegrip van de ontwikkeling, wondgenezing, immuun toezicht en leeftijdsgebonden weefsel dysfunctie. Hoewel celcyclus arrestatie een essentieel kenmerk van cellulaire senescentie is, heeft een verhoogde intracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) productie ook aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Recente studies bleek bovendien dat verouderend cellen krachtige paracrine activiteiten op naburige cellen en weefsels via een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP exposeren). De scherpe stijging van de rente met betrekking tot therapeutische strategieën tegen cellulaire senescentie onderstreept de noodzaak van een nauwkeurig inzicht in senescentie mechanismen, met inbegrip van intracellulaire ROS en de SASP. We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van kwantitatief intracellulaire ROS niveaus tijdens H-Ras-geïnduceerde cellulaire senescentie met behulp van ROS-gevoelige fluorescente kleurstof en stroom cytometry. Daarnaast introduceren we gevoelige technieken voor de analyse van de inductie van mRNA uitdrukking en secretie van SASP factoren. Deze protocollen kunnen worden toegepast op verschillende cellulaire senescentie modellen.

Inleiding

Meer dan 50 jaar geleden, bleek Hayflick en Moorhead dat normale cellen onomkeerbare groei arrestatie op de uitputting van hun proliferatieve potentieel na een bepaald aantal celdelingen1 invoeren. Dit fenomeen is nu bekend als Dr. senescentie en gelooft te sterk correleren met organisch veroudering2. Hoewel de geleidelijke erosie van de telomeren wordt beschouwd als een belangrijke oorzaak van Dr. senescentie, zijn diverse cellulaire benadrukt, zoals DNA schade oncogene activering en oxidatieve stress, voor het opwekken van een ander type van cellulaire senescentie gemeld "voorbarig senescentie" of "stress-induced senescentie" genoemd. Interessant, speelt voortijdige senescentie een potente tumor-onderdrukkende rol bij de activering van oncogenen zoals H-Ras en BRAF. Studies van Muismodellen en menselijke weefsels hebben sterke aanwijzingen dat biomarkers voor cel senescentie waren voornamelijk aanwezig in Premaligne laesies waar oncogene Ras en BRAF worden geactiveerd maar werden afgenomen in kwaadaardige kanker die ontwikkeld op basis van Deze letsels3,4,5. Naast haar rol in veroudering en onderdrukking van de tumor, is cellulaire senescentie aangetoond in eerdere studies een rol te spelen in verschillende fysiologische processen, met inbegrip van wondgenezing, weefselherstel, immuun toezicht en embryonale ontwikkeling6.

Hoewel groei arrestatie heeft uitvoerig bestudeerd als een stempel van cellulaire senescentie7, suggereert een aanzienlijke hoeveelheid bewijs dat intracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) draagt ook bij tot cellulaire senescentie8. De hoogte van ROS niveaus tijdens verschillende soorten cellulaire senescentie, met inbegrip van Dr. senescentie en oncogen-geïnduceerde senescentie (OIS), werd oorspronkelijk gemeld decennia geleden9,10. Een meer direct, exogene behandeling met een subletale dosis H2O2 induceert senescentie11,12. De remming van ROS-opruiming enzymen, zoals SOD1, veroorzaakt ook voorbarig senescentie13. In tegenstelling, lage omgevingstemperatuur zuurstof voorwaarden en het vergroten van ROS opruiming vertraging het intreden van senescentie10,14,15. Deze resultaten geven ongetwijfeld dat ROS belangrijk bemiddelaars of determinanten van cellulaire senescentie inductie zijn. Echter hoe ROS bijdragen tot de inductie van cellulaire senescentie en hoe ROS niveaus zijn verheven tijdens cellulaire senescentie nader onderzoek.

