Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Abstract

In vivo eiwitten zijn vaak onderdeel van grote macromoleculaire complexen waar bindende specificiteit en dynamiek uiteindelijk functionele uitgangen dicteren. In dit werk, is de pre-endosomal bloedzweer toxine geassembleerd en overgestapt naar de complexe endosomal. Ten eerste is het domein van de N-terminal van een mutant letale factor van cysteïne (LF_N) gekoppeld aan een biosensor interferometrie (BLI) biolayer via bisulfide-koppeling in een optimale oriëntatie, zodat beschermende antigeen (PA) prepore te binden (K_d 1 nM). De optimaal georiënteerde LF_N-PA_prepore complex dan bindt aan oplosbare capillaire morfogenisch gen-2 (CMG2) cel oppervlakte receptor (K_d 170 pM), resulterend in een representatieve miltvuur pre-endosomal complex, stabiel bij pH 7.5. Geassembleerde appartementencomplex is vervolgens onderworpen aan de vertegenwoordiger van de verzuring (pH 5.0) van de late endosome milieu om de overgang van de PA-_prepore in de staat van de porie membraan ingevoegd. Deze PA_porie staat resulteert in een verzwakte binding tussen de CMG2 receptor en de LF_N-PA_poriën en een aanzienlijke dissociatie van CMG2 uit de porie van overgang. De thio-bijlage van LF_N aan de biosensor oppervlakte is gemakkelijk ongedaan gemaakt door de dithiothreitol. Korting op het oppervlak van de biosensor BLI releases de LF_N-PA_prepore-CMG2 ternaire complex of het zuur overgestapt LF_N-PA_porie complexen in microliter volumes. Vrijgegeven complexen zijn dan gevisualiseerd en geïdentificeerd met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie. Deze experimenten laten zien hoe om te controleren de kinetische montage/demontage van specifieke eiwitcomplexen met behulp van label-vrije BLI methodologieën en evalueren van de structuur en de identiteit van deze BLI complexen geassembleerd door elektronenmicroscopie en massa Spectrometrie van, respectievelijk, met behulp van gemakkelijk-te-repliceren sequentiële procedures.

Introduction

Identificeren en inzicht in de specificiteit bestuur eiwit complex vergadering in vivo is van extreem belang voor biochemische onderzoekers. Grote heterogene eiwit assemblages zijn de norm in plaats van de uitzondering. Dit begrip wordt ondersteund door spectroscopische monitoring van in vivo assemblage, complexen met behulp van zachter cel verstoring technieken, producten van zuivering affiniteit gebaseerde methoden evalueren en visualiseren ze isoleren met behulp van hoge resolutie Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM). Om de controle op de specificiteit van de vergadering binnen de cel te begrijpen, moeten onderzoekers routinematig isoleren, identificeren en uiteindelijk het karakteriseren van deze dynamische montage/demontage structuren. De meest intensief gebruikte moleculaire hulpmiddel om identificatie van de bestanddelen van deze vergaderingen vaak vereist antilichaam gebaseerde immunoprecipitation, die gebaseerd is op het behoud van de complexe stabiliteit tijdens de verstoring van de cel. Verschillende gekoppelde analytische technieken werden onlangs ontwikkeld om het vangen van complexen van celsteekproeven met behulp van de microfluidic gebaseerde benaderingen, zoals oppervlakte plasmon resonantie (SPR). Na verwijdering van de SPR oppervlakken, deze monsters werden geanalyseerd door laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie tijd voor vlucht (MALDI-TOF)^1,2. Bevordering van deze methode met behulp van eenvoudiger protocollen kunnen onderzoekers te visualiseren en te valideren voorspelde complexen die zich in de cellulaire milieu voordoen. Aangezien SPR een microfluidics-gebaseerd systeem is, problemen vaak uit statistische formatie. Omzeilen van dit probleem vereist monsterverdunning, die op zijn beurt, de integriteit van concentratie aansprakelijk biologische complexen kan afnemen.

Een relatief recente vooruitgang in label-vrije technologieën is de ontwikkeling van de biolayer interferometrie (BLI) systeem³. Deze bijzondere licht-gebaseerde reflectiecoëfficiënt systemen repliceren, of beste emuleren, SPR bindende en kinetische uitslagen op een fractie van de kosten^3,4 vooral als enkellijns eenheden worden gebruikt. BLI meet veranderingen in de gereflecteerde licht interferentie tussen een referentielaag (controle) en het biolayer oppervlak (experimenteel). De resulterende wijzigingen in fase wordt gemeten in real-time als een kinetische en kwantitatieve uitlezing⁵. De biosensor oppervlak, met specifieke immobilisatie chemicaliën, wordt fysiek tussen oplossingen, in tegenstelling tot de buffer wijzigingen door microfluidic benaderingen in SPR, voor meting via golflengte fase verlegging overgebracht. Massaoverdracht effecten worden voorkomen door schudden van de oplossing. In tegenstelling tot SPR zijn deze systemen zeer nuttig bij de beoordeling van de complexen van ruwe biologische monsters. De fysieke parameter gemeten tijdens BLI experimenten voornamelijk is afhankelijk van een verandering in de massa of de dikte aan de biosensor oppervlakte die uit eiwit complex montage of demontage voortvloeit.

