Methodenartikel

Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt

DOI:

10.3791/57892

⸱

1 juni 2018

 ,  , 
1College of Environmental Science and Engineering, State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, Tongji University, 2UNEP-Tongji Institute of Environment for Sustainable Development, Tongji University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en fabriceren van een embryo van de zebravis arraying sjabloon, gevolgd door een gedetailleerde procedure op het gebruik van deze sjabloon voor hoge doorvoer zebrafish embryo arraying in een 96-wells-plaat.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis is dat een wereldwijd erkende zoetwater organisme vaak gebruikt in Ontwikkelingsbiologie, milieutoxicologie en ziekten bij de mens verwante onderzoeksterreinen. Dankzij haar unieke eigenschappen, met inbegrip van grote vruchtbaarheid embryo doorschijnendheid, snelle en gelijktijdige ontwikkeling, enz., zebravis embryo's worden vaak gebruikt voor grootschalige toxiciteit beoordeling van chemische stoffen en drug/compound screening. Een typische screeningprocedure omvat volwassen zebrafish kuitschieten, selectie van embryo's en de embryo's in multi goed platen arraying. Vanaf daar embryo's worden onderworpen aan blootstelling en de giftigheid van chemische of de doeltreffendheid van de drugs/verbindingen kan relatief snel op basis van fenotypische opmerkingen worden geëvalueerd. Onder deze processen is embryo's arraying een van de meest tijdrovend en arbeidsintensief stappen waarmee de doorvoer niveau wordt beperkt. In dit protocol presenteren wij een innovatieve benadering die maakt gebruik van een 3D-gedrukte arraying sjabloon in combinatie met vacuüm manipulatie om te versnellen deze moeizame stap. Het protocol hierin beschrijft de algemene opzet van de arraying sjabloon en een stapsgewijze procedure, gevolgd door representatieve resultaten en gedetailleerde experimentele opzet. Bij de uitvoering van moet deze aanpak voordelig blijken te zijn in een verscheidenheid van toepassingen van onderzoek gebruik van zebravis embryo's als het testen van onderwerpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als een populaire modelorganisme, wordt zebravis veel gebruikt op het gebied van geneeskunde en toxicologie1,2,3,4. Vergeleken bij in vitro platformen, zebravis bieden veel meer biologische complexiteit dat een of twee celtypes kunnen niet bieden. Naast een hele organisme model, van de zebravis grote vruchtbaarheid, snelle en gelijktijdige embryonale ontwikkeling en hoge orgel translucentie hebben gegeven de unieke voordelen van dit model worden gebruikt voor grootschalige toxiciteit of drugs/samengestelde screening van5. De honderden embryo's geproduceerd door een paar volwassen zebrafish elke week overtreffen elke andere hele diermodellen en het geschikt voor hoge throughput screening hebben gemaakt.

Een typische screeningprocedure met behulp van de zebravis impliceert een aanzienlijke hoeveelheid handenarbeid, zoals volwassen zebrafish kuitschieten, embryo selectie, en arraying embryo's in geschikte containers waar zij zijn onderworpen aan een blootstelling via water onderdompeling. De ontwikkeling van de embryo's wordt gecontroleerd en waarneembare eindpunten zoals sterfte en uitkomstpercentage abnormaliteit zijn vaak handmatig geëvalueerd en gebruikt als de voorlopige identificaties van de giftigheid van chemische stoffen of aanwijzingen voor de effectiviteit van drugs of verbindingen. Om te versnellen naar de screeningprocedure, werden benaderingen zoals geautomatiseerde beeldvorming en beeldanalyse computerondersteunde eerder onderzocht. Bijvoorbeeld, zijn microscopen met een hoog gehalte imaging mogelijkheden aangepast om te voeren geautomatiseerde helder-veld of fluorescentie imaging op zebrafish embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia van 96/384 goed platen6. Microfluidic apparaten in combinatie met microscopen werden gebruikt om de positie van de zebravis larven door manipulatie van de huidige voor beeldvorming van de hersenen neuronen7. Deze benaderingen kon aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de overnames van de afbeelding ten opzichte van traditionele handmatige bediening. Bovendien, met een groot aantal afbeeldingen wordt gegenereerd, beeld analyse gereedschappen zijn ook ontwikkeld om te versnellen naar de verwerking van de gegevens, zoals aangetoond door Liu et al. en Tu et al. 8 , 9.

