Frequente staart-tip bloedmonsters in muizen voor de beoordeling van Pulsatiele luteïniserend hormoon afscheiding

Samenvatting

Hier presenteren we een staart-tip bloed bemonstering protocol voor frequente sample collectie in ongebreidelde muizen. Deze methode is nuttig voor het beoordelen van patronen van Pulsatiele luteïniserend hormoon afscheiding en voor analyse van andere circulerende factoren zou kunnen worden aangepast.

Samenvatting

In vele endocriene systemen, circulerende factoren of hormonen niet continu worden vrijgegeven, maar als een afzonderlijke puls in reactie op een releasing factor worden uitgescheiden. Single-point bemonstering maatregelen zijn ontoereikend is om de biologische betekenis van de secretoire patroon van Pulsatiele hormonen in normale fysiologische omstandigheden of onder vervoersomstandigheden disregulatie volledig te begrijpen. Luteïniserend hormoon (LH) wordt gesynthetiseerd door de anterieure hypofyse de gonadotrope cellen en uitgescheiden in een Pulsatiele patroon waarvoor frequente verzameling van bloedmonsters voor beoordeling van de pols. Dit niet mogelijk is geweest in muizen totdat onlangs, als gevolg van de ontwikkeling van een hoog-gevoeligheids LH-test en vooruitgang in een techniek voor frequente laag-volume sample collectie, oorspronkelijk beschreven door Steyn en collega's. ¹ hier beschrijven we een protocol voor de frequente perifeer bloed monster collectie van muizen met voldoende behandeling acclimatisatie te detecteren Pulsatiele secretie van LH. Het huidige protocol gegevens een uitgebreide acclimatisatie periode waarmee beoordeling van robuust en continue pulsen van LH over meerdere uren. In dit protocol, het puntje van de staart is geknipt en bloed wordt verzameld uit de staart met behulp van een precisiepipet hand-held. Voor de beoordeling van Pulsatiele LH in gonadectomized muizen, seriële monsters worden verzameld elke 5-6 min voor 90-180 min. nog belangrijker is, de inzameling van bloed en meting van robuuste pulsen van LH kunnen worden bereikt in wakker, vrij gedragend muizen, passende behandeling gegeven acclimatisatie en inspanning om te minimaliseren milieustressoren. Voldoende acclimatisatie kan binnen 4-5 weken voorafgaand aan de bloedinzameling worden bereikt. Dit protocol onderstreept voorschotten in de methodologie om bloed monsters voor evaluatie van Pulsatiele LH secretie patronen over meerdere uren in de muis, een krachtige diermodel voor neuro-endocriene onderzoek.

Inleiding

Gonaden functie bij zoogdieren is afhankelijk van choriongonadotrofine secretie, luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon, uit de hypofyse. De gonadotrofinen worden uitgescheiden in een gepulseerde of Golf patroon in reactie op de hypothalamische secretie van gonadotropin - releasing hormone (GnRH). De synthese en secretie van zowel LH als FSH worden geregeld via een actie van de verstoringen van de hormoonhuishouding, paracrine en autocrine uit een aantal moleculen met inbegrip van hypothalame GnRH, gonadale steroïde hormonen, en de activin-inhibine-follistatin systeem, evenals een groot aantal fysiologische omstandigheden, waaronder stress en energiebalans. ²

Het Pulsatiele patroon van LH in het bloed vloeit voort uit een nogal abrupte lozing van LH in perifeer bloed, gevolgd door ongeveer exponentiële eliminatie. Belangrijke kenmerken van het patroon zijn de frequentie van elke LH kwijting en de amplitude van de LH-reactie, die beide worden gedicteerd, gedeeltelijk door de release van GnRH. Due to de moeilijkheid bij het verzamelen van hypothalame-hypofyse portal bloed voor meting van Pulsatiele GnRH, de monsterneming en de meting van het LH wordt gebruikt als een proxy voor GnRH regulering van de hypothalamische-hypofyse-gonadale as. Daarom is kritieke informatie gecodeerd in de frequentie en amplitude van LH pulsen, die uit een enkelvoudige steekproef kan niet worden bepaald.