Deze fiber optic biosensoren zijn makkelijk te gebruiken en relatief goedkoop. Een van de opkomende nuttige aspecten van BLI is de facile verwijdering van nieuw gemonteerde eiwitcomplexen van het oppervlak. Een recente toepassing van deze methode toegestaan ons laboratorium te observeren de real-time kinetiek van grootschalige pH geïnduceerde proteïne-omlegging van de structuur van de bloedzweer toxine beschermende antigeen (PA) component zoals de prepore (PA_prepore) naar overgestapt haar porie (PA_porie) vorm. Deze overgang op de biosensor tip was geverifieerd met behulp van elektronenmicroscopie (EM)⁶. Verwijdering van complexen van biosensor oppervlakken vermijdt groter volume verdunning effecten vaak opgetreden wanneer het vrijgeven van complexen van chip oppervlakken bij het gebruik van microfluidics systemen.

In het huidige werk, zijn miltvuur toxine complexen gemonteerd en gedemonteerd aan de biosensor oppervlakte en vervolgens vrijgelaten in microliter volumes. De resulterende complexe componenten zijn gevalideerd orthogonaal met behulp van EM en massaspectrometrie (MS).

Protocol

1. assemblage van gedefinieerde macromoleculaire complexen op Biolayer Interferometry (BLI) Biosensor oppervlakken

1. Vergadering van prepore miltvuur toxine complex op een amine PDEA gemodificeerde reactieve biosensor oppervlak
   1. Hydrateer een amine reactieve tweede generatie (AR2G) BLI biosensor tip in 250 µL van water gedurende tien minuten.
   2. Stap tijden, vermeld in tabel 1, op de controle van de eenheid BLI software Program (Zie Tabel van materialen).
   3. Start de BLI gerund door het onderdompelen van de biosensor tip in 250 µL water voor 30 s voor het meten van een eerste basislijn van biosensor dikte en dichtheid.
   4. De biosensor activeren door de tip onder te dompelen in 250 µL 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) en 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) voor 7 minuten.
   5. Dompel de geactiveerde biosensor in 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) opgelost in 0,1 M boraat buffer (pH 8,5) gedurende 5 minuten voor het genereren van een geactiveerde thiol-reactief oppervlak.
   6. De geactiveerde thiol-reactieve biosensor onderdompelen in 250 µL oplossing met 100 nM E126C LF_N in 10 mM natrium acetaat pH 5.0, 100 mM NaCl, buffer voor 5 minuten.
   7. Dompel de LF_N tip in 50 mM L-cysteïne, 1 M NaCl, 0,1 M Natriumacetaat, pH 5.0, 4 minuten, om eventuele resterende reactieve gratis thiol-reactieve groepen quench.
   8. Dompel de gehard LF_N tip in 50 mM Tris, 50 mM NaCl gedurende 2 minuten om buffer basislijn.
   9. Dompel de gehard LF_N tip in 0,5 µM beschermende antigeen prepore (PA_prepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl voor 5 minuten om te maken de LF_N-PA_prepore complex.
   10. Eenmaal PA_prepore is gekoppeld, het uiteinde van de PA_prepore oplossing verwijderen en de tip onderdompelen in 50 mM Tris, 50 mM NaCl gedurende 30 seconden naar het wegwassen van alle niet-specifiek gebonden PA_prepore.
   11. Dompel de LF_N-PA_prepore complex in 0,5 µM CMG2 receptor (zonder de transmembrane domein), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, voor 5 minuten.
   12. Dompel de LF_N-PA_{prepore -}CMG2 complex in 50 mM Tris, 50 mM NaCl gedurende 30 seconden om weg te wassen niet-afhankelijke CMG2 naar formulier pre-endosomal complex.
   13. EM p.a., laat de LF_N-PA_prepore-CMG2 complex uit de biosensor tip door de tip onder te dompelen in 5 µL van 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, binnen een PCR-buis.
   14. Voor tandem MS analyse van de peptiden van het complex, laat de LF_N-PA_prepore-CMG2-complex van de biosensor tip door de biosensor onder te dompelen in 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratine-vrij), 25 mM Ammoniumbicarbonaat pH 8,0 binnen een PCR tube . Dit wordt uitgevoerd op een verschillende biosensor dan degene die worden gebruikt voor analyse van de EM.
2. Vergadering van porie miltvuur toxine complex op PDEA gemodificeerde amine reactieve biosensor oppervlak
   1. Om weer te geven het complex na de overgang van de pH, stappen 1.1.1-1.1.12 uitvoeren in de vorige sectie voor het genereren van de LF_N-PA_prepore-CMG2 complex.
   2. Dompel de biosensor tip in een 10 mM acetaat pH 5.0 voor 5 minuten tot de overgang van de PA-_prepore PA_porie overgang. Deze overgang wordt aangegeven doordat de amplitude (ongeveer 0,2 nm) gevolgd door een grotere daling van de amplitude die hypothetische is om ingrijpende be- of volledige receptor dissociatie wijten aan verminderde bindende affiniteit.
   3. Onderdompelen LF_N-PA_porie tip in 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8.0, gedurende 30 seconden om het zure buffer afwassen.
   4. Voor de EM analyse steekproef, dompel de biosensor tip in een oplossing met 1.25 mM micellen (2.5 mM MSP1D1, 25 mM nb-cholate, 162.5 mM POPC) gedurende 5 minuten om te voorkomen dat samenvoeging in oplossing na bisulfide release.
   5. EM p.a., release de LF_N-PA_{porie -}micel complex uit de biosensor tip door de tip onder te dompelen in 5 µL van 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl binnen een PCR-buis.
   6. Voor tandem MS analyse van de peptiden van het complex, de LF_N-PA_poore complexe (geen micel) uit de biosensor tip door de biosensor onder te dompelen in 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratine-vrij), 25 mM Ammoniumbicarbonaat pH 8,0 binnen een PCR buis. Dit wordt uitgevoerd op een verschillende biosensor dan degene die worden gebruikt voor analyse van de EM.

