Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57921

⸱

10 juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Presenteren we een protocol voor snelle, efficiënte en bulk chemische terugkeer van conventionele lineage-primer menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) in een epigenomically-stable naïef voor inplanting epiblast-achtige pluripotente staat. Deze methode resulteert in verminderde lineage-primer genexpressie en duidelijke verbetering gestuurde multilineage differentiatie over een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen.

Samenvatting

Naïef menselijke pluripotente stamcellen (N-hPSC) met verbeterde functionaliteit wellicht een brede uitstraling in de regeneratieve geneeskunde. Het doel van dit protocol is efficiënt lineage-primer, conventionele menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) bijgehouden op feeder-vrije of feeder-afhankelijke voorwaarden aan een naïef-achtige pluripotent met verbeterde functionaliteit te herstellen. Deze chemische naïef terugkeer methode maakt gebruik van de klassieke leukemie remmende factor (LIF), GSK3β, en MEK/ERK inhibitie cocktail (LIF-2i), aangevuld met alleen een tankyrase-remmer XAV939 (LIF-3i). LIF-3i hersteld conventionele hPSC een stabiele pluripotente staat aanneming van biochemische, transcriptionele en epigenetische kenmerken van de menselijke pre-implantatie-epiblast. Deze methode LIF-3i vereist minimale cel cultuur manipulatie en is zeer reproduceerbaar in een breed repertoire van menselijke embryonale stamcellen (hESC) en menselijke transgenic-vrije geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen. De LIF-3i-methode vereist geen een opnieuw aanzuigende stap vóór de differentiatie; N-hPSC rechtstreeks met extreem hoge efficiëntie kan worden gedifferentieerd en onderhouden van karyotypic en epigenomic stabilities (ook op ingeprinte loci). Het vergroten van de universaliteit van de methode, worden de conventionele hPSC eerst gekweekt in de cocktail van de LIF-3i aangevuld met twee extra kleine moleculen die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i) signalering. Deze korte LIF-5i aanpassing stap aanzienlijk verbetert de eerste klonale uitbreiding van conventionele hPSC en vergunningen kunnen worden vervolgens naïef-teruggekeerd met LIF-3i alleen in grote hoeveelheden, dus het wegnemen van de noodzaak van picking/subcloning zeldzame N-hPSC kolonies later. LIF-5i-gestabiliseerde hPSCs worden vervolgens bijgehouden in LIF-3i alleen zonder de noodzaak van anti-apoptotic moleculen. Bovenal verbetert LIF-3i terugkeer aanzienlijk de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC door dalende hun lineage-primer genexpressie en wissen van de interline variabiliteit van gestuurde differentiatie algemeen waargenomen onder onafhankelijke hPSC lijnen. Representatieve karakterisaties voor N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd zijn verstrekt, en experimentele strategieën voor functionele vergelijkingen van isogene hPSC in bloedlijn-primer vs. naïef-achtige Staten worden beschreven.

Inleiding

Het 2i (MEK/ERK en GSK3β-remmer) cultuur systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld om heterogene serum gebaseerde muis embryonale stamcellen (mESC) culturen tot een uniforme grondtoestand van pluripotent verwant aan de muis voor inplanting epiblast1te verfijnen. 2i biedt echter geen ondersteuning voor de stabiele onderhoud van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) lijnen2. De verschillende complexe klein molecuul, groeifactor-aangevuld, en transgene benaderingen hebben onlangs gemeld om vast te leggen van vermeende soortgelijke menselijke naïef-achtige pluripotente moleculaire stelt2. Echter veel van de "naïeve-achtige" toestanden aangemaakt met deze methoden ook tentoongesteld karyotypic instabiliteit, epigenomic gebreken (bijvoorbeeld globale verlies van ouderlijke genomic imprinting), of verminderde potentiële differentiatie.