Als het niveau van de doorvoer van beeldvorming en foto analyse toeneemt, werd het duidelijk dat de snelheidslimieten stap voor screening ligt bij de voorbereiding van de zebravis embryo's voor blootstelling, wat meestal betekent arraying hen in 96 - of 384-Wells-platen. Om op te lossen dit knelpunt stap, visie-geleide robotica werden ontwikkeld door Mandrell et al. 10 en ons11 eerder te vervangen manueel hanteren, maar de instrumenten waren nogal verfijnde en er is een diepe leercurve om dergelijke technieken. Daarom, om te zorgen voor een easy-to-use aanpak wordt een belangrijke factor om het niveau van de doorvoer van zebravis screening verder te verbeteren en is de belangrijkste doelstelling van dit werk.

In dit werk, we ontworpen en gefabriceerd van een embryo arraying sjabloon door 3D printen. Dergelijke een arraying sjabloon is ontworpen om het vangen van zebravis embryo in putten die bij een standaard 96-wells-plaat passen. In plaats van de selectie van embryo's en arraying hen in individuele put één voor één, kon één embryo entrapment en matrix alle 96 embryo's in een multiwall plaat tegelijk uitvoeren. Met behulp van deze sjabloon en het volgende protocol, kan een aanzienlijk verhoging van de efficiëntie van het arraying embryo's in multiwall platen, die zou in termijn boost de screening capaciteit ten minste vertienvoudigd, ten opzichte van handmatige bediening. De hieronder beschreven protocol bevat een totaalconcept voor de arraying sjabloon, zebravis kuitschieten, embryo's worden verzameld en arraying. Figuur 1 toont de algemene opzet van de arraying sjabloon. Figuur 2 geeft een overzicht van de stapsgewijze protocol over het gebruik van de sjabloon in delen 3 en 4 beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ontwerp en fabricage van een zebravis embryo's Arraying sjabloon

  1. Het arraying ontwerpsjabloon met een 12 door 8, 96-Wells lay-out die past bij een standaard 96-wells-plaat. Gebruik de afmetingen in figuur 1A voor de bovenste embryo entrapment kamer weergegeven (Zie ook het aanvullende bestand).
    1. De dimensies weergegeven in figuur 1B en 1 D voor de entrapment goed gebruiken.
    2. De dimensies in Figuur 1 c gebruiken voor het onder vacuüm kamer.
    3. De dimensies gebruiken in figuur 1B voor de lucht in / uitlaat.
  2. Gebruik van een 3D-printer (met de precisie van 0.1 mm) de sjabloon; Zie Tabel van materialen voor aanbevolen hars worden gebruikt voor het afdrukken.
    Opmerking: 3D printers met een precisie van 0.1 mm worden aanbevolen voor de fabricage van de arraying sjabloon (Zie Tabel van materialen). De voorgestelde kleur voor het oppervlak van de sjabloon is donkergrijs of zwart.

2. de zebravis Embryo kuitschieten

  1. Plaats twee paren van mannelijke en vrouwelijke vissen per paring vak één dag voordat het kuitschieten. Aparte mannetjes en vrouwtjes door een doorzichtige plastic verdeler.
  2. Opstijgen de scheidingslijnen in de ochtend te mengen van mannelijke en vrouwelijke vissen.
  3. Verwijder de mannelijke en vrouwelijke vissen en verzamelen zebrafish embryo's met behulp van een zeef fijn gaas. Wash de embryo's met ei van 250 mL water (Zie Tabel van materialen).
  4. De verzamelde embryo's overbrengen in petrischalen (diameter 90 mm) met Holtfreter de oplossing (Zie Tabel van materialen) en verwijderen van dode en onbevruchte embryo's met behulp van een stereomicroscoop.
  5. Plaats de embryo's in een 28,5 ° C incubator. 4 uur post bevruchting (hpf), observeren van de embryo's en verwijder eventuele dode en ongezonde embryo's. De embryo's zijn nu gereed voor de volgende stap.

3. voorbereiding van de sjabloon Arraying

  1. Wassen van de sjabloon 2 tot 3 keer met 500 mL gedeïoniseerd water en zet het in de droogstoof (45 ° C) gedurende 5 minuten.
  2. Tape de zaal van de bodem met een stuk van de sluiting van de film (Figuur 2stap 1).
  3. Sluit een vacuümpomp via de luchtuitlaat aan de onderkant van de sjabloon.
    Opmerking: De aanbevolen max vacuüm voor de vacuümpomp is 0,1 Mpa. Wees bewust van de kracht van het vacuüm gebruikt. Als de onderdruk te sterk is, een gat kruisvormig op de verzegeling film te verlagen van de druk.