Analyse van Pulsatiele LH secretie van oudsher beperkt tot grote zoogdieren (mens, primaten en schapen) te wijten aan hun grote bloed volume en tolerantie voor frequente bloed monster collectie. Bij knaagdieren, frequente bloedmonsters was beperkt tot de rat en bereikt via inwoning atriale katheter. ^{3 , 4} de relatief lage kosten en beschikbaarheid van genetische (bijvoorbeeld cre-lox, CRISPR) en complexe neurale (b.v. optogenetics, chemogenetics) manipulaties maken muizen een aantrekkelijk model-organisme; verwezenlijking van frequente bloedmonsters en na diverse analyses van LH concentraties heeft echter tot onlangs bewezen ongrijpbaar. Deze monumentale taak was gepionierd door Steyn en collega's. ¹ sinds dan, verschillende labs zijn begonnen om frequente bloedmonsters en ultra gevoelige LH-testen om te beoordelen Pulsatiele LH secretie in een verscheidenheid van experimentele paradigma's te gebruiken. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} opgemerkt moet worden dat het nastreven van een praktische manier van het verzamelen van meerdere bloedmonsters van muizen is geweest in de vooruitgang van ten minste 40 jaar¹⁰ met meerdere verfijningen gemaakt langs de weg. ^{11 , 12}

Beoordeling van LH pulse patronen (d.w.z. frequentie en amplitude) vertegenwoordigt een grote verfijning bij het toezicht op basale gonadotrofinen secretie in dit genetisch hanteerbare diermodel. Traditioneel, werden LH concentraties in muizen vastgesteld in een enkel bloedmonster. Een zwak punt van single-point monsters is een zeer variabel gegevensverzameling omdat LH concentraties natuurlijk tijdens elke puls schommelt zijn. Een ander zwak punt is dat geïsoleerd metingen inherent kritische informatie die door de patronen van de LH secretie van de pols missen. Dus, een methode voor het verzamelen van frequente bloedmonsters in vrij gedraagt, ongebreidelde muizen (met uitzondering van zachte behandeling gedurende de bemonstering) zal voorzien van uitgebreide informatie en nuttig zijn voor veel laboratoria onderzoeken Pulsatiele hormoon verordening.

Hier beschrijven we een protocol voor het verzamelen van frequente (elke 6 min) bloed monsters van wakker, ongebreidelde muizen. Nog belangrijker is, ook een afhandeling acclimatisatie protocol waarmee robuuste en continu detectie van Pulsatiele LH secretie in volbloed monsters verzameld een lengte van tijd waarin pre-en post beoordeling aan een acute uitdaging kan worden vastgesteld, zoals de reactie op de psychosociale stress van immobilisatie en terughoudendheid. Een effectieve assay voor LH concentraties van monsters van volbloed is bestempeld eerder; ¹ die dit protocol is gericht op een methode voor het verzamelen van de bloedmonsters voor LH polsmeting.

Protocol

De hier beschreven methode is in overleg met de nationale instituten van gezondheid Animal Care en de richtsnoeren voor het gebruik en door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de University of California, San Diego zijn gemachtigd.

1. de acclimatisatie aan behandeling

1. Afhandelen van de procedure
   1. Plaats de muis kooien in het biosafety kabinet. Verwijder de eerste muis uit de kooi en de plaats op een daartoe geschikte werkvloer (bijvoorbeeld een schone kooi deksel) binnen het biosafety kabinet.
   2. Zachtjes de muis op het werkvlak te beperken door de basis van de staart met de wijsvinger en de duim van één hand te houden. Vervolgens stevig beroerte het ventrale oppervlak van de staart, vanaf de basis naar het uiteinde van de staart, met de wijsvinger en de duim van de andere hand. Herhaal dit streelde 6 keer (dat wil zeggen 1 set) en de muis terug te keren naar haar kooi.
   3. 6 min wachten en herhaalt u stap 1.1.2.
      Opmerking: In totaal stap 1.1.2 zal herhaald worden 4 keer per muis (dat wil zeggen 4 sets van 6 lijnen), zodat elke muis een totaal van 24 lijnen van de staart op elke dag van de behandeling krijgt.
2. De frequentie van de dagelijkse afhandeling
   1. Verwerken van vijf tot twee weken vóór de geplande bloed collectie dag, muizen zoals beschreven in stap 1.1, vijf dagen per week (muizen worden niet behandeld op zaterdag of zondag tot de laatste twee weken van acclimatisatie).
   2. Als experimentele behandeling gedurende de bemonstering extra behandeling (bijvoorbeeld scruffing of intraperitoneale injectie) opneemt zal, acclimatiseren de muizen aan deze behandeling activiteit tijdens de sessie van elke behandeling.
      Opmerking: Voor acclimatisatie aan injectie procedures, gebruiken een afgestompte naald voor het uitvoeren van een schijnvertoning injectie.
   3. Tijdens de twee weken vóór de geplande bloed collectie dag, muizen te behandelen zoals beschreven in punt 1.1, zeven dagen per week.
   4. Ten minste twee weken vóór de geplande bloed collectie dag, huis muizen in paren om te minimaliseren van onderbrekingen van de muizen gedurende de bemonstering.

