Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Samenvatting

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Samenvatting

Experimenten met behulp van geïsoleerde alvleesklier eilandjes zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes, maar eilandjes zijn duur en van beperkte overvloed. Eilandjes bevatten een gemengde celpopulatie in een gestructureerde architectuur invloed op functie en menselijke eilandjes zijn wijd variabele in cel type samenstelling. Huidige veelgebruikte methoden om te studeren van gekweekte eilandjes omvatten moleculaire onderzoeken uitgevoerd op hele eilandjes, eerste ongelijksoortige islet celtypes samen, of microscopie moleculaire studies over verspreide eilandjecellen, verstoren het eilandje platform. Voor in vivo islet studies is paraffine-ingebedde alvleesklier segmenteren een krachtige techniek om te beoordelen van cel-specifieke resultaten in de oorsprong van de alvleesklier. Studeren na cultuur eilandjes door paraffine afdelen zou bieden verschillende voordelen: detectie van meerdere resultaten op de dezelfde eilandjes (mogelijk zelfs de exacte dezelfde eilandjes, met behulp van seriële secties), cel-type-specifieke metingen en handhaving native eilandje cel-cel en cel-substraat interacties tijdens de experimentele blootstelling zowel voor analyse. Maar geïsoleerde bestaande technieken voor het insluiten van eilandjes na cultuur zijn inefficiënt, tijdrovend en gevoelig voor verlies van materiaal, en in het algemeen produceren secties met onvoldoende islet nummers nuttig voor het kwantificeren van de resultaten. Klinische pathologie laboratoriumfaciliteiten cel blok voorbereiding zijn ontoegankelijk en onpraktisch voor fundamenteel onderzoekslaboratoria. We hebben een betere, vereenvoudigde methode van bench-top dat secties met robuuste opbrengst en verdeling van de eilandjes genereert ontwikkeld. Vaste eilandjes zijn geresuspendeerde in warme histologische agarose gel en afgepipetteerde in een platte schijf op een standaard glasplaatje, zodanig dat de eilandjes worden gedistribueerd in een vliegtuig. Na standaard uitdroging en insluiten, kunnen meerdere (10 +) 4-5 µm secties worden gesneden uit hetzelfde islet blok. Met deze methode kunnen histologische en immunefluorescentie analyses worden uitgevoerd op de muis, rat en menselijke eilandjes. Dit is een effectieve, goedkope, tijdbesparende aanpak om te beoordelen van de resultaten van de cel-type-specifieke, intact-architectuur van gekweekte eilandjes.

Inleiding

Pancreas: eilandjes van Langerhans, de enige bron van het Circulerend insuline, zijn een kritische weefsel voor onderzoekers bestuderen van diabetes mellitus. Van een bepaald organisme hebben eilandjes variabele grootte, cel type frequentie en het platform^1,2,3. De conventionele strategie om te studeren in vivo structuur en samenstelling van de endocriene cellen van de alvleesklier eilandjes is door de alvleesklier weefsel^4,5te segmenteren. Aangezien de eilandjes vormen slechts een klein deel van de alvleesklier cellulaire totaalgehalte, worden moleculaire studies uitgevoerd op geïsoleerde eilandjes. Ex vivo islet cultuur experimenten, testen van de reactie op de voedingsstoffen, bieden gene modulatie (transfectie, transductie) of experimentele behandelingen belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen moduleren van overleving van de endocriene cel proliferatie en functie ^{5 , 6}.

Ex vivo islet experimenten worden vaak geanalyseerd met behulp van moleculaire studies van hele eilandjes of histologische of moleculaire studies van verspreide eilandjecellen gegroeid in enkelgelaagde^5,6. Moleculaire analyse van hele eilandjes introduceert de ernstige waarschuwing van vermenging celtypes, die vals-negatieve of vals-positieve resultaten wanneer geëxtrapoleerd naar elk afzonderlijke celtype kan produceren. Cel dispersie op coverslips voor microscopie na cultuur staat van cel-type-specifieke resultaten meting, maar verstoort islet architectuur, die reactie op interventie kan wijzigen en zich verzet tegen de identificatie van het platform-gerelateerde resultaten. Daarnaast, worden in het algemeen slechts een enkel resultaat uitgedrukt; bijvoorbeeld, voor het meten van beta celproliferatie en beta celdood onder dezelfde voorwaarden, twee aparte experimenten moeten worden uitgevoerd. Deze benaderingen zijn ook blind voor inter islet variabiliteit, een ruimte van toenemende belangstelling voor het veld. Sorteer eilandjecellen door stroom cytometry voor cel-type-specifieke moleculaire studies of eencellige RNA studies zijn elegant maar duur, tijdrovend, beperkt door weefsel overvloed, uitroeiing van het platform, en niet geschikt zijn voor routinematige cel cultuur analyses ^{5 , 7}. confocal beeldvorming van geheel-mount immunostained eilandjes levert kwalitatief hoogwaardige intact-architectuur gegevens, maar is arbeidsintensief, en gegevens die zijn verkregen van elk monster is beperkt tot resultaten identificeerbare in een enkele immunokleuring⁸.