2. visualiseren en valideren vrijgegeven macromoleculaire assemblages van BLI biosensoren door negatieve vlek elektronenmicroscopie

1. Gloed kwijting een koolstof-gecoate Cu 300 raster. Typische gloed geen kwijting instellingen zijn 0.38 mBar stabiele atmosfeer druk, negatieve 15 mAmps, 20 seconden, vervolgens ontluchting met lucht.
2. Veilige raster tussen een paar schone pincet.
3. Pipetteer 4 µL van vrijgegeven complexe monster in PCR buis op het raster en adsorptie voor 60s toestaan.
4. Pit weg resterende vloeistof met een filtreerpapier wig.
5. Vlek het raster door pipetting 5 µL van 0,75% 0,02 micron gefilterd uranyl formate en wicking weg overtollige vlek na 5 seconden. Toestaan raster te drogen bij kamertemperatuur.
6. Bekijk gebeitst monster rasters met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.

3. identificatie van Anthrax op volledige toxine van de Pre-endosomal Complex (LF_N-Pa_prepore-CMG2) en Transitioned complexe (LF_N-Pa_porie zonder CMG2) met behulp van spectrometrie van de massa.

1. Verdun 20 µL vrijgegeven monsters en incubeer gedurende 1 uur.
2. Voeg 2 µL van iodoacetamide van 55 mM, 25 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8,0 en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in donker (bedekt met aluminiumfolie).
3. Verdun het monster met 100 µL van 25 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8.0, om de guanidine hydrochloride concentratie minder dan 1 M.
4. Voeg 5 µL van rang bewerkt trypsine op 20 ng/µL sequencing en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
5. Ijsazijn toevoegen om een eindconcentratie van 5% om de pH op < 3, vervolgens het volume te verlagen tot 10 µL in vacuüm concentrator.
6. Breng de peptide oplossing aan de monster-plaat op de autosampler van de uHPLC nLC 1200.
7. Laden 5 µL de peptide-oplossing op een uHPLC reversed-phase kolom gemonteerd op het podium van ionisatie van de MS.
8. Was de kolom met 15 µL van 0,1% mierenzuur met een maximale snelheid van 5 µL/min en/of maximale druk van 800 psi.
9. Elueer peptiden uit de reversed-phase C18-kolom op een debiet van 350 nL/min gedurende 90 min met behulp van een lineaire verloop van 5% tot 40% van oplosmiddel B in A + B (oplosmiddel A: 0,1% mierenzuur; oplosmiddel B: 95% acetonitril met 0,1% mierenzuur).
10. Analyseren eluerende peptiden op regel met behulp van tandem MS.
    1. De ionisatie-bron ingesteld op 2500 Volt en ion overdracht temperatuur tot 250 ° C.
    2. Werken de massaspectrometer onder automatische controle voortdurend één MS scan gevolgd door zoveel tandem MSMS mogelijk gedurende een 3 s, uit te voeren met behulp van de CID en een genormaliseerde botsing energie van 35.
11. Identificeren van peptide en proteïne onderdelen met behulp van standaard methoden. Voor dit werk, werden twee sets van peptide en proteïne analyse uitgevoerd.

