Methodenartikel

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

DOI:

10.3791/57901

⸱

21 oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol laat zien hoe een model met een lage resolutie ab initio en structurele details van een wasmiddel-ontbindend membraan eiwit in small-angle neutron scattering met contrast-matching van het detergent oplossing te verkrijgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De biologische small-angle neutron scattering instrument bij de High-Flux isotoop Reactor van Oak Ridge National Laboratory is gewijd aan het onderzoek van biologische materialen, verwerking biobrandstoffen en bio-geïnspireerde materialen ter bekleding van nanometer te micrometer lengte schalen. De methoden die hier gepresenteerd voor het onderzoek van de fysische eigenschappen (dat wil zeggen, de grootte en vorm) van membraaneiwitten (hier, MmIAP, een intramembrane aspartyl protease vanaf Methanoculleus marisnigri) in oplossingen van micel-vormende wasmiddelen zijn zeer geschikt voor deze small-angle neutron scattering instrument, onder anderen. Andere biofysische karakterisering technieken worden belemmerd door hun onvermogen om aan te pakken van het wasmiddel bijdragen in een complexe structuur van de proteïne-wasmiddel. Daarnaast biedt toegang tot de Bio-Deuteration Lab unieke mogelijkheden voor de voorbereiding van grootschalige teelten en uiten van deuterium-geëtiketteerden eiwitten voor verbeterde verstrooiing signaal van het eiwit. Terwijl dit techniek biedt geen structurele details in hoge resolutie, de structurele kenniskloof voor membraaneiwitten bevat vele adresseerbare onderzoeksgebieden zonder in de buurt van de atomaire resolutie. Bijvoorbeeld, deze gebieden bepaling van oligomere Staten, complexvorming, conformationele wijzigingen tijdens perturbation, en vouwen/ontvouwen evenementen te omvatten. Deze onderzoeken kunnen gemakkelijk worden bereikt door de toepassingen van deze methode.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten worden gecodeerd door een naar schatting 30% van alle genen1 en vertegenwoordigen een grote meerderheid van de doelen voor de moderne geneesmiddelen. 2 deze eiwitten voeren een breed scala van vitale cellulaire functies,3 maar ondanks hun overvloed en belang — vertegenwoordigen slechts ongeveer 1% van de totale structuren die zijn neergelegd in de voor structurele Bioinformatics (RCSB) eiwit Collaboratory onderzoek Gegevens Bank. 4 vanwege hun gedeeltelijk hydrofobe aard, structurele bepaling van membraan-gebonden eiwitten is buitengewoon uitdagende. 5 , 6 , 7

Zoals vele biofysische technieken monodispers deeltjes in oplossing voor meting vereisen, isoleren van membraaneiwitten van inheemse membranen en het stabiliseren van deze eiwitten in een oplosbare nabootsen van de inheemse membranen geweest een actief gebied van het onderzoek in de afgelopen decennia. 8 , 9 , 10 deze onderzoeken hebben geleid tot de ontwikkeling van vele nieuwe amfifiele samenstellingen aan membraaneiwitten, zoals nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 solubilize en amphipols. 16 , 17 het gebruik van detergenten micellen blijft echter een van de meest voorkomende en eenvoudige manieren om te voldoen aan de eisen van de oplosbaarheid van een bepaald eiwit. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 helaas geen enkele wasmiddel of magische mengsel van detergentia momenteel bestaat die voldoet aan alle membraaneiwitten; Dus, deze voorwaarden moeten empirisch worden gescreend voor de unieke vereisten van elke proteïne. 26 , 27

Detergentia monteren zelf in oplossing boven hun kritische micel concentratie aan statistische structuren vorm genaamd micellen. Micellen zijn samengesteld uit vele wasmiddel monomeren (meestal variërend van 20-200) met hydrofobe alkyl-ketens vormen een micel kern en hydrofiele kop groepen gerangschikt in een micel shell laag geconfronteerd met de waterige oplosmiddelen. Het gedrag van detergentia en micel vorming is klassiek beschreven door Charles Tanford in The hydrofobe Effect,28 en maten en vormen van micellen van veelgebruikte detergentia in membraan eiwit studies zijn gekenmerkt met behulp van kleine-hoek verstrooiing. 29 , 30 wasmiddel organisatie over membraaneiwitten is ook onderzocht, en de vorming van eiwit-wasmiddel complexen (PDC's) met wasmiddel moleculen rond het eiwit in een rangschikking die lijkt op het keurige wasmiddel wordt verwacht micellen. 31

Een toegevoegd voordeel bij het gebruik van detergentia is dat de resulterende micel eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd door de integratie van andere detergentia. Veel detergenten vertonen ideale mengen, en selecteer Eigenschappen van gemengde micellen kunnen zelfs worden voorspeld op grond van de onderdelen en de verhouding van het mengen. 22 echter de aanwezigheid van wasmiddel kan nog presenteren uitdagingen voor biofysische karakterisaties door bij te dragen aan de algehele signaal. Bijvoorbeeld met x-stralen en lichtverstrooiing technieken is signaal van wasmiddel in de PDC vrijwel niet te onderscheiden van eiwit. 32 onderzoeken met single-deeltje cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) meestal rekenen op gevangen (bevroren) deeltjes; structurele details van het eiwit zijn nog steeds verduisterd door bepaalde wasmiddelen of een hoge concentratie van wasmiddel die wordt toegevoegd aan de achtergrond. 33 alternatieve benaderingen naar het interpreteren van de volledige structuur van de PDC (met inbegrip van het wasmiddel) zijn aangebracht door middel van computationele methoden die willen reconstrueren het wasmiddel rond een bepaald membraan eiwit. 34