Recente studies is gebleken dat verouderend cellen potente paracrine activiteiten op naburige cellen en weefsels door een SASP16,17 hebben. In leeftijd weefsel bevorderen verouderend cellen leeftijdsgebonden weefsel disfuncties via vele paden door SASP naast een autonome uitputting van de proliferatieve cellen. Verschillende proinflammatoire factoren, zoals IL-6, IL-8, TGFβ en matrix metalloproteinasen (MMP), uitgescheiden door verouderend cellen, veroorzaken de dysfuncties van de leeftijdsgebonden weefsel door de verslechtering van de weefsel homeostase, vernietiging van het weefsel architectuur, senescentie van naburige cellen en steriele ontsteking18,19. Echter kan SASPs hebben gunstige effecten afhankelijk van de biologische context. Bovendien, hangt de aard van de heterogenetic van de SASPs af van het celtype verouderend en de cel fase, nadruk op de noodzaak van verder onderzoek19.

Hier beschrijven we snelle en gevoelige cytometry gebaseerde technieken voor de beoordeling van intracellulaire ROS niveaus tijdens OIS. Bovendien, de methoden voor de analyse van SASP factoren met behulp van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) en ELISA zijn ingevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. inducerende oncogen-geïnduceerde senescentie

  1. Voorbereiding van een H-RasV12 retrovirus
    1. Coat de schotel van 100 mm cultuur door toevoeging van 2 mL van 0,001% poly-L-lysine/fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder de poly-L-lysine oplossing om met een glazen pipet verbonden met een vacuüm en wassen van de cultuur-schotel door toevoeging van 2 mL 1 x PBS.
    3. Plaat 3 x 106 ecotropic BOSC-23 verpakking cellen op de gecoate cultuur schotel met Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine en cultuur hen bij 37 ° C in de weefselkweek van een CO-2 Incubator voor 1 d.
    4. De volgende dag, transfect 2 µg pBabe puro-H-RasV12 DNA samen met retrovirale verpakking DNA (pGAG/pol 2 µg en 0,25 µg pVSVG) met behulp van een transfectiereagens voor 8u volgens de instructies van de fabrikant.
    5. Verwijder het medium van de transfectie en 8 mL van de verse media toevoegen.
    6. Na 48u, het medium met de virale deeltjes verzamelen en verwijderen van elke cellulaire puin door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min.
    7. Filter de H-Ras virus-bevattende media met een 0,45 µm spuit filter.
      Opmerking: Vermijd eventuele invriezen en ontdooien van het virus supernatant voor een efficiënte virale infectie. Gebruik voor het verkrijgen van de beste efficiëntie, een virus dat op dezelfde dag als infectie is gekapt.
  2. Infecteren WI-38 normale menselijke fibroblasten met het retrovirus H-RasV12
    1. Plaat 5 x 104 WI-38 cellen in een cultuur van 60 mm schotel met DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine 1 d voordat het oogsten van de H-RasV12-retrovirus en cultuur ze voor 1 dag bij 37 ° C.
    2. Verwijder het groeimedium de volgende dag en voeg 1 mL van H-RasV12 retrovirus media. Voeg een extra 1 mL 2 µL van een stamoplossing polybrene (8 mg/mL in gedestilleerd water) met groeimedium. Incubeer het monster gedurende 1 dag in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 weefselkweek incubator.
    3. Verwijder het mengsel retrovirus H-RasV12 24 h later en wassen van de cellen 2 x met 1 x PBS. Voeg groeimedium, en de cellen met 2 µg/mL puromycin behandelen voor 2 dagen in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 weefselkweek incubator.
    4. Na 2 d van puromycin selectie, verwijder het groeimedium, en wassen van de cellen 2 x met 1 x PBS. Voeg groeimedium, en cultuur van de cellen in een bevochtigde 37 ° C, 5% CO2 incubator totdat de aangegeven tijd punt (Zie figuur 1A voor een schema).