Results

De mogelijkheid om te controleren en valideren van de vergadering van grote macromoleculaire complexen is een cruciale stap gezet naar inzicht in de specificiteit en de functionaliteit van grote biomoleculaire assemblages. De resultaten van de hier vermelde methoden aantonen het gemak met welke grote eiwitcomplexen (> 150 kDa massa) kan worden gemonteerd met behulp van biolayer interferometrie, allen terwijl het toezicht op de kinetiek en de amplitude van de vergadering. De unieke compacte aard van het oppervlak van de biosensor maakt een analyse van de vergadering worden uitgebreid door het vrijgeven van geassembleerde complexen in kleine microvolumes. Deze microvolumes kan worden gebruikt om te visualiseren de eerste fysieke structuur van de complexen met behulp van EM en om te controleren of de identiteit van de complexe onderdelen met behulp van MS. Een schematisch overzicht van dit hele proces is afgebeeld in Figuur 1.

Een sleutelelement voor de geslaagde vergadering en verificatie van macromoleculaire complex aan de biosensor oppervlakte omvat de juiste stand van het eerste zaad-eiwit. Dit zorgt ervoor dat de eiwit-eiwit interactie sites toegankelijk, niet sterically geblokkeerd en optimaal gepositioneerd weg van het biosensor oppervlak zijn. Zoals blijkt uit Figuur 2, de juiste stand van de complexe anthrax-toxine wordt bereikt met behulp van een speciaal aangelegde N-terminale fragment van letale factor (LF_N) zodat de LF_N-PA_prepore bindende site wordt altijd gepositioneerd tegenovergestelde van de biosensor covalente bijlage site^6,7. De verdere opbouw van het complex met binding voor PA aan de LF_N BLI biosensor gevolgd door oplosbare CMG2 bindend aan PA maakt uiteindelijk een translocatie bevoegde miltvuur toxine complex.

De BLI sensogram trace is een real-time lezen uit de amplitude-veranderingen als gevolg van specifieke toevoeging van de bloedzweer toxine componenten zoals ze zijn toegevoegd aan de biosensor. Figuur 3 toont die een representatieve trace gecombineerd met een model van het complex voorspeld vorm op die stap in het proces. De eerste opkomst is LF_N laden op de tip. Na blussen en basislijn, PA_prepore vervolgens bindt aan LF_N , gevolgd door de toevoeging van oplosbare CMG2 receptor resulterend in het complex van de geassembleerde pre-endosomal van LF_N-PA_prepore-CMG2. Om naar het laat endosome milieu, is het gehele complex onderworpen aan een lage pH-puls (pH 5.0) die de receptor binden, waardoor de prepore om de overgang naar de uitgebreide membraan ingevoegd porie conformatie verzwakt. ⁶ Sensogram sporen van de verzuring stap worden weergegeven in Figuur 4. De eerste verhoging of 'spike' in amplitude is waarschijnlijk de porie uitbreiding⁶ die vóór de daling in de CMG2 receptor binding plaatsvinden moeten. De grotere daling van de amplitude is waarschijnlijk ingrijpende be- of volledige receptor dissociatie als gevolg van verminderde bindende affiniteit. Vorige werk in dit laboratorium aangegeven CMG2 binding aan het volledig uitgebreide PA_porie is te verwaarlozen in vergelijking met de CMG2-PA_prepore interactie⁶. Bovendien, de sensogram kinetische trace, waargenomen in alle sensograms van LF_N-PA_prepore-CMG2 overgang naar LF_N-PA_porie met een daling van de pH, over meerdere punten reproduceerbaar is.

Voorafgaand aan en na de verzuring, zijn de biosensor aangesloten complexen gemakkelijk uitgebracht voor visualisatie door negatieve vlek EM en identificatie door MS (Figuur 5). Representatieve complexen van de EM-resultaten worden weergegeven in Figuur 6. Pre-endosomal monster rasters, Toon dichtheden consistent met intact ternaire complexen bestaande uit_N-PA LF_prepore-CMG2. Na verzuring complexe rasters, Toon PA overgestapt om porie en ontbindend door micel opname met geen voor de hand liggende CMG2 dichtheid.