Voor het geval van neutronen verstrooiing produceert de rangschikking van de kern-shell van wasmiddel in de micel een form-factor die tot de waargenomen verstrooiing bijdraagt. Gelukkig, kunnen oplossing onderdelen worden gewijzigd, zodat ze niet aan de netto waargenomen verstrooiing bijdragen. Dit proces van "contrast overeenkomende" wordt bereikt door het vervangen van deuterium voor waterstof te bereiken een verstrooiing lengte dichtheid die overeenkomt met de achtergrond (buffer). Een verstandige keuze van wasmiddel (met beschikbare Halfzwaar tegenhangers) en hun verhouding van mengen moeten worden beschouwd. Voor detergentia micellen, kan deze vervanging worden uitgevoerd met een sopje met dezelfde hoofd groep maar met een Halfzwaar alkylketen (d-staart in plaats van h-staart). Aangezien de detergentia goed gemengd zijn,35 hun aggregaten zal een soortelijke massa hebben verstrooiing lengte die is de mol-fractie gewogen gemiddelde van de twee componenten (h vliegengordijn en d vliegengordijn). Wanneer dit gemiddelde contrast consistent met die van de hoofd groep is, kunnen de uniforme statistische structuren gekoppeld worden volledig als u wilt verwijderen van alle bijdragen aan waargenomen verstrooiing.

Wij presenteren hier een protocol om te manipuleren het neutron contrast van wasmiddel micellen door integratie van chemisch identiek wasmiddel moleculen met deuterium-geëtiketteerden alkyl ketens. 19 , 36 , 37 dit toestaat volledige gelijktijdige contrast matching van micel kern en shell, dat een unieke mogelijkheid van neutronen verstrooiing is. 35 , 38 met deze aanzienlijk verfijnd detailniveau, contrast bijpassende kunnen anders onhaalbaar studies van membraan eiwit structuren. Bovendien, kan deze contrast-matching aanpak worden uitgebreid naar andere systemen waarbij wasmiddel, zoals polymeer uitwisseling reacties39 en olie-water dispergeermiddelen,40 of zelfs andere solubilizing agenten, zoals bicelles,41 nanodiscs,42 of blok copolymeren. 43 A vergelijkbare aanpak zoals omschreven in dit manuscript, maar het tewerkstellen van een enkele wasmiddel soorten met gedeeltelijke deuterium substituties op de alkyl-keten en/of hoofd-groep, werd onlangs gepubliceerd. 37 terwijl dit verwacht kan worden dat de willekeurige verdeling van waterstof en deuterium gedurende het wasmiddel verbeteren ten opzichte van de hier gepresenteerde benadering het beperkte aantal beschikbare posities over het wasmiddel voor vervanging en in twee stappen wasmiddel synthese vereist poses extra uitdagingen voor behandeling.

Stap 1 en 2 van het protocol hieronder vaak overlappen omdat eerste experiment plannen gebeuren moet een kwaliteit wijzigingsvoorstel in te dienen. Indiening van het voorstel is echter hier als de eerste stap om te benadrukken dat dit proces ruim van tevoren een neutron experiment moet worden gestart. Ook opgemerkt moet worden dat een vereiste stap, die moet worden aangetoond door het voorstel, is dat de biochemische en fysische karakterisering (met inbegrip van de zuiverheid en stabiliteit) van het monster ter ondersteuning van de noodzaak van studies van de neutron. Een algemene discussie van small-angle neutron verstrooiing (SANS) valt buiten het bestek van dit artikel. Een korte maar grondige inleiding is beschikbaar in het referentiewerk Karakterisering van materialen door Kaufmann,44 en een leerboek gericht op biologische kleine-hoek totaaloplossing verstrooiing is onlangs verschenen. 45 meer aanbevolen lectuur wordt verwezen in de sectie discussie. Kleine hoek verstrooiing gebruikt de zogenaamde verstrooiing vector Q als het centrale aantal dat het proces van de verstrooiing beschrijft. Dit artikel maakt gebruik van de algemeen aanvaarde definitie Q = 4π zonde (θ) / λ, waar θ de helft van de hoek tussen inkomende en verspreide lichtbundel en λ is de golflengte van de neutronenstraling in Angstroms is. Andere definities bestaan dat gebruik verschillende symbolen zoals de ' voor de verstrooiing vector, en die verschillen kunnen met een factor 2π of met behulp van nanometer in plaats van Angstrom (Zie ook bespreking van Figuur 10).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding en indiening van een Neutron faciliteit Beam tijd en een Instrument voorstel