2. toezicht senescentie via senescentie-geassocieerde β-galactosidase kleuring

  1. De onderstaande voorraadoplossingen voor te bereiden.
    1. Bereiden van 20 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) in dimethyl formamide (DMF). Winkel de oplossing bij-20 ° C.
    2. Bereiden van een buffer van citroenzuur/natrium fosfaat door het oplossen van 3.377 g nb2HPO4.7H,2O (126 mM) en 0.708 g citroenzuur (36.8 mM) in 100 mL gedestilleerd water. Breng de pH op 6.0, indien nodig.
    3. 0.5 M kaliumferrocyanide voor te bereiden. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 ° C.
    4. 0.5 M kalium Hexacyanoferraat voor te bereiden. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 ° C.
      Opmerking: De pH van de kleurstofoplossing senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA β-gal) is essentieel voor nauwkeurige resultaten.
  2. Maak een verse SA β-gal kleurstofoplossing door verdunning van de stockoplossing met 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM kaliumferrocyanide, 5 mM kalium Hexacyanoferraat, 20% (v/v) citroenzuur/natrium fosfaatbuffer en 1 mg/mL X-gal.
  3. Verwijder het medium van de cultuur en het wassen van de cellen 1 x met 1 x PBS. Het herstellen van de cellen met de 3% formaldehyde gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: De cellen die niet geïnfecteerd zijn met het retrovirus moeten worden gebruikt als een negatieve controle. De niet-geïnfecteerde cellen moeten blijven worden gepasseerd om hun delende status te behouden.
  4. De oplossing van de fixatie van de cellen verwijderen en spoel ze met 1 x PBS. Voeg vers bereide 1 x Live SA β-gal kleurstofoplossing (1,5 mL in een schotel van 60 mm cultuur). Zegel van de schotel met een paraffine-film te voorkomen drogen en het Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C. Als alternatief, Incubeer de gerechten samen in een kamer vochtigheid.
    Opmerking: De kleefpoeders oplossing met 3% formaldehyde ingeleverd worden als gevaarlijk afval. Een incubator zonder CO2 is wenselijk, pH om wijzigingen te voorkomen tijdens de incubatie.
  5. De kleuring status van de cellen onder een microscoop te controleren op de volgende dag; SA β-gal-positieve cellen worden in blauw weergegeven in de perinuclear-regio.
    Opmerking: De delende cellen geven een lage frequentie van SA β-gal-positieve cellen. Als de kleuring te licht is, blijven de incubatie voor een iets langere periode (Zie figuur 1B voor representatieve voorbeelden).
  6. SA β-gal kleuring afbeeldingen inlezen met een CCD-camera met een 10 X of meer objectief. Vastleggen van een voldoende aantal afbeeldingen om de kleuring percentage te berekenen (> 200 cellen).
  7. Bereken het percentage van SA β-gal-gekleurd cellen door het nummer van de SA β-gal-positieve cellen ten opzichte van het totale aantal cellen te kwantificeren.
    Opmerking: SA β-gal kleuring moet worden herhaald onafhankelijk minstens 3 x, en de gemiddelde waarden moeten worden berekend op basis van de resultaten van repliceren experimenten (Figuur 1 C). De juiste celdichtheid is essentieel voor de SA β-gal kleuring experiment. Een hoge confluentie kan interfereren met de wijziging van een senescentie-geassocieerde morfologie en veroorzaken een vals-positieve signaal in de cellen.

3. het kwantificeren van een reactieve zuurstof soorten inductie tijdens H-Ras-geïnduceerde senescentie

