Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en fabriceren van een embryo van de zebravis arraying sjabloon, gevolgd door een gedetailleerde procedure op het gebruik van deze sjabloon voor hoge doorvoer zebrafish embryo arraying in een 96-wells-plaat.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zebravis is dat een wereldwijd erkende zoetwater organisme vaak gebruikt in Ontwikkelingsbiologie, milieutoxicologie en ziekten bij de mens verwante onderzoeksterreinen. Dankzij haar unieke eigenschappen, met inbegrip van grote vruchtbaarheid embryo doorschijnendheid, snelle en gelijktijdige ontwikkeling, enz., zebravis embryo's worden vaak gebruikt voor grootschalige toxiciteit beoordeling van chemische stoffen en drug/compound screening. Een typische screeningprocedure omvat volwassen zebrafish kuitschieten, selectie van embryo's en de embryo's in multi goed platen arraying. Vanaf daar embryo's worden onderworpen aan blootstelling en de giftigheid van chemische of de doeltreffendheid van de drugs/verbindingen kan relatief snel op basis van fenotypische opmerkingen worden geëvalueerd. Onder deze processen is embryo's arraying een van de meest tijdrovend en arbeidsintensief stappen waarmee de doorvoer niveau wordt beperkt. In dit protocol presenteren wij een innovatieve benadering die maakt gebruik van een 3D-gedrukte arraying sjabloon in combinatie met vacuüm manipulatie om te versnellen deze moeizame stap. Het protocol hierin beschrijft de algemene opzet van de arraying sjabloon en een stapsgewijze procedure, gevolgd door representatieve resultaten en gedetailleerde experimentele opzet. Bij de uitvoering van moet deze aanpak voordelig blijken te zijn in een verscheidenheid van toepassingen van onderzoek gebruik van zebravis embryo's als het testen van onderwerpen.
Inleiding
Als een populaire modelorganisme, wordt zebravis veel gebruikt op het gebied van geneeskunde en toxicologie1,2,3,4. Vergeleken bij in vitro platformen, zebravis bieden veel meer biologische complexiteit dat een of twee celtypes kunnen niet bieden. Naast een hele organisme model, van de zebravis grote vruchtbaarheid, snelle en gelijktijdige embryonale ontwikkeling en hoge orgel translucentie hebben gegeven de unieke voordelen van dit model worden gebruikt voor grootschalige toxiciteit of drugs/samengestelde screening van
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. ontwerp en fabricage van een zebravis embryo's Arraying sjabloon
-
Het arraying ontwerpsjabloon met een 12 door 8, 96-Wells lay-out die past bij een standaard 96-wells-plaat. Gebruik de afmetingen in figuur 1A voor de bovenste embryo entrapment kamer weergegeven (Zie ook het aanvullende bestand).
- De dimensies weergegeven in figuur 1B en 1 D voor de entrapment goed gebruiken.
- De dimensies in Figuur 1 c gebruiken voor het onder vacuüm kamer.
- De dimensies gebruiken in figuur 1B
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 3 toont een typische 3D-gedrukte arraying sjabloon. Deze sjabloon lichtgevoelige hars gebruikt als grondstof en werd gemaakt door een 3D-printer; een laag van zwarte verf was aangebracht om te zorgen voor een beter contrast met de kleur van embryo's. De positie van 96-wells (12 door 8) werd ontworpen om te passen met een standaard 96-wells-plaat. Ook een 384 (24 door 16) goed sjabloon konden ook worden ontworpen en vervaardigd gebruikend de zelfde meth.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn twee essentiële stappen in dit protocol die nauwlettend in de gaten voor een succesvolle implementatie van 3D-gedrukte sjabloon voor arraying zebrafish embryo's vereisen.
De meest belangrijke factor op het ontwerp van de arraying sjabloon is de entrapment goed. Maakt zeker er is slechts één embryo gevangen in elk putje, een moet aandacht besteden aan de diameter en de diepte van de put entrapment, en de diameter van het door gat. De aanbevolen diameter is binnen 1,5 tot 2 keer van de d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben een patent op de beschreven 3D-gedrukte sjabloon ingevuld.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door het "1000plan Youth"-programma, het opstarten middelen uit Tongji Universiteit en NSFC Grant # 21607115 en 21777116 (Lin).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
Referenties
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017). ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