In contrast, de cocktail van triple chemische remming van GSK3β, ERK en tankyrase signalering en leukemie remmende factor (LIF-3i) was voldoende om de stabiele naïef-achtige terugkeer van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen3. LIF-3i-teruggekeerd naïef hPSC (N-hPSC) onderhouden van normale karyotypes en verhoogde hun uitdrukkingen van naïef-specifieke menselijke voor inplanting epiblast genen (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i terugkeer ook verleende hPSC met een array van moleculaire en biochemische kenmerken die uniek zijn voor mESC-achtige naïef pluripotent die verhoogde gefosforyleerd STAT3 signalering opgenomen, daalde ERK fosforylatie, global 5-methylcytosine-apr hypomethylation, genoom-brede apr demethylatie op embryonale stamcellen (ESC)-specifiek gen initiatiefnemers en dominante distale OCT4 versterker gebruik. Bovendien, in vergelijking met andere naïef terugkeer methoden die in aberrantly hypomethylated resulteerde bedrukt genomic loci, N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd waren verstoken van systematische verlies van ingeprinte CpG patronen of DNA methyltransferase expressie (b.v., DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Een directe LIF-3i cultuur van een breed scala aan conventionele menselijke embryonale cellen (hESC) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) gegroeid op feeders of E8 feeder-vrij voorwaarden bereikt snelle en bulk terugkeer naar een naïef epiblast-achtige toestand. Directe LIF-3i naïef terugkeer kan evenwel in sommige unstable conventionele hPSC lijnen als gevolg van de inherente genomic en lineage-primer variabiliteiten die voortvloeien uit de genetisch divers donor achtergronden inefficiënt.

Dus, het verbreden van het nut van de LIF-3i-methode, een stapsgewijze optimalisatie werd ontwikkeld en hierin wordt gepresenteerd waarmee universele naïef terugkeer met bijna elke conventionele hESC of transgenic-vrije hiPSC lijn gekweekte op feeders. Deze universalized naïef terugkeer methode maakt gebruik van een voorbijgaande eerste cultuur stap in conventionele hPSC dient als aanvulling op de LIF-3i cocktail met twee extra kleine moleculen (LIF-5i) die versterken proteïne kinase een (forskolin) en sonic hedgehog (sHH) ( purmorphamine) signalering. Één van de eerste passage van conventionele hPSC in LIF-5i past hen tot latere stabiele LIF-3i terugkeer in grote hoeveelheden. Eerste LIF-5i aanpassing verhoogt aanzienlijk de eerste eencellige klonale verspreiding van conventionele hPSC geteeld op E8 of feeders (vóór hun latere stabiele, continue passage in LIF-3i alleen). Conventionele hPSC lijnen aangepast eerst tolereren op één passage in LIF-5i latere bulk klonale passaging van cellen naïef-teruggekeerd in LIF-3i voorwaarden, die ondervangt de behoefte aan plukken en subcloning van de zeldzame stabiele kolonies, of het routinematig gebruik van anti-apoptotic moleculen of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) remmers.

De methode LIF-3i heeft gewerkt voor stabiel uitbreiden en onderhouden van een breed repertoire van > 30 onafhankelijke, genetisch divers conventionele hPSC lijnen voor > 10 – 30 passages met behulp van beide methoden niet-enzymatische of enzymatische dissociatie, en zonder bewijs van inductie van chromosomale of epigenomic voorkomende afwijkingen, waaronder afwijkingen op ingeprinte gene loci. Bovendien, sequentiële LIF-5i/LIF-3i cultuur is de enige naïef terugkeer methode die tot nu toe heeft gemeld dat de functionele pluripotent van een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen verbetert door het verlagen van hun afkomst-primer genexpressie en drastisch verbeteren van hun potentie multipotente differentiatie. De LIF-3i naïef terugkeer methode wist de inherente zal variabiliteit van differentiatie van lineage-primer, conventionele hPSC lijnen interline, en een groot nut van toepassing in de regeneratieve geneeskunde en cellulaire therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden verricht overeenkomstig de dierenverzorgers richtlijnen en protocollen die zijn goedgekeurd door de Johns Hopkins School of Medicine Institute of Animal Care en gebruik Comité (IACUC).