  1. Plaat 2 x 105 WI-38 cellen in een cultuur van 60 mm schotel en H-Ras-geïnduceerde senescentie uitlokken zoals beschreven in stap 1.
    Opmerking: Dit protocol kan worden toegepast op andere soorten van cellulaire senescentie modellen.
  2. Verwijder het groeimedium op het aangegeven tijdstip (2, 4 of 6 dagen), en wassen van de cellen met 1 x PBS. Loskoppelen van de cellen door ze te behandelen met 1 mL trypsine/EDTA-oplossing 0,05% en inactivering van de trypsine door toevoeging van 1 mL groeimedium bevattende 10 gewichtspercenten FBS. Het bepalen van het aantal cellen.
  3. 1 x 105 cellen overboeken naar een conische tube van 15 mL, en de cellen verzamelen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min.
  4. Bereiden van verse 2', 7'-dichlorofluorescin DIACETAAT (DCF-DA) kleuring media door 50 µL van 10 mM DCF-DA toe te voegen aan 10 mL gestolde voedingsbodem (de concentratie van de werken van DCF-DA is 50 µM).
    Opmerking: DCF-DA is lichtgevoelig. Blootstelling aan licht moet worden vermeden. De concentratie van DCF-DA en de kleuring tijd kan worden aangepast afhankelijk van het celtype.
  5. Verwijder het groeimedium zorgvuldig uit de conische tube van 15 mL en voeg 1 mL vers bereide DCF-DA kleuring voedingsbodem. Zorgvuldig resuspendeer de pellet cel en het incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het donker. Een monster van niet-gekleurd wordt als een negatieve kleuring controle opgenomen.
    Opmerking: Delende cellen niet gekleurd met DCF-DA moeten worden voorbereid als een negatieve controle.
  6. De cellen verzamelen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten en was ze 1 x met 2 mL 1 x PBS. Resuspendeer de cellen met 1 mL 1 x PBS en overbrengen van het monster naar de gewenste cel met fluorescentie-geactiveerde sorting (FACS) buis.
  7. Meet de 2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCF-DA) fluorescentie signaal met behulp van een cytometer van de stroom voorzien van een passende laserbron. Prikkelen van de monsters met een blauwe laser (488 nm) en de uitgestoten fluorescentie op te sporen met een 530 ± 30 nm detector (FITC) met behulp van een logaritmische schaal.
    1. De negatieve controle niet gebeitste cellen eerst analyseren. In een dot perceel van voorwaartse scatter (FSC) versus kant spreiding (SSC), levende cellen gating gereedschap te selecteren en te elimineren dode cellen en cellulaire puin.
      Opmerking: De cel grootte verandering moet zorgvuldig worden gecontroleerd in de plot van de dot van FSC versus WS. Als de grootte van de verouderend cellen wordt aanzienlijk verhoogd, dient de intensiteit van de DCF-DA in cel populaties van dezelfde grootte na het gating in de plot van de dot van FSC versus SSC worden vergeleken.
    2. In een één-parameter histogram weergeven van DCF-DA (488 nm) fluorescentie op de logaritmische schaal van de x-as en het aantal gebeurtenissen (cel nummer) op de lineaire schaal van de y-as van de 488 nm laser te plaatsen van de piek van de kruisspanning de niet-gekleurde cellen aan de linkerkant.
    3. Analyseer de DCF-DA gekleurd monsters en record ten minste 10.000 gebeurtenissen voor elk monster. De waarde van de gemiddelde fluorescentie van elk monster met behulp van software van de analyse die specifiek zijn voor de stroom cytometer verwerven.
      Opmerking: De ROS-metingen moeten worden herhaald onafhankelijk minstens 3 x, en de gemiddelde waarden moeten worden berekend op basis van deze resultaten. Vertegenwoordiger H-Ras-geïnduceerde senescentie resultaten worden weergegeven in Figuur 2.

4. Quantifying IL-6 en IL-8 mRNA uitdrukking voor senescentie-geassocieerde secretoire fenotype analyse met behulp van een Real-time polymerasekettingreactie