  1. Raadpleeg online bronnen voor het identificeren van neutronen verstrooiing voorzieningen waarmee algemene neutron lichtbundel tijd gebruikerstoegang, zoals Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Een kaart van neutron faciliteiten en informatie over neutron onderzoek wereldwijd is online beschikbaar. 46 worden zich ervan bewust dat deze voorzieningen meestal regelmatig oproepen tot voorstellen; Hiermee bepaalt u wanneer de volgende keer dat lichtbundel beschikbaar zal zijn. Neutronen zijn gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen; Zoekresultaten voor small-angle neutron scattering (SANS) instrumenten, met name die met mogelijkheden voor biologische monsters.
  2. Middelen die van de neutron faciliteiten gebruiken om te helpen navigeren het verzendproces neutron lichtbundel tijd voorstel. Neem contact op met een Neutron Scattering wetenschapper (NOD's) die is gekoppeld aan het instrument waarop u van toepassing zal zijn. Herziening van de faciliteit van het neutron actuele informatie met betrekking tot het voorstel dringt, deadlines en advies voor indiening; voor Oak Ridge is dit online beschikbaar. 47 de lichtbundel tijd voorstel volgens alle richtlijnen voor een succesvolle inzending indienen.
  3. Als Halfzwaar eiwit is vereist (zie 2.2), worden neutronen verstrooiing faciliteiten vaak ondersteund door laboratoria en expertise gewijd aan de productie van Halfzwaar materialen. Als u wilt verzoeken om toegang tot de Lab (BDL) van de Bio-Deuteration op ORNL, selecteer de BDL als het tweede instrument in het voorstel-systeem. Terwijl het voorstel van de SANS is herzien voor haalbaarheid en door een wetenschappelijke overwegingscommissie, worden BDL verzoeken alleen gescreend voor haalbaarheid. Om te helpen met de evaluatie van de haalbaarheid BDL, dienen een ingevulde informatie aanvraag formulier48 die het eiwit expressie protocol en de geschatte opbrengst beschrijft (beschikbaar online).
  4. Na succesvolle peer-review van het voorstel van de tijd van de bundel, de toegekende datum lichtbundel tijd voorafgaand aan het experiment worden bevestigd. Zorg ervoor dat alle monster en buffer gegevens en formules correct worden vermeld in het voorstel voor een goede beoordeling. Wijzigingen in de voorgestelde proefopzet, met inbegrip van wijzigingen in de samenstelling van de steekproef en buffer, eisen mededeling van de faciliteit.
    Opmerking: Wijzigingen moeten zo spoedig mogelijk met de toegewezen NSS worden besproken.

2. Bepaal Neutron Contrast Match punten en het nodige Contrast voor eiwit meting

  1. Verzamel informatie (van leverancier van productinformatie online databanken, gepubliceerde waarden, enz.) met betrekking tot de atomaire composities en volumes voor het wasmiddel systeemonderdelen contrast-gepaard gaan. Deze informatie wordt gebruikt om te bepalen van neutronen verstrooiing lengte dichtheden (SLDs) en dus contrast match punten (CMPs) in oplossing, die is van cruciaal belang voor het verkrijgen van kwaliteit SANS gegevens en structurele informatie voor het membraan eiwit van belang in de context van een PDC. Een tabel samen te vatten de fysieke eigenschappen en contrast match punten voor detergentia gebruikte in biofysische studies van membraaneiwitten is opgenomen (tabel 1).
  2. Neutron SLDs met behulp van de web-applicatie MULCh bepalen: ModULes voor de analyse van Contrast variatie gegevens49 (beschikbaar online50 -gratis). Een link naar de Gebruikershandleiding bevindt zich op de home page. Toegang tot de website en lees de begeleidende documentatie. Figuur 1 en Figuur 2 geven een overzicht van Contrast module input en output voor twee verwante voorbeelden.
    Opmerking: Andere websites voor de berekening van SLDs zijn beschikbaar, zoals degene die worden onderhouden door het National Institute of Standards and Technology (NIST) Center voor Neutron onderzoek. 51
    1. De Contrast-module openen door te klikken op 'Contrast' gelegen in het linker navigatievenster. Tekst voor de projecttitel van een opgeven en voer hieronder voor twee componenten (BV, wasmiddel hoofd groep en staart) als ' subeenheid 1' en ' subeenheid 2'.
    2. De molecuulformule voor elk onderdeel in het tekstvak 'Formule' invoeren.