1. voorbereiding van muis embryonale fibroblasten (MEF) Feeder-afhankelijke conventionele (hESC medium/MEF) of naïef-teruggekeerd (LIF-3i medium/MEF) hPSC cultuur

  1. Kopen of bereiden van in-house laag-passage leveringen van MEF feeders uit CF1 of CF1 x DR4 hybride E13.5 muis embryo's na gepubliceerde protocollen4.
    1. Cryopreserve lage passage (p1-p2) MEF culturen pre (voor lange termijn opslag) of (voor maximaal 6 maanden) na bestraling en winkel in vloeibare stikstof zoals eerder beschreven4.
    2. Bestralen (5.000 rad) bulk uitgebreide MEF onder p5 met behulp van een γ - of X-Vleug-irradiator en voorbereiden aliquots bij 1.5 x 106 cellen per flacon op korte termijn opslag (minder dan 6 maanden) bij-80 ° C in een ultra-lage temperatuur vriezer.
    3. Plaat tussen 1.2 x 106 (vers bestraald niet-cryopreserved) en 1,5 x 106 (bestraalde cryopreserved) MEF per één 6-well gelatinized plaat voor het voorbereiden van feeder culturen, zoals hieronder beschreven.
  2. Bereid gelatine beklede 6-well steriele Weefselkweek behandeld platen door toevoeging van 1,5 mL steriele 0,1% gelatine oplossing aan elk putje in een biologische veiligheidskast.
  3. Incubeer gelatine beklede platen bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur of overnachting in een laboratorium CO2 incubator.
  4. Op de volgende dag, ontdooien lage doorgang (bijvoorbeeld P2 naar P4) DMSO-cryopreserved en bestraald (5.000 rad) MEF volgens de stappen die hieronder worden aangegeven.
    Opmerking: Nietdoorstraald MEF moet ook worden ontdooid, uitgebreid en bestraald onmiddellijk vóór gebruik.
  5. Plaats een cryopreserved MEF aliquot in een waterbad 37 ° C. Bij het ontdooien, steriliseren van de buis met ethanol en onmiddellijk de DMSO cryoprotectant ten minste 10-fold met MEF medium (tabel 1) verdund in een kabinet bioveiligheid (bijvoorbeeld overdracht 1 mL DMSO-MEF aliquot tot 9 mL MEF medium in een steriele 15 mL conische).
  6. Centrifugeer het verdunde MEF cellen bij 200 x g gedurende 5 min in steriele 15 mL conische buisjes.
  7. In een kabinet bioveiligheid, gecombineerd en verwijder het supernatant cel-vrij en resuspendeer de pellet cel in 1-2 mL verse MEF medium.
  8. Zachtjes negeren de gelatine-oplossing en voeg toe 2 mL MEF opnieuw geschorst in het medium MEF aan elk putje van een gelatinized 6-well plaat, zoals hierboven aangegeven. Graaf MEF cellen en plaat 1.2 x 106 (vers bestraald niet-cryopreserved) of 1.5 x 106 (bestraalde cryopreserved) MEF per één 6-well gelatinized plaat.
    Opmerking: Alle platen van cel-cultuur die uit de CO2 incubator worden overgedragen aan de bioveiligheid kabinet kunnen voorzichtig worden afgeveegd met ethanol-gespoten papier maar moeten niet worden rechtstreeks gespoten op met 70% ethanol oplossing om te voorkomen dat ethanol verspreiding in de putjes.
  9. Incubeer MEF platen bij 37 ° C's nachts in een laboratorium CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer) zodat de bijlage, voorafgaand aan het gebruiken.

2. bulk stabilisatie van conventionele hPSC culturen voor latere naïef terugkeer met een korte LIF-5i aanpassing stap