2. voorbereiding van de bloedinzameling buizen

1. Ultrasensitive LH assay buffer in een glazen fles bereiden: 0,2% bovien serumalbumine en 0,05% Tween-20 in PBS [0.2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g nb₂HPO₄ (watervrij), 0,24 g KH₂PO₄, ultrazuiver water tot 1 L, pH 7.4, filter en autoclaaf] , bewaren bij 4° C. ¹
   Opmerking: Volume van ultrasensitive LH assay buffer worden voorbereid kan worden berekend op basis van het aantal monsters en het volume per monster zoals hieronder (2.2 & discussie)
2. Bereiden bloed collectie buizen (0,6 mL microcentrifuge buizen). Label buizen en aliquoot assay buffer (57 µL van buffer per buis; Let op, dit volume kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid bloed, verzameld of de verhouding van het bloed aan de buffer gewenst). Buizen kan worden bereid dagen vóór de bemonstering, bewaren bij 4 ° C.

3. de bloedinzameling

1. Voorbereiding van bloed collectie materialen.
   1. Bioveiligheid kabinet voorbereiden voor gebruik en regelen de volgende materialen in de motorkap of op een kar in de buurt: 10 µL Pipetteer (ingesteld op 3 µL of gewenste bloed collectie volume), Pipetteer tips, afval bak voor gebruikte Pipetteer tips, timer, afdruk met dierlijke cijfers en getallen () monster voor de noten met betrekking tot bemonstering of dier) wordt ijs emmer met bloed collectie buizen, schaar en kleine gaas (2 "x 2").
      Opmerking: De "tellen" functie op een laboratorium timer is handig omdat het geen een hoorbaar alarm dat de muizen verstoren kan
   2. Gebruik een permanent marker te markeren de staart van elke muis (in de buurt van de basis) om te helpen met snelle identificatie van de juiste muis gedurende de bemonstering.
2. Knippen van de staart en pre bloed collectie voorbereiding.
   1. 45 min voor aanvang van de bloedinzameling, het verwijderen van de eerste muis uit zijn kooi en plaats op een daartoe geschikte werkvloer (een schone kooi deksel werkt goed) binnen het biosafety kabinet.
   2. Gebruik van scherpe, steriele schaar voor het verwijderen van 1-2 mm van het uiteinde van de staart van de muis, na aseptische voorbereiding (d.w.z. schrobben met alcohol en betadine).
      Opmerking: Dit kan worden bereikt in wakker dieren met zachte terughoudendheid of onder Isofluraan verdoving.  Bovendien, kan analgesie worden verleend na de aanbeveling van de lokale IACUC.
   3. Zorgvuldig omlijnen de staart van de muis zoals hierboven beschreven (1.1.2; 1-2 lijnen zijn over het algemeen voldoende) tot de druppel bloed vormen op het puntje van de staart.
   4. Gebruik een pipet met een schone tip te verzamelen 3 µL bloed vanaf de punt van de staart en negeren het uiteinde van de pipet met bloed.
   5. Voordat u de muis terugkeert naar zijn kooi, zorgen ervoor dat de bloedtoevoer is gestopt. Indien nodig, toepassing zachte druk met een steriel gaas.
   6. Herhaal stap 3.2.1 - 3.2.5 voor alle muizen. Latere bloedmonsters kunnen worden verzameld door stevig strelen van de muis staart tot een druppel bloed vormen op het puntje van de staart.
      Opmerking: Als een druppel bloed geen na stevige lijnen vormt, de staart kan worden aangebracht met een gaas-zeem gedrenkt in een zoutoplossing. Stolsels hebben meer kans op formulier gedurende de minder frequente bemonstering (d.w.z. > 15 min. intervallen). Zodra de klonter wordt gewist uit de ader, kunt bemonstering doorgaan.
   7. Doorgaan met het verzamelen van 3 µL bloed van elke muis als beschreven boven elke 6 min voor ongeveer 45 min in deze pre bloedinzameling voorbereidingsperiode. Gooi de bloed en Pipetteer tip.
3. Bloedmonsters
   1. 3 µL bloed ophalen op het puntje van de staart zoals hierboven beschreven. Nemen voorzichtigheid om ervoor te zorgen dat het hele 3 µL monster is genomen in het uiteinde van de Pipet (zonder bubbels of beddengoed besmetting). Werpen het bloedmonster in de buffer van de bepaling in een gelabelde buis. Meng door inversie en terug te keren van de buis aan ijs.
   2. Voordat u de muis terugkeert naar zijn kooi, zorgen ervoor dat de bloedtoevoer is gestopt. Indien nodig, toepassing zachte druk met een steriel gaas.
   3. Herhaal stap 3.3.1 - 3.3.2 voor elke muis, elke 6 min, voor de duur van de vooraf bepaalde bemonstering. Elk dier voor tekenen van nood (bijvoorbeeld gedeeltelijk gesloten oogleden, gebogen positie [niet veroorzaakt door andere behandeling] of gebrek aan respons op behandeling) controleren en beëindigen van bemonstering, indien nodig.
      Opmerking: Behavioral nood of andere complicaties waarvoor beëindiging van bemonstering komen zeer zelden in ons laboratorium.
   4. Als de dieren zijn niet euthanized na bloedmonsters, zorgen ervoor dat de doorbloeding van de staart-tip volledig is gestopt. Veeg eventuele gemorst bloed vanaf de binnenkant van de kooi van elk dier (of verandering kooien) en de dierlijke kooien terug te keren naar het rack behuizing.