      Opmerking: het keuzerondje ben ' onder 'Stof Type' moet worden geselecteerd om een moleculaire formule invoeren. Bovendien gebruiken de letter 'X' in de formule om aan te geven gemakkelijk uitwisselbaar waterstofatomen. Eiwitten, RNA of DNA sequenties kunnen worden ingevoerd als de overeenkomstige 'P', 'R', of waren ' keuzerondjes worden geselecteerd. Als meerdere exemplaren van een onderdeel binnen de subeenheid bestaan, kan de waarde voor 'Nmolecules' dienovereenkomstig worden gewijzigd. Een praktisch voorbeeld hier betreft lipide-achtige detergenten die twee identieke staarten, waardoor de formule voor een staart worden geboekt met de Nmolecules gelijk is aan 2.
    3. Geef het volume in kubieke Angstroms voor elk onderdeel in het vak onder 'Volume (Å3)'. Gebruik van de Tanford formule28 voor alkyl kettingen van lengte n, Vstaart = 27,4 + n * 26,9, geschatte staart volume berekenen, of het verkrijgen van moleculaire volumes van productinformatie verstrekt of waarden in gepubliceerd de literatuur.
    4. Voer voor de onderdelen van de buffer. Wijzigen van de 'nummer ontbonden soorten in het oplosmiddel' via het dropdownmenu toevoegen of verwijderen van rijen voor elk onderdeel van de buffer. In het geval van micel-vormende detergentia, omvatten de gratis wasmiddel monomeren als aparte buffer onderdelen van het wasmiddel critical micelle concentratie (CMC).
    5. Klik op 'Verzenden' om het neutron contrast berekeningen uitvoeren en het genereren van een resultatenpagina waarmee een tabel van verstrooiing lengte dichtheid en contrast match punten, alsmede de formules voor het bepalen van deze parameters op een bepaald percentage voor D2O in de buffer. Bekijk de verstrooiing parameters met bijzondere aandacht voor de component CMPs. Als de wedstrijd punten (binnen 10% D2O lijken) en de gratis micel concentratie laag is, dan de gemiddelde CMP kan worden gebruikt voor de aanpassing van contrast het wasmiddel bijdragen. In de meeste gevallen zal de CMP van het wasmiddel hoofd groep en staart verschillen met meer dan 10-15% produceren van een kern-shell form factor in de SANS-gegevens die directe collectie van het signaal van de verstrooiing van het alleen eiwit camoufleren.
  3. Het contrast tussen wasmiddel hoofd groep en staart te beoordelen. Wanneer de wasmiddel hoofd groep en alkyl keten staart CMPs zijn niet goed afgestemd, kunnen de beschikbaarheid en de opneming van een detergens deuterium-gesubstitueerde toestaan verstrooiing lengte dichtheden van select componenten worden gemanipuleerd. In de meeste gevallen zal hiervoor vormen een gemengde micel door middel van de opneming van een identieke wasmiddel met deuterium-gesubstitueerde alkyl ketens. De toevoeging van deuterium verhoogt de verstrooiing lengte dichtheid van de kern gevormd door de staarten van alkyl keten. Het gewenste eindpunt, is in dit geval zodanig dat het hoofd groep shell CMP en de kern van de keten alkyl CMP ongeveer gelijke waarden hebben.
    1. De CMP van de detergenten micel kern te worden ongeveer gelijk is aan de CMP van de hoofd groep shell door het bepalen van de juiste verhouding van vermenging tussen h vliegengordijn en d vliegengordijn die behaalt compleet contrast matching met de hoofd groepen te verhogen. Een voorwaarde voor deze bepaling is kennis van de CMP voor een deuterium-gesubstitueerde alkyl keten staart. N-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) verkrijgbare tegenhanger is beschikbaar met alle alkyl keten waterstof vervangen door deuterium (d25-DDM). Herhaal de contrast-berekeningen die worden beschreven in stap 2.1 voor een was-staart ' in plaats van de 'h-staart'.
    2. Bereken de molverhouding van h-staart naar d-staart nodig zijn voor het contrast-matching met het hoofd groep CMP. De volgende formule kan helpen met deze bepaling:
      CMPhoofd = CMPh-tail * χh-staart + CMPd-tail * χd-tail
      waar CMP is de verstrooiing lengte dichtheid en χ is de volume-fractie voor het wasmiddel hoofd, h-staart, of d-tail onderdeel. Voor gebufferde oplossingen van DDM, opneming van 44% van het gewicht (43% door mole) van het totale wasmiddel als d25-DDM met deuterium-gesubstitueerde alkyl ketens produceert een enkele CMP in 48,5% D2O voor zowel de kop en de staart onderdelen.
  4. De mate van deuterium vervanging voor het membraan eiwit te overwegen. Voor het meten van voldoende verstrooiing signaal uit de eiwitten, moet de CMP voor het eiwit ten minste 15% D2O in oplossing uit de buurt van het wasmiddel CMP en meetomstandigheden. Het signaal toeneemt met het kwadraat van deze % verschil. Aangezien de CMP van een labelloze eiwit treedt meestal op met ~ 42% D2O in oplossing (een CMP vergelijkbaar met veel wasmiddel hoofd groepen), is deuterium-labeling van het eiwit bijna altijd een noodzaak. 52