  1. Alle conventionele hPSC lijnen voor het bezitten van een normale karyotype door G-banding, vóór begin LIF-5i/LIF-3i terugkeer te valideren.
    Opmerking: LIF-3i terugkeer van hoge-passage conventionele hPSC lijnen (bv., P > 40 – 50) moet worden vermeden, omdat deze culturen al genomic aberraties die negatieve invloed hebben op bulk, stabiel en efficiënt LIF-3i terugkeer van Primer haven kunnen kunnen, convetional hPSC lijnen.
  2. Onderhouden en uitbreiden van conventionele hPSC culturen met gevalideerde normale karyotypes in een MEF-gebaseerde cultuur-systeem (zoals uiteengezet in sectie 1) of een feeder-vrije cultuur systeem (volgens de onderzoeker de voorkeur).
    Opmerking: Beide feeder-afhankelijke hPSC/MEF cocultures (b.v., hESC medium (tabel 1) aangevuld met 4 – 10 ng/mL bFGF) of feeder-gratis (bv., E8- 5 of mTSER 6 -media (volgens de instructies van de fabrikant op vitronectin-gecoate platen) methoden zijn compatibel met bulk naïef terugkeer met behulp van de LIF-5i/LIF-3i/MEF systeem (Figuur 1). Niet-enzymatische methoden hebben de voorkeur voor de passaging van conventionele hPSC vóór hen voorbereiden op terugkeer. LIF-5i en LIF-3i media formuleringen bevatten geen antibiotica of antifungale agenten. Standaardwerking voorschriften inzake bioveiligheid kabinet steriliteit en onderhoud wordt verwacht dat het strikt in acht worden genomen om eventuele bacteriële of schimmel verontreiniging te voorkomen.
  3. Voorbereiden voor de MEF gebaseerde cultuur systeem, MEF feeders in de gelatinized 6-well plaat zoals beschreven in sectie 1 ten minste één dag voor de passaging van conventionele hPSC LIF-5i-aangepast culturen.
  4. Nadat conventionele hPSC culturen hebben bereikt ~ 50% confluentie (dat wil zeggen, 3-5 dagen na de eerste beplating), vervangen de standaard hESC-kweekmedium met LIF-5i medium (2 mL per putje; Tabel 1).
    Opmerking: Deze stappen uitvoeren in een kabinet bioveiligheid.
  5. Cultuur en conventionele hPSC/MEF gedurende maximaal 2 dagen in LIF-5i in de CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Aangepast dat het LIF-5i medium dagelijks aan te passen voor hun latere passage en stabiele terugkeer in LIF-3i.
  6. Als alternatief voor de conventionele feeder-vrije culturen (bvin E8), cultuur hPSC in LIF-5i alleen overnachting vóór passaging de volgende ochtend.
    Opmerking: LIF-5i en LIF-3i culturen kunnen zowel worden gehandhaafd met atmosferische (21% O2) of fysiologische (5% O2) zuurstof niveaus in de CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer).
  7. Voorafgaand aan passaging, plaats van de cultuur-platen in een kast van bioveiligheid, wassen LIF-5i-aangepast conventionele hPSC keer met PBS en voeg 1 mL van cel dissociatie reagens toe aan elk putje. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een broedstoof CO2 , en zachtjes triturate met een pipet in een enkele cel schorsing terug in het biosafety kabinet.
    Opmerking: Niet-enzymatische dissociatie buffers kunnen als alternatief worden gebruikt voor het voorbereiden van afzonderlijke cellen voor passaging.
  8. Verzamel de celsuspensie in hESC medium (op zijn minst 2-fold verdunning) in een conische buisjes van steriele 15 mL, en zachtjes triturate cellen door pipetteren om te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel.
  9. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min aspirate/negeren het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 1-2 mL van het LIF-5i medium in de kast bioveiligheid. Met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller cellen tellen.
  10. Wassen van de vooraf vergulde MEF plaat twee keer met PBS (2 mL per putje in 6-Wells-platen) en 1-2 x 106 cellen (in 2 mL LIF-5i medium) op 1 van de PBS-gewassen MEF plaat goed verspreiden.
  11. Aanpassen en optimaliseren van eerste plating dichtheden voor elke individuele hPSC regel als naïef-teruggekeerd, mogelijk replating efficiëntie zeer variabel. Plaats de plaat in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer).
    Opmerking: Het routinematig gebruik van anti-apoptotic reagentia wordt niet aanbevolen voor de meeste hPSC lijnen met deze methode. Het systeem van de LIF-5i verbetert al tot een aanzienlijke initiële bulk klonen opnieuw identificatietekens Efficiency van conventionele hPSC lijnen. Echter een eenmalig gebruik van ROCK-remmer (5 – 10 μM Y-27632) kan verdere verbetering van de initiële LIF-5i klonen opnieuw identificatietekens efficiëntie van conventionele hPSC culturen in de eerste passage voor sommige unstable lineage-primer hPSC lijnen met de neiging tot spontane differentiatie.
  12. Als één putje van de gedissocieerde conventionele hPSC aangepast in LIF-5i in feeder-vrije culturen (bv, E8), rechtstreeks vanaf overbrengt bestraald een MEF-verguld goed (dat wil zeggen, passage van 1:1).
  13. De volgende dag, swirl zachtjes de plaat te heffen alle cellen van de niet-ingeschrevenen, gecombineerd het medium (PBS wassen is optioneel) en 2 mL LIF-5i voedingsbodem te vervangen. Voer deze stap in een bioveiligheid kast dagelijks gedurende 3-5 dagen of totdat de cellen zijn 60-70% heuvels (Figuur 1). Plaats de plaat in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer).