De identiteit van de pre- en post verzuring complexen zijn geverifieerd door MS. Een database waar de sequenties van PA, P13423; LF_N, P15917; en CMG2, P58335 werden opgenomen in een achtergrond van een muis eiwitten database afgeleid van het NCBInr archief. Alleen de eiwitten van belang werden verkregen uit deze eerste database opzoeking, met de volgende aminozuur dekking voor de ternaire en binaire complexen: 54% en 22% voor PA, 36% en 6% voor LF en 43% voor CMG2, respectievelijk (CMG2 is niet aangetroffen op de binaire complex). Om te maximaliseren de eiwit aminozuur dekking, werd een tweede peptide/eiwit identificatie uitgevoerd met behulp van een eiwit-database met alleen de drie proteïnen van belang. Pre-endosomal MS monsters bevat peptiden van alle drie toxine componenten met 60.46% en 67.97% 54.15% dekking voor LF_N, PA en CMG2, respectievelijk (Figuur 7). Post-endosomal resultaten, getoond in Figuur 8, bevatte slechts peptiden van LF_N en PA (57.41% en 67.79% dekking, respectievelijk). Het ontbreken van CMG2 in de post-endosomal monsters stroken met de waargenomen BLI nm daling tijdens de formatie van de porie.

Figuur 1. Schematisch overzicht voor analyse van eiwitcomplexen op gemonteerd en geïsoleerd van BLI biosensor gebruik EM en MS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Biosensor activering: eerste stap in richting specifieke vergadering op BLI biosensor. Het domein E126C letale Factor N-terminal (LF_N) is gekoppeld door middel van een thio-koppeling maken het goed georiënteerde PA_prepore bindende interface. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. Controle van miltvuur toxine montage en demontage met BLI: de sensogram amplitude wijzigingen als een functie van de tijd als gevolg van specifieke toevoeging van de bloedzweer toxine worden onderdelen weergegeven wanneer ze worden toegevoegd aan de biosensor beginnen met het laden van de LF_N (stap 4 in Tabel 1). PA_prepore wordt vervolgens geladen op het oppervlak, gevolgd door de toevoeging van oplosbare CMG2 receptor. De geassembleerde pre-endosomal-complex bestaat uit een LF-PA_prepore- CMG2. Om naar het laat endosome milieu, monteren de volledige functionele miltvuur toxine wordt onderworpen aan een lage pH-pulse (pH 5.0) dat de receptor binden verzwakt, waardoor de prepore om de overgang naar de uitgebreide membraan ingevoegd porie bevleesdheid. Blootstelling van het membraan spanning porie is bevestigd en ontbindend door toevoeging van micellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4. BLI sensogram van CMG2 release: sporen van de verzuring stap Toon een eerste verhoging of 'spike' in amplitude gevolgd door een grotere daling van de amplitude die waarschijnlijk porie vorming en receptor dissociatie, respectievelijk. Verticale gestippelde rode lijnen duiden begin van een nieuwe stap. Sensograms zijn uitgelijnd op de vette gestippelde rode lijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5. Analyseren van eiwitcomplexen op gemonteerd en geïsoleerd van BLI biosensor gebruik EM en MS: Biosensor aangesloten complexen gemakkelijk 5 µL van buffer met DTT vrijkomen voor visualisatie door negatieve vlek EM en identificatie door MS. Klik hier om in te Bekijk een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6. Visualisatie van eiwitcomplexen met EM: Pre-endosomal monster rasters, Toon dichtheden consistent met intact ternaire complexen bestaande uit_N-PA LF_prepore-CMG2. Post-endosomal complex rasters, Toon PA overgestapt om porie en ontbindend door micel met geen voor de hand liggende CMG2 dichtheid. Modellen van de voorspelde complexen (linkerzijde) zijn op dezelfde schaal als individuele deeltjes komt te staan. Deeltjes ingekleurd met voorspelde eiwit (gebaseerd op de grootte van EM dichtheid) staan hieronder elk deeltje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7. Verificatie van eiwitcomplexen met MS: Pre-endosomal MS monsters bevat peptiden van alle drie toxine componenten met 60.46% en 67.97% 54.15% dekking voor LF_N, PA en CMG2, respectievelijk. Peptiden gedetecteerd tempo een valse ontdekking (FDR) gelijk of hoger dan 5% komt te staan in het geel, FDR gelijk of hoger dan 1% in het groen weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8. Verificatie van eiwitcomplexen met MS: Post-endosomal monsters bevat peptiden van LF_N en PA (57.41% en 67.79% dekking, respectievelijk), maar niet CMG2. FDR gelijk of hoger dan 5% komt te staan in het geel, FDR gelijk of hoger dan 1% in het groen weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Stap	Tijd (s)	Beschrijving
1	30	Eerste basislijn
2	420	Activering
3	300	Activering
4	300	LFN laden
5	240	Cysteïne demping
6	120	Basislijn
7	300	PAprepore vereniging
8	30	Basislijn
9	300	CMG2 vereniging
10	30	Basislijn
11	300	Zure overgang
12	30	Basislijn
13	300	Micel vereniging

Tabel 1. Stap tijden voor single BLI rijden naar vergadering miltvuur toxine complex. Merk op dat basislijnen worden gebruikt voor niet-afhankelijke eiwitten uit de vorige stap weg te wassen en/of leg een basislijn voor nieuwe buffer vast.