3. express en zuiveren van de membraan proteïne van belang

  1. LB (lysogenie Bouillon) medium voor te bereiden en te groeien van Escherichia coli (E. coli) cellen herbergen een afleidbare expressie vector voor de doelgroep eiwit sequentie.
    1. Minimale media voor te bereiden. Los in de H2O of D2O, 7.0 g/L (NH4)2dus45,25 g/L Na2HPO41,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L diammoniumwaterstofcitraat waterstof, 5,0 g/L glycerol, 1,0 mL/L 20% w/v MgSO 4·7H2O en 1,0 mL/L Holme metaalsporen (0,50 g/L CaCl2·2H2O 0.098 g/L CoCl2, 0.102 g/L CuSO4, 16.7 g/L FeCl3·6H2O, 0.114 g/L MnSO4· H2O en 22.3 g/L Na2EDTA·2H2O 0.112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Voorbereiding van geschikte antibiotische voorraadoplossingen met H2O of D2O.
    3. Bereiden van een stamoplossing van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside H2O of D2O.
    4. Steriel-filter alle oplossingen in droge, steriele recipiënten met behulp van fles-top vacuüm en syringe filters met een poriegrootte 0,22 micron.
  2. Aanpassen van E. coli cellen deuterium-geëtiketteerden middellange voorafgaand aan schaal-up voor overexpressie van een Halfzwaar eiwit.
    1. Inoculeer 3 mL LB medium met een geïsoleerde kolonie van een agarplaat lysogenie Bouillon (LB) of van cellen uit een bevroren glycerol voorraad. Groeien van cellen bij 37 ° C in een schudden incubator van 250 toeren per minuut of verlaag de temperatuur tot 30 ° C of lager om te voorkomen dat de overmatige groei van de cultuur, wanneer 's nachts aan het broeden.
      Opmerking: De procedure van de aanpassing kan worden gevarieerd. 55 , 56 , 57
    2. Zodra de LB-cultuur is uitgegroeid tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van ~ 1, Verdun het 1:20 in 3 mL H2O minimaal medium en groeien tot een OD600 ~ 1. Herhaal de 1:20 verdunnen met minimaal medium met 50, 75 en 100% D2O (of tot het gewenste D2O percentage).
      Opmerking: als de D2O inhoud wordt verhoogd, de groei zal afnemen. De relatie tussen het percentage2O D in de groei media en deuterium substitutie in het eiwit is gemeld in de literatuur. 58 , 59 , 60
    3. Blijven groeien van de cultuur in een bioreactor te verhogen van het rendement van Halfzwaar cel massa (Figuur 3).
      Opmerking: Stapsgewijze procedures voor het bioreactor operatie hebben elders onderzocht. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Oogst en lyse cellen van E. coli voor membraan extractie en eiwit zuivering
    1. Pellet de cellen door centrifugeren bij ~ 6.000 x g gedurende ~ 30-45 min bij 4 ° C.
    2. De cel pellet verzachten door onderdompelen in buffer op ijs voor ~ 30 min. Vervolgens voorzichtig resuspendeer de pellet cel in buffer door zachtjes pipetteren met een serologische Pipetteer, of zachte wiegen op een 2D rocker, om een eindconcentratie van ~ 1 g natte cel massa/10 mL buffer.
      Opmerking: een buffer voorbeeld is 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur), pH 7.5, 200 mM NaCl aangevuld met een tablet protease inhibitor van de omwenteling.
    3. Lyse geresuspendeerde cellen met drie passeert een hogedruk homogenizer op 10.000 psi tijdens het koelen van de uitstroom.
      Opmerking: Afhankelijk van de vereiste schaal, is het andere lysis methodes gebruikt (bijvoorbeeld door de Franse pers of ultrasoonapparaat) mogelijk.
    4. Pellet cel puin door centrifugeren bij ~ 4000-5000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap totdat het supernatans wordt verduidelijkt.
    5. Ultracentrifuge (~ 150.000 x g gedurende 30-45 minuten) de bovendrijvende vloeistof uit de voorgaande stap, waarin de oplosbare en membraan breuken. De pellet na ultracentrifugatie de breuk van het membraan bevat.
    6. Resuspendeer de pellet membraan in een grote Dounce homogenizer en isoleren van de membraan-fractie opnieuw door ultracentrifugatie (stap 3.3.5). Herhaal deze stap ten minste eenmaal Schakel losjes afhankelijke eiwitten.
    7. Solubilize membranen door het zachte wiegen voor ~ 30 min bij 4 ° C in een buffer met wasmiddel geschikt voor zuivering. Solubilisatie blijkt wanneer de opschorting van helder transparant verandert. Onoplosbaar materiaal verwijderen door ultracentrifugatie (~ 150.000 x g voor 30-45 min).
      Opmerking: Een voorbeeld-buffer is 50 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazool en 4% (m/v) DDM voor zuivering door Ni2 + chromatografie van de affiniteit.
  4. Het zuiveren van het eiwit volgens een protocol eerder ontwikkeld voor geprotoneerd vormen.
    Opmerking: Zie Naing et al. voor een voorbeeld zuivering protocol voor een hexahistidine gelabeld M. marisnigri JR1 intramembrane aspartyl protease (d-MmIAP). 65 de uiteindelijke opbrengst was ~ 1 mg Halfzwaar van 5 L Halfzwaar cultuur celgroei, die werd gebruikt in het experiment van SANS (Figuur 4).
  5. Wisselen de gezuiverde proteïne in de "definitieve Exchange Buffer" voor de aanpassing van contrast.
    1. Bereiden van 200 mL "Definitieve Exchange Buffer" met het juiste mengsel voor contrast matching, bijvoorbeeld20 mM HEPES, pH 7.5, 250 mM NaCl en 0,05% totale DDM (0.028% DDM en 0,022% d25-DDM) in 49% D2O.
    2. Een kolom uitsluiting grootte met equilibreer > 2 kolom volumes (CV) van "Definitieve Exchange Buffer" in 3.5.1 met behulp van een systeem van snelle proteïne vloeibare chromatografie (FPLC).
    3. Na het injecteren van het monster, de kolom uitvoeren en isoleren van breuken die overeenkomt met de proteïne van belang.
    4. Het concentreren van de eiwitten aan de gewenste eindconcentratie (2-5 mg/mL).
      Opmerking: Een volume van ~ 300 μL is vereist voor het vullen van een 1 mm cilindrische kwarts cuvette gebruikt voor SANS.
    5. Reserveren van een aliquoot deel van gecompenseerde buffer voor SANS achtergrond aftrekken.
      Opmerking: Het monster kan worden genomen, rechtstreeks vanuit de bereid buffer of idealiter vanuit een schone elutie breuk aan het eind van de FPLC run.

4. Maak van de laatste voorbereidingen voor Beam tijd en verzamel SANS gegevens

  1. Nadat het voorstel is aanvaard, en toegang tot de site is goedgekeurd, alle vereiste opleiding tevoren toegewezen bundel afsluiten. Het gaat hierbij om prearrival, web-based training en on-site radiologische, laboratorium, instrument-specifieke opleiding.
    Opmerking: Opleiding eisen kan dicteren voorschot aankomst voor beginnende gebruikers. Meer informatie is online beschikbaar. 66
  2. Monsters en buffers voor gegevensverzameling laden.
    Opmerking: Een overzicht van de biologische small-angle neutron scattering (Bio-SANS) instrument samplegebied milieu is afgebeeld in Figuur 5.
    1. Monsters en buffers in kwarts cellen laden. Kwarts cellen zijn verkrijgbaar bij het instrument wetenschapper of faciliteit. Gebruik gel-laden tips om toegang tot de smalle opening van de meeste monster cellen.
    2. Zorgen dat de lichtbundel sluiter is gesloten, daarna aanpak van het voorbeeldgebied milieu en plaats de quartz-cellen in de monster-wisselaar. De positie van de wisselaar monster voor elk monster cel opnemen.
    3. Controleren van het gebied en zorgen dat het pad van de lichtbundel is vrij van obstructie, dan verlaten het samplegebied van milieu en open de sluiter van de lichtbundel.
      Opmerking: Zorgvuldig volgen alle faciliteit wet- en regelgeving, alle boekingen gehoorzamen en luisteren naar advies van de wetenschapper van het instrument. Monsters kunnen niet worden verwijderd uit de bundel en gemanipuleerd na blootstelling aan de straal zonder volgende speciale voorzorgsmaatregelen. Neem contact op met een radiologische controle technicus (RCT) voorafgaand aan deze procedures.
  3. Uitvoeren van tabel scan voor automatische gegevensverzameling
    1. Bedienen van het instrument door middel van aangepaste controle LabVIEW-gebaseerde software, Spectrometer Instrument controleomgeving (SpICE). Volg de instructies voor het instrument operatie geboden door de Neutron Scattering wetenschapper. Een overzicht van de windows tabel scan operatie wordt gegeven in Figuur 6.
    2. Na het invoeren van de informatie die nodig is in de juiste gebieden, de tabel scan uit te voeren en een geautomatiseerde gegevensverzamelingsprocedure zal beginnen. Voortgang via het tabblad 'Tabel Scan Status'.