3. op lange termijn onderhoud en uitbreiding van N-hPSC in LIF-3i Medium

  1. Na aanvankelijke LIF-5i aanpassing, passage latere stabiele LIF-3i culturen elke 3-4 dagen in een kabinet bioveiligheid, of bij culturen worden 60-70% heuvels (Figuur 1).
    Opmerking: LIF-3i culturen vereist strenge onderhoud en N-hPSC culturen te bereiken hoog confluentie/celdichtheid van langdurige cultuur toe te staan (bijv., > 4 dagen) verlaagt de daaropvolgende klonen opnieuw identificatietekens efficiëntie, en bevordert spontane differentiatie.
  2. In een kast bioveiligheid, negeren het kweekmedium en wassen elk goed voor LIF-5i/LIF-3i culturen door zachtjes toevoeging van 2 mL PBS. Negeren van PBS en voeg 1 mL cell detachement oplossing. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer).
  3. Verzamelen van de celsuspensie, hESC medium toe te voegen (zonder remmers of groeifactoren (tabel 1); ten minste 2-fold verdunning) om te herstellen van alle hPSC en zachtjes triturate cellen door pipetteren om te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Spoel de suspensie aan een steriele 15 mL conische buis.
  4. Centrifugeer bij 300 g gedurende 5 min en aspirate/negeren het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in LIF-3i medium. Met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller cellen tellen.
  5. Plaat ~ 2 x 105 cellen per putje op de bestraalde MEF in de gelatinized 6-well plaat voor routine passaging van LIF-3i culturen. Plaat voor de initiële LIF-5i-aangepast culturen, een aanvankelijk hogere dichtheid (4 x 10,5 cellen/well) voorafgaand aan de eerste passage in LIF-3i/MEF.
  6. Opnieuw plaat en distribueren van LIF-5i-aangepast hPSC op verse PBS gewassen bestraalde MEF feeder platen (bereid de vorige dag als hierboven) in het medium LIF-3i. Het medium LIF-3i dagelijks vervangen.
  7. Passage N-hPSC voor minst 4 – 7 continu bulk passeren in de LIF-3i middellange voorafgaand aan het gebruik van N-hPSC in functionele studies of cryopreservatie. Registreren van het aantal passages van N-hPSC in hetzij conventionele of LIF-3i media.
    Opmerking: LIF-3i terugkeer van hoge-passage (b.v. > p40) afkomst-primer, conventionele hPSC lijnen wordt niet aanbevolen. Een inspanning moet worden gedaan om terug te keren van conventionele hPSC lijnen bij de laagste passage los dat ze beschikbaar zijn. Bovendien is het gebruik van een LIF-3i-teruggekeerd hPSC die groter is dan 10 LIF-3i passages hebben ondergaan niet aanbevolen voor functionele studies, aangezien dergelijke N-hPSC culturen karyotypisch-abnormale klonen als gevolg van langdurige klonale celselectie cultuur haven kunnen. Verse LIF-5i/LIF-3i reversions van lage-passage conventionele hPSC lijnen moeten worden uitgevoerd voor functionele studies, voorraden van N-hPSC met < 10 passages in LIF-3i zijn niet beschikbaar.