  1. Totaal RNA voorbereiding
    1. Plaat 3 x 105 WI-38 cellen in een cultuur van 100 mm schotel in DMEM met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine en cultuur hen bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek voor 1 dag. Dubbele culturen voorbereiden op elk tijdstip.
    2. Induceren senescentie door het infecteren van de cellen met de H-RasV12 retrovirus zoals beschreven in stap 1.
    3. Op 1 dag vóór de oogst, het wassen van de cellen 2 x met 1 x PBS, en voeg 3 mL DMEM zonder FBS.
      Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd voor de productie van het geconditioneerde medium gebruikt voor ELISA zoals beschreven in stap 5. Serum honger veroorzaken een expressie van IL-6 en IL-8 mRNAs in sommige gevoelige cellen. Dus, de IL-6 en IL-8 mRNA uitdrukking in cellen gekweekt met en zonder serum honger moeten worden vergeleken in eerste instantie. Als serum honger significante veranderingen in de expressie van de IL-6 of mRNA van IL-8 induceert, moeten de totale RNA voor qPCR en het geconditioneerde medium voor ELISA afzonderlijk worden opgesteld.
    4. Het geconditioneerde medium van elk monster 24 h later verzamelen en opslaan van het medium bij-80 ° C voor ELISA.
    5. Loskoppelen van de cellen door ze te behandelen met 1 mL trypsine/EDTA-oplossing 0,05% en inactivering van de trypsine door toevoeging van 1 mL groeimedium bevattende 10 gewichtspercenten FBS. Het bepalen van de cel tellen voor de normalisatie van de ELISA-resultaten zoals beschreven in stap 5. Het oogsten van de cellen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min.
    6. Verwijder het medium door zachte zuigkracht en voeg 1 mL extractievloeistof RNA. Vervolgens de buis microcentrifuge krachtig gedurende 15 vortex s. Voeg daarna 200 µL van chloroform en krachtig vortex het mengsel opnieuw voor een extra 15 s.
    7. Centrifugeer het monster buizen bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Vervolgens zorgvuldig overbrengen in de bovenste fase een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.
      Opmerking: De interfase en de lagere organische fase moeten niet gestoord worden tijdens de overdracht van de bovenste fase aan een nieuwe buis.
    8. Voeg 400 µL van isopropanol te precipiteren RNA en meng ze door zachte inversie. Vervolgens de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten uit te broeden.
    9. Centrifugeer de buis bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Vervolgens Verwijder het supernatant, verzorgen te behouden van de RNA-pellet. Wassen van het RNA door toevoeging van 1 mL van 75% ethanol en omkeren van de buis 2 – 3 x. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 17.000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
    10. Droog de RNA-pellet bij kamertemperatuur en ontbinden van het RNA in 50 µL van diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-gedestilleerd water behandeld. Met behulp van 1 µL van RNA oplossing, de totale concentratie van RNA te kwantificeren met een spectrofotometer.
      Opmerking: Uitdrogen zal verminderen de oplosbaarheid van het RNA; daarom nooit uitdrogen van het RNA.
  2. cDNA voorbereiding
    1. Elk monster het omgekeerde-transcriptie reactiemengsel voorbereiden door toevoeging van de volgende handelingen uit in een PCR dunwandige buis: 2 µg totaal RNA (pas het volume aan 10 µL met RNase-gratis water), 2 µL van 10 x 1 µL van een willekeurige primer (50 pmol), 0.8 µL van 25 x dNTP mix (100 RT buffer mM), water 1 µL van MMLV reverse-transcriptase (50 U/µL), en 5.2 µL van RNase-vrij.
    2. Instellen van het omgekeerde transcriptie reactie programma op de thermische cycler met de volgende voorwaarden: 42 ° C gedurende 60 minuten en 95 ° C gedurende 5 min. plaats de PCR-buizen in het thermische cycler en start het programma.
  3. Real-time polymerasekettingreactie
    1. De real-time PCR master mix voorbereiden op alle reacties. Het reactiemengsel voor elk monster is als volgt: 25 µL van 2 x real-time PCR Master Mix, 1 µL van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor IL-6 of IL-8, en 21 µL van ultra zuiver gedestilleerd water (DNase - en RNase-gratis). Zie tabel 1.
      Opmerking: Het real-time PCR-reactiemengsel voorbereiden in elk monster met actine RNA inleidingen als een interne controle. GAPDH kan ook worden gebruikt als een interne controle voor normalisatie.
    2. 48 µL van master mix en 2 µL van 3-voudig verdunde cDNA product met water toevoegen aan elk putje in een 96-Wells optische qPCR plaat. Elke reactie in drievoud uitvoeren. Bereiden een controle goed dat niet de cDNA-sjabloon die een PCR-besturingselement bevat.
    3. Ingesteld dat real-time PCR reactie op de thermische cycler met de volgende voorwaarden: 10 min op 95 ° C, 40 cycli Duitsland15 s bij 95 ° C (denaturatie), en 1 minuut bij 60 ° C (gloeien en uitbreiding).
    4. Het uitvoeren van PCR in real time en opnemen van de drempelwaarde van de cyclus (CT) na de voltooiing van de cycli van PCR. Het berekenen van de mRNA niveaus voor IL-6 of IL-8 met behulp van de 2- ΔΔCΤ methode20.
      Opmerking: De verandering van de relatieve vouwen in expressie wordt bepaald na de normalisatie tot de actine-niveaus met behulp van de volgende formule:
      Vouw de verandering = 2-Δ (ΔCT)
      Hier,
      ΔCT = CT, IL-6 of IL-8- CT, actine; en
      Δ (ΔCT) = ΔCT, gestimuleerd- ΔCT, controle.
    5. De gemiddelde waarde berekend voor elk dubbele monster.
      Opmerking: qPCR moet worden herhaald onafhankelijk minstens 3 x, en de gemiddelde waarden moeten worden berekend op basis van deze resultaten. Vertegenwoordiger H-Ras-geïnduceerde senescentie resultaten worden weergegeven in Figuur 3. Serum honger veroorzaken de uitdrukking van de IL-6 en IL-8 mRNAs in sommige gevoelige cellen. Dus, de IL-6 en IL-8 mRNA uitdrukking in cellen gekweekt met en zonder serum honger moeten worden vergeleken in eerste instantie. Als serum honger significante veranderingen in de expressie van IL-6 of mRNA van IL-8 induceert, moeten de totale RNA voor qPCR en het geconditioneerde medium voor ELISA afzonderlijk worden opgesteld.