5. Verminder SANS gegevens van 2D-afbeelding naar 1D Plot

  1. Het identificeren van elk monster en buffer gegevensbestand van de nummers opgenomen scan. Elke meting zal een unieke scan-nummer worden toegewezen. Deze informatie is nuttig tijdens data reductie te identificeren van elke overeenkomstige monster en buffer-pair.
  2. MantidPlot software en Python script gebruikt voor vermindering
    1. Neutron Scattering gebruikers zijn voorzien van accountgegevens voor toegang tot hun gegevens op het externe Cluster analyse. 67 Meld u aan bij de externe analyse-Cluster en "MantidPlot" uit te voeren vanaf de opdrachtregel. Figuur 7 en Figuur 8 worden verstrekt bij de volgende stappen uit.
    2. Een vermindering van de BlockFlash2 User Script te verkrijgen van de Neutron Scattering wetenschapper (dit gebeurt meestal tijdens het experiment); Dit script is Python gebaseerde en bevat alle nodige kalibratie en schalen aanpassingen om de verstrooiing van 2D-afbeelding naar een 1D-perceel van verspreide intensiteiten als een functie van de hoek van de verstrooiing, I(Q).
    3. Open het meegeleverde gebruiker vermindering Script in MantidPlot en plaats van de overeenkomstige scan nummers of de identificatie voor de steekproef en buffer pairs in de desbetreffende lijst.
    4. Het script voor het genereren van verminderde gegevens als een tekstbestand met vier kolommen (kolomvolgorde is Q, I(Q), I(Q) error fout,, Q fout) op de opgegeven locatie. De passende werkruimte in MantidPlot vlak tikken en uitgezocht "Plot met fouten..." voor een eerste onderzoek van de verstrooiing profielen.

6. het analyseren van gegevens voor structurele Parameters van het deeltje verstrooiing

  1. Het verminderde gegevensbestand van de analyseserver overbrengen naar een lokale computer met behulp van beveiligde FTP-bestandsoverdracht. Dit kan worden uitgevoerd met het gebruik van software zoals FileZilla of CyberDuck. Aanvullende instructies en details voor het aansluiten op het bestandssysteem van analyse server vindt u op de inlogpagina van analysis.sns.gov.
  2. Download de ATSAS software suite65,68 (hele ATSAS suite). 69 70 van de afzonderlijke programma's zijn ook online beschikbaar voor het analyseren van de gegevens van de SANS, namelijk het vaststellen van structurele parameters en ab initio modellen.
    Opmerking: Er zijn vele opties beschikbaar voor SANS data-analyse van biomacromoleculen. 45
  3. PRIMUS71 gebruiken voor gegevens uitzetten, schalen en aftrekken en Guinier analyse van de buffer.
    1. Start de ATSAS 'SAS Data-analyse' toepassing en laden de beperkte gegevens bestanden overeenkomt met de monster en buffer-pair.
      1. Om de buffer op de juiste schaal, selecteer een gegevensbereik bij hoge Q (Q > 0,5 Å-1) waar beide profielen zijn vergelijkbaar en plat, en klik op de knop 'Schaal' onder de 'operaties' tab. Een schaalfactor zal worden toegepast op de buffer, zodanig dat deze twee vlakke gebieden moeten overlappen. Wees voorzichtig: moet er een fysieke plausibele reden die schalen van de intensiteit van de buffer rechtvaardigt zodat deze overeenkomen met het monster. Als het verschil groot, raadpleegt u een instrument wetenschapper voor geldige approaches to achtergrond aftrekken. 44 , 45 , 72
      2. Vergroot het bereik van de gegevens te bekijken van alle punten. Klik op 'Aftrekken' als deze bewerking wilt uitvoeren. De buffer-afgetrokken datafile in de legenda rechts klikken en opslaan van dit bestand voor latere analyse. Figuur 9 een overzicht van het gebruik van het tabblad 'Activiteiten'.
    2. Een analyse van de Guinier van de buffer-afgetrokken voorbeeldgegevens met behulp van het tabblad 'Analyse' van de 'SAS Data-analyse' toepassing uitvoeren.
      1. Controleer of dat het juiste bestand is geselecteerd in de lijst en klik op 'Radius van Gyration'. Een automatische poging voor het uitvoeren van een Guinier past zal worden verstrekt door te klikken op de knop 'Autorg'.
      2. Uitbreiden van het bereik met gegevens die alle van de lage-Q-gegevens bevatten en beginnen het gegevensbereik vernauwing door high-Q punten weg te nemen tot de Qmax * Rg limiet is onder 1.3. De plot van storingswaarden gebruiken om te controleren of gegevens lineair in de fit bereik. De Guinier past levert een geschatte Rg en I0 voor de verstrooiing deeltjes.
      3. Kleine aanpassingen aan de fit regio en controleren van de gevoeligheid van deze waarden aan het bereik van de gegevens die worden gebruikt in de pasvorm. Figuur 10 bis aantoont het gebruik van het hulpprogramma 'Radius van Gyration'.
  4. Verkrijgen van de verdelingsfunctie (P(r)) in GNOM. 73 de output bestand gegenereerd hier zal worden gebruikt als input voor de ab initio modelleren proces.
    1. Start de Wizard distributie afstand binnen de 'Analyse' tab. verkrijgen van een goede pasvorm aan de gegevens is essentieel voor het verkrijgen van een kwaliteit-model. Voor meer informatie over het verkrijgen van nauwkeurige past, Raadpleeg de beoordeling74 door Putnam, et al..
      Opmerking: The GNOM programma bevat aanvullende informatie over de pasvorm dan de afstand Distribution Wizard. Cijfer 10B toont juist gebruik van het hulpprogramma 'Afstand verdeling', en Figuur 11 illustreert enkele van de gemeenschappelijke fouten die zijn opgetreden.
    2. Bepalen Dmax, de maximumafstand van de interatoom binnen het molecuul.
      1. Een waarde voor Dmax schatten door het vak wilt afdwingen Rmax unchecking = 0 en een hoge waarde in te voeren voor Dmax (150 Å, bijvoorbeeld). De eerste x-snijpunt in de plot van P(r) levert deze raming.
      2. Incrementele wijzigingen aan deze Dmax-waarde en het bereik van de gebruikte gegevens of aantal punten gebruikt in de pasvorm voor het optimaliseren van de GNOM passen tot de gegevens en de resulterende P(r)-curve.
    3. Blijven verfijnen de GNOM pasvorm en slaat de GNOM-uitvoerbestanden met goede fit parameters voor latere ab initio modellering stappen.
  5. Simuleren SANS profielen van hoge resolutie VOB modellen met behulp van het programma CRYSON. 75
    1. Open het programma en selecteer optie '0'. Selecteer de naam van het VOB-bestand in de pop-up file browser. Druk op enter om de standaardinstellingen, met uitzondering van keten deuteration breuken en de Fractie van D2O opgeven in het oplosmiddel te bereiken van de juiste contrast parameters te accepteren.
    2. Past het model aan een experimentele gegevensset door het invoeren van 'Y' en het gegevensbestand in de pop-up file browser te selecteren. De overige standaardwaarden accepteren en uitvoerbestanden zal worden geschreven in de locatie van de VOB-bestanden. Het bestand '.fit' bevat informatie voor het profiel van de voorspelde verstrooiing van het hoge resolutie 3D-model.