4. cryopreservatie en ontdooien van N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd

  1. Vouw teruggekeerd N-hPSC voor ten minste 5-7 passages in LIF-3i, zoals hierboven aangegeven, voorafgaand aan het gebruik in functionele studies of op lange termijn cryopreservatie. Record het aantal passages in conventionele voorwaarden en in LIF-3i voorwaarden op elk cryopreserved vial.
    Opmerking: Overmaat LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC niet gebruikt in de functionele testen kan worden cryopreserved bij elke passage, maar bevriezing van lagere na terugkeer passages (bijvoorbeeld., < p3) kan resulteren in armen, of zeer variabel na dooi herstel efficiëntie.
  2. In een kast bioveiligheid, gecombineerd het kweekmedium, cellen in PBS (2 mL per putje) wassen, gecombineerd PBS en distantiëren hPSC kolonies in afzonderlijke cellen met behulp van mobiele-detachement oplossing (1 mL per putje). Plaats de plaat gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Verdun de cel detachement oplossing met de LIF-3i-medium (2-fold), verzamelen hPSC in een steriele 15 mL kegelvormig, centrifugeer cellen bij 200 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet cel in LIF-3i medium (1-2 mL per well-equivalent). Het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cel teller.
  3. Centrifugeer N-hPSC in het LIF-3i medium (200 x g gedurende 5 minuten) en resuspendeer de cellen in een kabinet van bioveiligheid in de ijskoude oplossing (tabel 2), bij een dichtheid van ten minste 1 x 106 cellen/mL.
  4. Pipetteer cellen in de lange termijn opslag cryogene buizen en leg in een langzaam-bevriezing container. Toestaan dat de monsters te bevriezen 's nachts in een vriezer-80 ° C.
  5. De volgende dag, breng de cryovials in een vloeibare stikstof vriezer voor langdurige opslag.
  6. Voor het ontdooien, plaats de bevroren ampul in een waterbad 37 ° C gedurende ~ 2 minuten Sterilize de flacon (dat wil zeggen, ethanol spray), breng hPSC in een steriele 15 mL conische en langzaam Verdun het medium van de cellen inzake 10-fold in hESC (tabel 1) aangevuld met 5 μM van Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) remmer Y-27632 binnen een steriele biologische veiligheid kap kabinet.
  7. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. In een kast bioveiligheid, verwijder cel-vrije supernatant en resuspendeer de pellet cel in LIF-3i medium (1-2 mL) aangevuld met 5 μM ROCK remmer Y-27632.
    Opmerking: Uitsluiting van Y-27632 zal leiden tot slechte na ontdooien herstel efficiëntie (Figuur 2).
  8. Overdracht van de ontdooide cellen geresuspendeerde in LIF-3i/ROCK remmer op de PBS-gewassen MEF basisstuk putten. Cryopreserve LIF-3i culturen bij een dichtheid van 1 x 106 cellen per flacon. Elk van deze flesjes op feeders in een put van een gelatinized 6-well-plate ontdooien.
  9. De volgende dag, start reguliere LIF-3i middellange uitbreiding zonder Rho kinase inhibitor.

5. feeder verwijdering voor de verzameling van N-hPSC monsters

  1. Ter voorbereiding van de monsters van LIF-3i/MEF (of hESC/MEF conventionele) culturen (dat wil zeggen, voor de expressie van genen (bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR, microarrays) of eiwitten (bijvoorbeeld westelijke vlek) analyses, afbreken LIF-3i culturen van MEF feeders gebruik Magnetische geactiveerd cel sorteren (MACS) met anti-TRA-1-81 antilichaam gecoat microbeads volgens protocol van de fabrikant.
  2. Alternatief, gebruik de volgende eenvoudige pre beplating methode om het afbreken van de culturen van feeders, zoals hieronder beschreven.
  3. In een steriele biologische veiligheid kap kabinet, verwijder het supernatant cel-vrij, wassen van de pellet met 2 mL steriele PBS per well. Loskoppelen aanhangend LIF-3i/MEF culturen met behulp van mobiele-detachement oplossing (1 mL/putje). Incubeer gedurende 5 min. in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Verzamelen hPSC in een steriele 15 mL kegelvormig. Wassen 2-fold in hESC medium, overdracht cellen de steriele 15 mL conische en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
  4. In een kast bioveiligheid, resuspendeer elk putje van LIF-3i/MEF losgekoppeld cellen in 2 mL van het medium LIF-3i en rechtstreeks overbrengen naar een nieuwe put van een 6-well plaat die vers heeft zijn bekleed met 0,1% gelatine.
  5. Incubeer LIF-3i/MEF hPSC cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C in een CO2 incubator (5% CO2, vochtige atmosfeer). Het verzamelen van niet-aanhanger cellen met een pipet in een nieuwe conische buis. Zacht, voeg 2 mL van hESC medium aan elk putje en wervelen om te verzamelen van de resterende niet-aanhanger cellen.
    Opmerking: De meerderheid van de bestraalde MEF zal hechten aan de gelatinized plaat in 1 h, de meerderheid van de hPSC verlaten in suspensie.
  6. Combineer en centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen in PBS. Module-freeze de cel pellet in vloeibare stikstof na het centrifugeren, of als alternatief resuspendeer korrels in een lysing buffer die compatibel is met de downstream eiwit of nucleïnezuur analyse (Figuur 2B).
  7. Karakterisaties LIF-3i hPSC lijnen met een bijpassende conventionele voorbehandelde isogene hPSC-besturingselement uit te voeren.
    Opmerking: Vanwege de intrinsieke variabiliteit tussen en binnen de primer culturen, relevante controlegroepen zijn bereid op een bijpassende timepoint in cultuur of vóór naïef terugkeer. Gedetailleerde protocollen en materialen voor downstream immunefluorescentie bioimaging, stroom cytometry westelijke bevlekken, genexpressie (RT-PCR-testen en microarrays), methylering studies (dot vlek, CpG methylation microarray), OCT4 proximale en distale enhancer overwicht verslaggever testen en signalering remmer vitrotests vindt u elders3.