4. arraying Zebrafish embryo's in een 96-wells-plaat

  1. Plaats met een kunststof transfer pipette, ongeveer 150 embryo's in de sjabloon, zoals aangetoond in Figuur 2,, stap 2.
  2. Sluit de vacuümpomp aan de luchtuitlaat voor het genereren van de negatieve druk in de zaal verzegeld door de verzegeling film in stap 3.3.
  3. Schud de hele sjabloon horizontaal totdat elk goed één embryo in de val gelokt (Figuur 2, stap 3 heeft).
    Opmerking: Als de Holtfreter van oplossing opdroogt voordat de embryo's in elk putje zitten, toevoegen van extra Holtfreter de oplossing in de entrapment zaal en herhaal deze stap.
  4. Extra Holtfreter de oplossing en embryo's die in de putjes (Figuur 2, stap 4) niet in de val zijn gelokt negeren.
  5. Uitschakelen en koppel de vacuümpomp.
  6. Plaats van een standaard 96-wells-plaat ondersteboven tegen de sjabloon (Figuur 2, stap 5) en draaien beide op hetzelfde moment (Figuur 2, stap 6).
  7. Tik op de bodem van de sjabloon of het verbinden van de lucht afzetmogelijkheid een samengeperst gas afstoffen kan voor het overzetten van alle gevangen embryo's van de sjabloon naar de 96-wells-plaat (Figuur 2, stap 6).
  8. Herhaal stap 4.1 tot 4.8 te bereiden extra multi goed platen.
  9. Verwijder de verzegeling film en wassen van de sjabloon 3 keer van boven naar beneden met 500 mL gedeïoniseerd water voor toekomstig gebruik.
    Opmerking: Gebruik geen organische oplosmiddelen, zoals ethanol, schoon van de sjabloon te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 3 toont een typische 3D-gedrukte arraying sjabloon. Deze sjabloon lichtgevoelige hars gebruikt als grondstof en werd gemaakt door een 3D-printer; een laag van zwarte verf was aangebracht om te zorgen voor een beter contrast met de kleur van embryo's. De positie van 96-wells (12 door 8) werd ontworpen om te passen met een standaard 96-wells-plaat. Ook een 384 (24 door 16) goed sjabloon konden ook worden ontworpen en vervaardigd gebruikend de zelfde meth...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn twee essentiële stappen in dit protocol die nauwlettend in de gaten voor een succesvolle implementatie van 3D-gedrukte sjabloon voor arraying zebrafish embryo's vereisen.

De meest belangrijke factor op het ontwerp van de arraying sjabloon is de entrapment goed. Maakt zeker er is slechts één embryo gevangen in elk putje, een moet aandacht besteden aan de diameter en de diepte van de put entrapment, en de diameter van het door gat. De aanbevolen diameter is binnen 1,5 tot 2 keer van de d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben een patent op de beschreven 3D-gedrukte sjabloon ingevuld.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door het "1000plan Youth"-programma, het opstarten middelen uit Tongji Universiteit en NSFC Grant # 21607115 en 21777116 (Lin).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Zebrafish FacilityShanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.Z-A-S5
Mating boxShanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 mlSangon BiotechF505001-0001
Sodium chlorideVetecV900058-500G
Potassium ChlorideSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10016318
Calcium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd20011160
Sodium bicarbonate Vetecv900182-500G
Methylene Blue HydrateTCIM0501
Hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10011008
Sea SaltsInstant OceanSS15-10
PipetterFisherbrand13-675M
Controlled Drop Pasteur PipetFisherbrand13-678-30
MicroscopeOLYMPUSSZ61
Biochemical incubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.LRH-250
3D printerUnionTechLite600
Photosensitive resinUnionTechUTR9000
Vacuum pumpShanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate SealsSolarbioYA0245
96 well plateCostar3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μlEppendorf3122000.051
Compressed Gas DusterShanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.ST1005
DI WaterThermoGenPure Pro UV/UF
Drying ovenShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.BPG-9106A
System waterWater out of the facility’s water system
Egg waterDilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solutionDissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
  3. Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
  4. Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
  5. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
  6. Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
  7. Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  8. Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
  9. Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
  10. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  11. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D geprint sjabloonhigh throughput screeningvacu manulatieembryo spawningembryoselectie96 wells plaatembryo trappingembryo overdrachtsterilisatie van sjabloon

Gerelateerde artikelen