5. kwantificeren van de niveaus van Secreted IL-6 en IL-8 eiwitten voor een analyse van de secretoire fenotype senescentie-geassocieerde met behulp van ELISA

  1. Dooi de 3 mL van geconditioneerde medium geoogst van verouderend WI-38 cellen zoals beschreven in stap 4. Verwijderen puin van de cel door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min.
  2. Het geconditioneerde medium 10-fold concentreren door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 20 min met behulp van een centrifugaal filter eenheid.
    Opmerking: De concentratie van het geconditioneerde medium kan niet noodzakelijkerwijs afhankelijk het type monster.
  3. Het uitvoeren van de ELISA 50 µL van elke geconcentreerde steekproef van geconditioneerde medium met de passende IL-6 en IL-8 ELISA kits.
    Opmerking: Test elk monster in twee putjes van de ELISA. Omdat elk tijdstip wordt gedupliceerd in stap 4, kan deze analyse we controleren van variaties in zowel de ELISA-test en de sample voorbereiding techniek.
    1. ELISA plaat afdekhoes, Verdun de IL-6 of IL-8 met 1 x PBS tot een concentratie van 0,5 µg/mL antilichaam voor IL-6 of 0,125 µg/mL voor IL-8. Voeg 100 µL van de verdunde antilichamen aan elk putje van de ELISA-plaat. Afdichting van de plaat met een verzegeling film ELISA-plaat en zonder overnachting schudden bij kamertemperatuur incuberen.
    2. De antilichaam-oplossing verwijderen door aspiratie. Wassen van elke goed 4 x met 300 µL van het 1 x wassen buffer (0,05% Tween-20 in PBS). Voeg 300 µL van blokkeerbuffer (1% BSA in PBS) toe aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    3. Verwijder de blokkerende oplossing door aspiratie. Wassen elke goed 4 x met 300 µL van het 1 x wassen buffer. Bereiden serieel verdunde ELISA normen in een verdunning buffer (0,05% Tween-20 en 0,1% BSA in PBS) voor het genereren van een standaard curve.
      Opmerking: De seriële verdunning voor IL-6 is 31,25 62,5, 125, 250, 500, 1.000 en 2.000 pg/mL. De seriële verdunning voor IL-8 is 2.34, 4.69 9.38, 18,75, 37,5, 75 en 150 pg/mL.
    4. 100 µL van de standaardoplossing of 100 µL van de monsteroplossing (50 µL van geconcentreerde medium met 50 µL van verdunning buffer) toevoegen aan elk putje. Incubeer de putten bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    5. Verwijder de standaard of monster oplossing door aspiratie. Wassen elke goed 4 x met 300 µL van het 1 x wassen buffer. Verdun de detectieantilichaam met de verdunning buffer tot een concentratie van 0,1 µg/mL voor IL-6 of 0,25 µg/mL voor IL-8. Voeg 100 µL van het verdunde antilichaam per putje. Incubeer de putten bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    6. De antilichaam-oplossing verwijderen door aspiratie. Wassen elke goed 4 x met 300 µL van het 1 x wassen buffer. Streptavidine-horseradish peroxidase (HRP) in de buffer van de verdunning tot een concentratie van 0,05 µg/mL verdund. Voeg 100 µL van daar-HRP oplossing per putje. Incubeer de putten bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    7. De antilichaam-oplossing verwijderen door aspiratie. Wassen elke goed 4 x met 300 µL van het 1 x wassen buffer. Voeg 100 µL van 3, 3 ', 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) substraat oplossing aan elk putje. Incubeer de putten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten met het oog op ontwikkeling van de kleur. Zet de reactie stop door toevoeging van 100 µL van een stop-oplossing van 1 M HCl.
    8. Lees de extinctie van elk putje met een lezer van de ELISA bij 450 nm.