6. post naïef terugkeer: validatie van Genomic integriteit en retentie van ouderlijke stempelt van LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC vóór gebruik in functionele Assays

  1. Het scherm van de eerste primer, conventionele hPSC culturen voor het bezit van een normale karyotype (b.v.met Giemsa-band kleuring analyse met behulp van gepubliceerde methoden 7) voordat LIF-5i/LIF-3i terugkeer.
    Opmerking: Dit is het verwijderen van conventionele hPSC populaties die kunnen haven abnormale genomic veranderingen die artefactual selectieve overleving voordeel in klonen LIF-3i voorwaarden kunnen rijden.
  2. Voor een optimaal resultaat vers terugkeren conventionele hPSC culturen aan een naïef-achtige toestand met LIF-3i verscheidene weken voorafgaand aan het gebruik ervan in functionele studies of differentiatie gericht.
    Opmerking: Routine verlengd 'onderhoud' cultuur in LIF-3i voorwaarden voor meer dan 10 passages volgende naïef terugkeer wordt niet aanbevolen. Routine uitbreiding en het onderhoud van hESC en hiPSC lijnen moeten worden uitgevoerd met behulp van conventionele cultuur systemen (bijvoorbeeld in E8 of MEF/hESC medium met bFGF).
  3. Na teruggekeerd N-hPSC lijnen te beoordelen voor het behoud van normale karyotypes 5 – 7 passages na LIF-3i terugkeer (bv., met Giemsa-band kleuring analyse7, of een andere methode van keuze).
  4. Alle teruggekeerd N-hPSC regels voor het bewaren van normale ouderlijke genomic opdrukken beoordelen door een analyse van de methylering van het DNA van keuze (bijvoorbeeldprotocollen voor CpG DNA microarray analyse van ouderlijke opdrukken in LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC vindt u elders3 ) na 5 – 10 passages van LIF-3i terugkeer.

7. post naïef terugkeer: Experimentele Design richtlijnen voor kwantitatieve gestuurde differentiatie testen met behulp van N-hPSC LIF-3i-teruggekeerd