7. Maak Ab Initio modellen van de SANS gegevens.

Opmerking: DAMMIF76 en77 binnen de ATSAS softwaresuite DAMMIN is gebruikt om te reconstrueren dummy atoom modellen (dammen) met behulp van een gesimuleerde onthardende proces van de GNOM uitgang, die gegevens bevat die P(r), of informatie over de waarschijnlijkheid of frequentie van interatoom afstanden binnen het deeltje verstrooiing. Deze programma's kunnen worden uitgevoerd in de batchmodus of op de ATSAS-Online webserver.

  1. De PRIMUS vorm Wizard starten via de knop 'Dammif' op het tabblad 'Analyse' van 'SAS Data Analysis', en gebruik een handmatige selectie van parameters. De ingang voor de wizard wordt geïllustreerd in Figuur 12.
    1. Definieer de Guinier variëren van de pasvorm (stap 6.3.2) en gaat u verder met de volgende stap met behulp van de navigatieknoppen. Definieer fit waarden uit de P(r) plot (stap 6.4) en gaat u verder met de volgende stap.
    2. Parameters voor de ab initio modelleren proces bieden. Typ een voorvoegsel voor de bestandsnamen van de uitvoer van het model (bijvoorbeeld SANSEnvelope), Kies ofwel 'snelle' of 'slow' modus modellering, voer een waarde voor het aantal modellen (17 aanbevolen voor statistische significantie), selecteren uit de beschikbare opties voor deeltje symmetrie, anisometry en hoekige schaal (indien bekend). Zorg ervoor dat de vakken worden gecontroleerd tot gemiddelde modellen met DAMAVER en verfijnen van het uiteindelijke model met DAMMIN.
    3. Het proces met behulp van de 'commit'-knop starten. Zodra het proces voltooid is, bekijken en opslaan van de werkmap.
      Opmerking: de typische modelleren proces voor een enkele, kleine eiwit kan duren een paar uur met een doorsnee personal computer. Bestanden worden opgeslagen in tijdelijke mappen totdat opgeslagen.
  2. Overlay en superponeren de finale SANS envelop met een verwante high-resolution model met behulp van SUPCOMB binnen ATSAS. Plaats een kopie van de hoge resolutie VOB-model te passen aan de SANS-envelop in de werkmap. SUPCOMB uitvoeren vanaf de opdrachtregel met behulp van de VOB-bestandsnamen als twee argumenten met de structuur van de sjabloon bovenaan: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Opmerking: De tweede bestandsnaam vermeld zal worden herschreven als een nieuw bestand met een 'r' toegevoegd aan het einde en hebben nieuwe coördinaten voor superpositie op de structuur van de sjabloon.
  3. Visualiseer de ab initio modelresultaten PyMOL (pymol.org), een programma voor het bekijken van 3D moleculaire grafische gebruiken. Figuur 13 biedt een overzicht van de bewerkingen PyMOL.
    Opmerking: Er zijn publicatie richtlijnen voor structurele modelleren van kleine-hoek verstrooiing gegevens van biomoleculen in oplossing. 78
    1. Lanceer de toepassing PyMOL en open de .pdb bestanden overeenkomt met de 3D SANS envelop en de SUPCOMB uitgelijnde high-resolution structuur worden bekeken.
    2. Visualiseer de SANS-envelop door dit model als een oppervlak vertegenwoordigen. Klik op de 'S' knop naast het model en kies ' Toon: als: oppervlak '.
    3. De structuur van de ruggengraat eiwit met een hoge resolutie visualiseren door dit model als een cartoon vertegenwoordigen. Selecteer de 'S' knop naast dit model en kies ' Toon: als: Cartoon'. De keten als een regenboog van N - tot C-terminus weergeven door op de knop 'C' en ' door keten: Chainbows'.
    4. Het wijzigen van de transparantie van de oppervlakte vertegenwoordiging voor de duidelijkheid. Selecteer in de menubalk van de 'Setting', ' transparantie» oppervlak» 40% '.
    5. Maak de achtergrond wit en niet-dekkend. Selecteer in de menubalk 'Display', ' achtergrond»' en selecteer 'Opaque' uit te vinken deze optie en 'Witte' ter gelegenheid van deze kleur voor de achtergrond.
      Opmerking: extra bewerkingen en gebruik voor PyMOL vindt u op PyMolWiki.org.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een lichtbundel tijd en instrument voorstel moet duidelijk overbrengen van alle informatie die nodig is aan de Commissie ter beoordeling zodat een geldige van de voorgestelde experiment kunnen worden beoordeeld. Communicatie met een NSS is zeer aanbevolen voor onervaren gebruikers. De NSS kan beoordelen eerste haalbaarheid en gids voorstel indienen om te benadrukken van de haalbaarheid, veiligheid en het potentieel voor hoge impact wetenschap. De informatie in het voorstel moet bevatten a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Structurele biologie onderzoekers profiteren van aanvullende structurele technieken zoals oplossing verstrooiing verkrijgen van biochemische en structurele informatie (zoals de totale omvang en vorm) van biomoleculen in oplossing. SANS is een bijzonder aantrekkelijk techniek voor het bepalen van de lage resolutie structuren van membraaneiwitten, een kern focus van moderne structurele biologie en biochemie. SANS vereist hoeveelheden van gezuiverde eiwitten die vergelijkbaar zijn met die van kristallografische proeven (1 m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss en Ryan C. Oliver zijn gecontracteerd door UT-Battelle met ons DOE ter ondersteuning van het Neutron Science gebruikersprogramma en Bio-SANS instrument bij het Oak Ridge National Laboratory gebruikt in dit artikel.