4. genieten van de verwerking en analyse

1. Bewaren van bloedmonsters bij-20 ° C tot analyse.
   Opmerking: LH is vehiculumcontrolegroep in volbloed monsters verdund in assay buffer; geen scheiding van de sera of plasma is vereist voorafgaand aan opslag of analyse.
2. Assay bloedmonsters door ultrasensitive ELISA als eerder beschreven¹ en verslag waarden in ng/mL bloed na correctie voor verdunning van het monstervolume in de buffer assay.
3. Identificeren van LH pulsen in de gegevensset. Berekenen en vergelijken van de amplitude van de gemiddelde hartslag en pulse frequentie (of inter pulsinterval) in voorkomend geval voor de gegevensset.
   Opmerking: Gepubliceerde criteria^13,14 en programma's,^15,,¹⁶ voor het opsporen van LH pulsen zijn beschikbaar.

Resultaten

Representatieve LH pulse patronen van 4 muizen worden weergegeven in Figuur 1 (gegevens herdruk van Yang et al., 2017). LH werd gemeten in frequente bloedmonsters om te bepalen het antwoord op de uitdaging van een acute psychosociale stress. Volwassen vrouwelijke C57/Bl6 muizen waren ovariectomized en behandeld zoals beschreven in dit protocol voor frequente bloed collectie. Bloedmonsters werden verzameld gedurende de eerste 90 min. in alle dieren va...

Discussie

Hier beschrijven we een protocol voor frequente bloedinzameling volbloed staart-tip monsters voor evaluatie van Pulsatiele LH secretie in muizen. Dit protocol maakt het verzamelen van monsters voor detectie van acute veranderingen in Pulsatiele LH secretie na blootstelling aan psychosociale stress en is geschikt voor de beoordeling van LH pulsen onder andere acute of chronische manipulaties.

Een essentieel onderdeel van dit protocol voor het bereiken van betrouwbare en robuuste profielen van L...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Gezuiverd en gefilterd water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Niet noodzakelijk voor bloedafname, maar werd gebruikt bij het verzamelen van representatieve gegevens.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001