  1. Direct gebruiken LIF-3i N-hPSC in gevestigde gestuurde differentiatie protocollen zonder extra cel cultuur manipulaties.
    Opmerking: Opnieuw priming (dat wil zeggen, N-hPSC terug omzetten in conventionele primer voorwaarden voorafgaandelijk aan het gebruik ervan in gestuurde differentiatie testen) is niet nodig met de LIF-3i-methode en wordt niet aanbevolen.
  2. Om te controleren voor de effecten van de bepaling en interline variabiliteit in de functionele testen van individuele hPSC lijnen, kruis-valideren de geslacht-specifieke differentiatie potencies door gebruik te maken van onafhankelijke differentiatie protocollen met ten minste drie hPSC lijnen afgeleid van onafhankelijke genetische achtergronden (dat wil zeggen, meerdere donor afkomstige hiPSC en hESC).
  3. Voor de functionele vergelijkingen, broer of zus culturen, gelijkwaardige passage, en uit dezelfde (isogene) hPSC lijn parallel aan de conventionele lineage-primer en instellen LIF-3i-teruggekeerd hPSC culturen. Handhaven van de primer/naïef sibling isogene hPSC culturen in hun respectieve media (bv., E8 vs. LIF-3i), en tegelijkertijd onderscheid maken met behulp van identieke differentiatie protocollen en materialen, om te elimineren experimentele vooringenomenheid (Figuur 4).
  4. Voor isogene primer naïef hPSC vergelijkingen, aanpassen en optimaliseren van eerste plating dichtheden voor elke individuele differentiatie assay.
    Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor neurale voorlopercellen, definitieve endoderm en hemato-endothelial gestuurde differentiatie van LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC vindt u elders 3. LIF-3i-teruggekeerd N-hPSC hebben meer robuuste proliferatieve en differentiatie capaciteit in de gestuurde differentiatie testen dan conventionele hPSC. N-hPSC vereist meestal een lagere initiële plating concentratie dan de conventionele hPSC, en in tegenstelling tot hun conventionele primer hPSC tegenhangers, niet vereisen het gebruik van anti-apoptotic reagentia te verbeteren van hun klonen voortbestaan na enzymatische spijsvertering in differentiatie testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol optimaliseert efficiënte naïef-achtige terugkeer met LIF-3i in beide culturen feeder-afhankelijke en feeder-onafhankelijke lineage-primer conventionele hPSC (Figuur 1). Het gedetailleerd protocol, beschreven hierin, omtrekken sequentiële aanpassing aan LIF-3i vanaf beide feeder-afhankelijke- of feeder-vrije conventionele hPSC voorwaarden (bijvoorbeeld E8 medium).

Vertegenwoordi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De LIF-3i-systeem geldt een gewijzigde versie van de klassieke lymfkliertest 2i naïef terugkeer cocktail1 voor menselijke pluripotente stamcellen. De zelf-vernieuwing van hPSC (die kan niet uitbreiden in 2i alleen) is gestabiliseerd in LIF-2i beogen deze cocktail met XAV939 van de tankyrase-remmer. LIF-3i cultuur kunt bulk en efficiënte terugkeer van de conventionele hPSC naar een toestand van de pluripotente die lijkt op de menselijke voor inplanting epiblast

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Onder een licentie-overeenkomst tussen de technologieën van het leven en de Johns Hopkins University (JHU), heeft Dr. Zambidis recht op een deel van de royalty's, ontvangen door de Universiteit voor licentiëring van stamcellen. De bepalingen van deze overeenkomst worden beheerd door JHU overeenkomstig haar beleid van belangenverstrengeling. Dit neemt niet weg dat de naleving van de auteurs dagboek beleid over het delen van gegevens en materialen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door subsidies van NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland stamcel onderzoeksfonds (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award en de Moseley Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716gebruik 5µL per test (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708gebruik bij een 1:100 verdunning (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276gebruik bij 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315gebruik 5µL per test (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42gebruik 2µL per test (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250gebruik bij een 1:100 verdunning (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455gebruik bij een 1:100 verdunning (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695gebruik bij 1:1000 (Western blot), voor detectie van totaal eiwit
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370gebruik bij 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145gebruik bij 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432gebruik bij een 1:500-1:1000 verdunning (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Agebruik 5µL per test (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Ggebruik bij 1:50 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139gebruik bij 1:1000 (Western blot), voor detectie van totaal eiwit
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388gebruik bij een 1:50 verdunning (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Rgebruik bij  een 1:50 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068gebruik bij een 1:100 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069gebruik bij een 1:100 verdunning (live en gefixeerde immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193gebruik 10µL per test (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161gebruik 10µL per test (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183verdunningsmiddel voor Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstituteer bij 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945ook wel aangeduid als 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstituteer bij 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspendeer in water en steriliseer met een autoclaaf
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstituteer bij 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstituteer bij 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotech

Referenties

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Na eve pluripotente stamcellenLIF 3i methodehumane embryonale stamcellenge nduceerde pluripotente stamcellenfeeder vrije kweekcelpassagingimmunofluorescentiekleuringWestern blot analyseteratoomdifferentiatie
Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.