Dit manuscript heeft mede geschreven door UT-Battelle, LLC, onder contract DE-AC05-00OR22725 met de ons Department of Energy (DOE). De Amerikaanse regering behoudt en de uitgever, door het aanvaarden van het artikel voor publicatie, erkent dat de Amerikaanse regering een niet-exclusieve, gestorte, onherroepelijke, wereldwijde licentie behoudt te publiceren of reproduceren van het gepubliceerde formulier van dit manuscript, of toestaan anderen doen, voor de Amerikaanse regering doeleinden. DOE zal zorgen voor toegang tot deze resultaten van federale overheid gesponsorde onderzoek overeenkomstig het Plan bij DOE-toegang van het publiek. 82

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Office van biologische en milieuonderzoek in steun voor onderzoek op het Chicago Center voor structurele moleculaire biologie (CSMB) en Bio-SANS met behulp van faciliteiten ondersteund door de wetenschappelijke gebruiker voorzieningen Division, Office of Basic Energy Sciences, ons departement van energie. Ruwbouw op membraaneiwitten in het lab Lieberman werd ondersteund door de NIH (DK091357, GM095638) en de NSF (0845445).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator EMD MilliporeUFC905096labware
Ammoniumcitraat dibasischFisher ScientificA663medium component
AmmoniumsulfaatEMD Millipore2150medium component
Bioflo 310 Bioreactor SystemEppendorfM1287-2110apparatuur
Calciumchloride dihydraatAcros423525000medium component
CarbenicillineIBI ScientificIB02025antibioticum
ChloramfenicolEMD Millipore3130antibioticum
Kobalt (II) chlorideAcrosAC21413-0050medium component
Koper (II) sulfaatAcrosAC19771-1000 medium component
DeuteriumoxideSigma-Aldrich756822medium component
Drierite Gas PurifierW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, dinatrium, dihydraatEMD Millipore4010medium component
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3apparatuur
Äkta Purifier UPC100GE Healthcare apparatuur
GlycerolSigma-AldrichG5516medium component
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR columnGE Healthcare 17116701
ImidazoolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Ijzer (III) chloride hexahydraatMP BiochemicalsICN19404590medium component
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Magnesiumsulfaat heptahydraatVWR97062-134medium component
Mangan (II) sulfaat monohydraatAcrosAC20590-5000medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated ShakerThermo ScientificSHKE6000-7 apparatuur
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranosidAnatraceD310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosidAnatraceD310A
Kaliumfosfaat monobasischVWR97062-346medium component
RC 6 Plus CentrifugeThermo Scientific Sorvall46910apparatuur
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-freeSigma-AldrichS8830
NatriumchlorideSigma-AldrichS3014
NatriumhydroxideSigma-Aldrich795429
Natriumfosfaat dibasischSigma-AldrichS7907medium component
Steriele 25mm spuitfilter met 0.2µm PES membraanVWR28145-501labware
Steriele wegwerpflesetje met 0.2µm PES membraanThermo Scientific596-4520 labware
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 17517501
Superose-12 10/300 GL column GE Healthcare 17517301
Ultrospec 10 Cell Density MeterGE Healthcare 80211630apparatuur
Zinksulfaat monohydraatAcrosAC38980-2500 medium component

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35(2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335(2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047(1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488(2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582(2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735(2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van MembraaneiwittenDeuteriumgelabeld EiwitGuinier analyseGrootte uitsluitingschromatografieNeutronencontrastmatchingSANS datareductiePyMOL visualisatie

Gerelateerde artikelen