Discussion

Deze demonstratie ziet u hoe macromoleculaire complexvorming kan gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van biolayer interferometrie, gevisualiseerd met behulp van EM, en gecontroleerd met MS, allemaal met microvolumes in een korte tijdsspanne. Structurele montage en waargenomen complexen volgen de biologisch relevante voorspellingen, deze gecombineerde methodologie verder te valideren. Zoals vermeld in het gedeelte ' resultaten ', vereist het belangrijkste element voor het succes van de vergadering rationeel gemanipuleerde cysteïne mutagenese om ervoor te zorgen dat de complexe eiwit-eiwitinteractie interfaces goed georiënteerde uit de buurt van het oppervlak van de biosensor.

Eerdere systemen hebben BLI en MS-technieken gebruikt voor het evalueren van de binding aan eiwitten van twee en drie componentsystemen en integriteit van receptor binden van uitgedrukt eiwit, maar in beide gevallen, de methoden werden niet ontwikkeld om te profiteren van de tandem EM/MS ^8,9te benaderen. Het alleen andere interferometrie systeem dat MS analyse om te helpen met het karakteriseren van interacties gecombineerd was een dual-polarisatie interferometrie¹⁰. Helaas, dit systeem is niet langer beschikbaar voor algemeen gebruik. Zoals vermeld in de inleiding, zijn er een aantal studies voltooid waar monsters werd opgericht op SPR-achtige biosensor oppervlakken en verwijderd uit MS analyse. Geen van deze voorbeelden resulteerde in complexen gevisualiseerd met behulp van EM.

De beperkingen van deze opeenvolgende methode kunnen talrijke maar oplosbaar zijn. Voor de eerste immobilisatie en daarom Stichting stap van de vergadering, zou een gebrek aan kennis van de structurele interactie oppervlakken zeker vooruitgang die is gekoppeld aan het toezicht van eerste montage fasen belemmeren. Het gebrek aan informatie van de structuur kan worden aangepakt door het ontwerpen van een gemanipuleerde Stichting bouwen waar bijlage chemicaliën (bijvoorbeeld sulfaatzuurstof groep voor bisulfide verbanden / zijn-gelabeld positionering) kunnen worden verplaatst naar de verschillende regio's binnen de kern montage systeem. In het geval van de bloedzweer toxine complexe had het geluk dat de structuur van LF_N gebonden aan PA_prepore beschikbaar^{11 is}. Rationele plaatsing van de gemanipuleerde cysteïne was gelokaliseerd aan regio's van de PA_prepore bindende gezicht af. Met cysteïne koppeling Doorgaan is het beter dat geen andere reactieve cysteines op het oppervlak van het eiwit aanwezig zijn.

Er zijn verschillende bijlage chemicaliën die kunnen worden gebruikt om specifieke site op de oppervlakken van een eiwit. Een van de populairste specifieke bijlagen gaat positionering van een groep van biotine op een specifiek gedefinieerde locatie op de oppervlakte van eiwit¹². Helaas, Biotine binding aan een streptavidine of avidin gecoate oppervlakken is vrij krap. Omkering van de bindende interactie is niet eenvoudig. Het gebruik van een gemanipuleerde zijn-tag op de N - of C-terminus en het verdere gebruiksgemak gehechtheid aan Ni-NTA oppervlakken is een meer universele toepassing van affiniteit immobilisatie. Natuurlijk, is een van de waarschuwingen voor engineering vergadering bijlage sites met zijne-gelabeld systemen de eis dat de N - en C-termini van het core vergadering eiwit blijven blootgesteld en gescheiden zodat de bijlage eenvoudig is. Als met alle assemblage processen, moet de interface van de interactie van de kern vergadering eiwit beschikbaar blijven als het complexe vergadering vordert.

Misschien is de meest voorkomende zorg van het gebruik van biosensor oppervlakte chemicaliën aspecifieke bindend. Daar tips zijn vaak een bron van aanzienlijke niet-specifieke bindende gevolgen. Bisulfide gekoppeld Biotine kan worden gebruikt om zeer specifieke complexen weggaand achter de verminderde S-Biotine koppeling strak gebonden aan geïmmobiliseerdet daar biosensoren¹³vrij te geven. Er zijn andere omkeerbare oplossingen steeds beschikbaar zoals iminoboronates en aan een mindere mate ketoamide¹⁴. Dit veld is momenteel onderontwikkeld, maar er is van groot belang voor de verdere ontwikkeling van omkeerbare covalente protocollen om te voorkomen dat af-target drug toxiciteitseffecten die vaak gepaard gaan met het gebruik van covalente gerichte Geneesmiddelenontwikkeling.