    9. Plot de standaard curve voor de gegenereerde normen. Berekenen van de concentraties van IL-6 en IL-8 in het geconditioneerde medium volgens de standaard curven. Plot de resultaten na een normalisatie aan de graaf van de cel. Berekenen van de gemiddelde waarden voor dubbele monsters.
      Opmerking: ELISAs moet worden herhaald onafhankelijk minstens 3 x, en de gemiddelde waarden moeten worden berekend op basis van deze resultaten (Figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een voorbeeld van H-Ras-geïnduceerde senescentie is weergegeven in Figuur 1. Een infectie van het normale menselijke fibroblasten WI-38 met de H-RasV12-retrovirus geïnduceerde dramatische morfologische veranderingen (figuur 1B). Bovendien, zoals blijkt uit Figuur 1 c, SA β-gal kleuring activiteit was opmerkelijk steeg op H-RasV12 expressie. Meer dan 70% van de cellen toonde SA β-gal kleuring activite...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we methoden voor controle van intracellulaire ROS niveaus tijdens H-Ras-geïnduceerde senescentie in WI-38 normale menselijke fibroblasten gepresenteerd. Intracellulaire ROS niveaus in levende cellen kunnen worden gemeten met behulp van de cel-permeabele reagens DCF-DA kwantitatief en stroom cytometry. Op cellulaire opname, is DCF-DA door intracellulaire esterasen deacetylated en vervolgens geoxideerd door ROS te vormen zeer fluorescerende 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF). DCF-fluorescentie kan worden gedetect...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Research Foundation Korea (2015R1D1A1A01060839) (voor de jonge Yeon Kim) en door een subsidie van de National Research Foundation van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea (MSIT) (nr. 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (tot op Jeanho Yun).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
poly-L-lysineSigma-AldrichP2636
BOSC 23ATCCCRL-11269
FBSGIBCO16000-044
penicillin/streptomycinwellgeneLS202-02
PBSHycloneSH30013.02
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM GIBCO31985-070
pBabe puro-H-RasV12 Addgene1768
pGAG/polAddgene14887
pVSVGAddgene1733
TurbofectThermo Fisher ScientificR0531
polybreneSigma-AldrichH92688 mg/mL
puromycinSigma-AldrichP88332 mg/mL 
formaldehydeSigma-AldrichF8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal)Sigma-AldrichB4252
potassium ferrocyanideSigma-AldrichB4252
potassium ferricyanideSigma-AldrichP9387
trypsin-EDTAwellgeneLS015-01
DCF-DASigma-Aldrich D688310 mM 
TrizolThermo Fisher Scientific15596026
MMLV Reverse transcriptasePromegaM1701
SYBR Green PCR master 2x mixTakaraPR820A
Random PrimerPromegaC118A
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Ultra-pure distilled waterInvitrogen10977015
Human IL-6 ELISA assayPeproTech#900-TM16
Human IL-8 ELISA assayPeproTech#900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μm syringe filtersartorius16555
ParafilmBEMIS PM-996
MicroscopeNIKONTS100
Flow cytometerBD BioscienceLSR Fortessa
Amicon Ultra-4mlMerk MilliporeUFC800324
NanoDrop spectrophotometerBioDrop80-3006-61
Real-time PCR SystemApplied BiosystemsABI Prism 7500
ELISA ReaderMolecular DevicesEMax microplate reader

Referenties

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642(2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190(2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Cellulaire senescentieH Ras ge nduceerde senescentieSA Beta gal kleuringflowcytometrieDCF DA kleuringreal time PCRELISA assay
Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.