Een beperking van het gebruik van EM te visualiseren complexen is interpretatie, vooral in gevallen waar de structuren van de geassembleerde complexen zijn niet in eerste instantie bekend. De ruimtelijke locatie van componenten binnen een ongedefinieerde geassembleerde macromoleculaire complex kan worden geïdentificeerd met behulp van monoklonale antilichamen (mAb) als specifieke kinetische en structurele markers. Bijvoorbeeld, zodra een complex wordt gevormd, kunnen monoklonale antilichamen worden toegevoegd die aan specifieke componenten binden. Deze methode wordt het vaak gebruikt in EM om specifieke onderdelen binnen grote verzamelingen¹⁵te identificeren. Een andere beperking is gerelateerd aan de grootte van het complex, al zijn er gevallen waar gedefinieerde symmetrische vergaderingen zo klein als 70 kDa (GroES heptamer) zijn gemakkelijk met behulp van opgelost negatieve vlek EM. Geassembleerde complexen die zijn geanalyseerd door EM zijn meestal in de groottewaaier van ~ 100 Å diameter of hoger. Onlangs echter eiwitten zo klein als 20 kDa zijn opgelost en lage resolutie structuren zijn verkregen bij het gebruik van superieure methodologieën¹⁶kleuring.

Voor MS-analyse, kan de verhoogde gevoeligheid van huidige MS instrumentatie tot op het niveau van de femtomolar (attomoles) in sommige gevallen de gevoeligheid van BLI detectie verhogen. Het is zeer denkbaar dat eiwit signalen die aantonen dat een minimale maar herhaalbare stijging van de amplitudes leiden identificatie van het eiwit in kwestie tot zal. Bovendien, indringende eiwit-eiwitinteractie met één van de partners die zijn gekoppeld aan de biosensor en de andere in een cellulaire milieu zal in feite leiden tot een zuivering en vervolgens eenvoudiger detectie van het nieuw gevormde complex. Een beperking die kan worden waargenomen met de huidige systemen voor hooggevoelige MS is dat de proteïne van belang kan niet in de database, maar deze constatering zeldzaam is (bv . de proteomes van zeldzame soorten). Als de proteïnes van belang bekend zijn, wordt dit probleem gemakkelijk opgelost door de expressie gebrachte eiwitten aminozuur volgorde in een achtergrond eiwit database (zoals beschreven in dit werk in de sectie protocol). Een andere mogelijke beperking van de resultaten van de methodologie van de weerstand van een eiwit aan trypsinolysis. Spijsvertering van de trypsine is meestal de standaardmethode voor bottom-up eiwit identificatie. Eiwitten kunnen echter resistent tegen trypsine als ze Arg en Leie residuen missen of toegang tot deze residuen worden beperkt door de gevouwen structuur. Deze beperkingen zijn opgelost, respectievelijk door het gebruik van alternatief of een combinatie van proteasen of met inbegrip van een zich ontwikkelende reagens gebruikt wordt (ureum of guanidine HCl, zoals aangegeven in 1.1.14 en 1.2.6) voor enzymatische spijsvertering.

Mogelijke uitbreidingen van deze methodologie opnemen waarmee de gebruiker te volgen en identificeren van cellulaire vergadering complexen van ruwe cellulaire lysates. Het blijkt dat de testen voor montage onderdelen in geconcentreerde extracten van de cellulaire is gemakkelijk uit te voeren met behulp van de biolayer interferometrie procedures. In tegenstelling tot de meer algemeen gebruikte microfluidic gebaseerd methodologieën die naar voren gebogen tot verstopping en gevoelig voor aggregatie, kan de BLI benadering worden gebruikt om te dompelen direct biolayer sensor tips in grove extracten potentieel direct monteren specifieke complexen uit deze geconcentreerde onzuiver monsters. Eenmaal gemonteerd, is het volledig haalbaar met specifiek antilichaam sondes als follow-up van het BLI systeem nader te identificeren en kwantificeren zelfs verdachte componenten in cellulaire extracten die werden geïdentificeerd met behulp van de methode microvolume MS. Nogmaals, de sleutel is hier is het gebruik van gedefinieerde, goed georiënteerde kern eiwitten zoals specifieke affiniteit sondes.

Mogelijkheden voor het weergeven van de prepore om het overgangsproces kinetisch met BLI porie zullen zeer nuttig in het identificeren van potentiële "anti-toxine" klein molecuul remmers van de eiwit-overgangen die specifiek onder laat endosomal, lage pH (5.0 werken) voorwaarden. Deze pH geïnduceerde prepore aan de porie van overgang in het bijzijn van de stabilisator (osmolytes) vouwen zoals glycerol of sacharose wordt geremd, en dus leent krachtige steun voor de ontwikkeling van de specifieke gerichte opvouwbare stabilisatoren die voorkomen PA dat_porie vorming. Deze specifieke aanpak voorkomt en vervangt ruwe aggregatie gebaseerde testen waar pH druppels leiden tot eiwit neerslag. Deze laatste methode, leidt hoewel goed voor primaire prescreening methoden, vaak tot vals-positieve resultaten waar specifieke verbindingen remmen de samenvoeging in plaats van de werkelijke moleculaire overgangen.

De downstream opmerkingen van de structuur en identificatie van de individuele geassembleerde componenten binnen kleine microvolume monsters kunnen ook nuttig zijn bij het valideren van potentiële loodverbindingen. Dit kan worden toegepast in gevallen waarin specifieke vergadering stabilisatie of destabilisatie het resultaat van de doelgroep is. Deze parallelle aanpak van kinetische/structuur/identificatie is handig voor het direct bevestigen van de geldigheid van de samengestelde effectoren vermoedelijke voorsprong van vergadering en dient als een redelijke secundaire screening stap of middellange doorvoer aanpak.

Cryo-EM is een nuttige techniek aan de studie van de atomaire details van macromolecule complexen in verschillende staten van vergadering. Voorafgaand aan de voorbereiding van cryo-EM monsters, is het belangrijk eerst controleren of dat een preparaat bevat redelijk zuivere homogene complexen met negatieve vlek EM. De hier vermelde werk toont vergadering van eiwitcomplexen op BLI biosensor oppervlakken, vrijlating van deze complexen voor EM visualisatie, en de identificatie van deze onderdelen met behulp van MS. Deze bijzondere methode van gecontroleerde vergadering en release kunnen nuttig zijn bij het genereren van zeer specifieke protocollen die homogene sequentiële monstervoorbereiding voor negatieve vlek EM, een noodzakelijke stap die moet worden aangetoond voordat bevorderen om te verbeteren Cryo-EM. Met het oog op een lage resolutie 3D-structuur, zou slechts 30-50 deeltjes van complex nodig zijn voor het uitvoeren van een reeks van conische tilt (70 verschillende 2D-afbeelding meningen per deeltje) mits er verscheidenheid van oriëntatie (meerdere verschillende meningen is).

Met betrekking tot het verbeteren van de MS-methoden, blijven voorschotten in gevoeligheid en vermindering van monstervolume verbeteren. Nano stromen en ultra hogedruk-vloeistofchromatografie samen met de ontwikkeling van massaspectrometers met een snel recht fiets, verhoogde gevoeligheid en oplossen van macht. Recente introductie van de orbitrap massa spectrometer, met name de nieuwste versie (orbitrap Fusion Lumos, en de verwachte opvolger van de Orbitrap Fusion Lumos 1M), evenals de zoektocht algoritmen sterk vergemakkelijken dit proces.

De huidige methode controleert de kinetische montage en demontage van miltvuur toxine componenten met behulp van label-vrije BLI methodologieën en resulteert in de structuur en de identiteit van deze componenten met behulp van EM en MS, respectievelijk. Het gebruik van een eenvoudige enkellijns BLI systeem in combinatie met routine negatieve kleuring EM analyse en elementaire MS technieken zijn meer dan voldoende te karakteriseren van een assemblage proces.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0.5 mL black microtubes	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å	ThermoFisher Scientific	164561
Acetic acid glacial	Fisher	A38SL-212
Acetonitrile	Fisher	A955-4
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips	Forte Bio	18-5092
Ammonium bicarbonate	Fisher	A643-500
Anotop 10 syringe filter, 0.02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Boric acid	Fisher Scientific	10043-35-3
Capillary Morphogenic Gene-2			Protein produced and purified in-house
Carbon coated Cu 300 grid	Electron Microscopy Sciences	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Formic acids	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals,LLC	100-351
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JEOL
L-cystiene hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Lethal Factor N-terminal domain			Protein produced and purified in-house
MS software version 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system	Ted Pella, Inc	91000
Protective Antigen prepore			Protein produced and purified in-house
Qualitative filter paper circles	Fisher Scientific	09-795C 5
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sequest HT search engine	ThermoFisher Scientific
Sodium acetate trihydrate	Fisher Scientific	BP334-500
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Sodium cholate	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Tris base	Fisher Scientific	BP152-10
Uranyl formate (UF)	Electron Microscopy Sciences	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487