De mogelijkheid voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van de hele eilandjes na cultuur zou kunnen veel van deze zorgen worden aangepakt. Hoge kosten, lage-overvloed islet weefsel van unieke genetische modellen of uit menselijke orgaandonoren of eilandjes status bericht in vivo of in vitro experimentele manipulatie, zijn kostbaar. Verkrijgen van meerdere paraffine secties van de dezelfde eilandjes zou meerdere cel-type-specifieke, intact-architectuur analyses van hetzelfde experiment.

Bestaande technieken voor het genereren van islet pellets voor afdelen zijn onvolmaakt. Histologie-geoptimaliseerde agarose is een waterige laag smeltpunt gel die veel gebruikt wordt bij de verwerking van histologische en cytologische specimens, met inbegrip van kleine en gefragmenteerde weefselsteekproeven die moeilijk te proces⁹. Een eilandje aanpak te embedding is naar de eilandjes in de agarose in de buis van een microcentrifuge op te schorten, centrifugeer pellet van het materiaal, ophalen van de agar stekker, dan verwerken en embed voor afdelen^10,11. Het uitpakken van het gestolde monster uit de onderkant van de buis is tijdrovend en moeilijk, wat leidt tot occasionele fragmentatie van het monster en risico van lichamelijk letsel. De eilandjes zijn geconcentreerd in het uiteinde van de stekker, leiden tot onvoldoende islet verdeling in secties die deze methode verkregen. De ronde onderkant van de stekker compliceert insluiten zodat een eilandje-arme regio kan worden aangeboden voor het segmenteren. Globaal, is deze methode leidt tot lage rendement en geklonterd islet distributie in de resulterende secties.

Deze nieuwe methode is een vereenvoudigde en verbeterde aanpak voor de voorbereiding van de secties van het eilandje. Eilandjes zijn geconcentreerd in een klein volume en vervolgens geplaatst op het gladde oppervlak van een microscoopglaasje vormen een kleine schijf, met de eilandjes in een enkel vliegtuig. De Histogel-islet schijf wordt vervolgens verwerkt voor paraffine insluiten in een verkorte uitdroging en xyleen infiltratie protocol. De vorige benadering, die zich de eilandjes in de bodem van een microfuge buis concentreert, wordt ook uitgevoerd als een vergelijking. Deze nieuwe techniek verbetert het rendement van eilandjes per sectie, de verdeling van de eilandjes in elke sectie en kost minder tijd om de islet blokken naar cassettes. Deze techniek is handig voor islet biologen of andere wetenschappers bestuderen van kleine stukjes weefsel productieve willen maximaliseren van het gebruik van een lage-overvloed weefsel door het meten van meerdere resultaten op een monster in de architectuur van het oorspronkelijke weefsel.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren zijn door de UMass Medical School institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd. Menselijke islet studies waren door de UMass institutionele Review Board vastbesloten niet in aanmerking voor IRB review of vrijstelling omdat zij niet hebben betrekking op het gebruik van menselijke proefpersonen.

1. islet isolatie en cultuur

1. Isoleren van eilandjes en scheiden van contaminerende exocrine en ductaal weefsel met behulp van de methode van uw keuze.
   Opmerking: Deze methode is geoptimaliseerd met behulp van eilandjes geïsoleerd door collagenase ductaal toediening en densiteitgradiënt scheiding¹² (knaagdieren) of na verzending eilandjes van de geïntegreerde Islet distributie programma (IIDP¹³; mens). Eilandjes werden uitgekozen met een P200-micropipet.
2. Om te optimaliseren islet morfologie, toestaan eilandjes te herstellen 's nachts in 10 mL volledige islet medium (RPMI met 10% FBS, penicilline/streptomycine en glucose van 5,5 mmol/L) in een bevochtigde cupje met 5% CO₂ bij 37 ° C. Hoewel deze stap niet vereist is voor het verkrijgen van secties, de eilandjes zijn meer intact na een herstelperiode (Zie Figuur 2).

2. islet fixatie

1. Met behulp van een lage-bindende P200 tip, handpick ongeveer 250 islet equivalenten (IEQ)¹³ met behulp van een gekalibreerde raster onder een stereomicroscoop in een 1,5 mL lage bindende microfuge buis. Low-bindende tips en buizen verminderen islet verlies.
2. Het toestaan van eilandjes om af te wikkelen naar de onderkant van de microfuge buis. Verwijder de meeste bovendrijvende vloeistof met een P200 Pipetteer tip, zorg niet te verwijderen elke eilandjes.
3. Voeg 1 mL PBS. Centrifugeer buis in een swingende emmer centrifuge, totdat de snelheid 200 x g bereikt en dan stoppen de spin. Verwijder het supernatant. Herhaal PBS wassen, voor een totaal van twee wasbeurten.
4. Voeg 500 µL van 10% formaline-oplossing of 4% vers gemaakte paraformaldehyde. Voor 30 minuten bij kamertemperatuur vast. Voor de resultaten in deze methode getest, waren deze fixatie methoden niet te onderscheiden. Kortere fixatie kan ook mogelijk zijn; het is aanbevolen om het optimaliseren van fixatie duur voor het gewenste resultaat.
5. Verwijder de fixeer met een P200-tip.
6. Voeg 1 mL PBS. Centrifugeer buis, totdat de snelheid 200 x g bereikt en dan stoppen de spin. Verwijder het supernatant. Herhaal PBS wassen, voor een totaal van twee wasbeurten.
7. Ga direct naar de volgende stap.

3. bereiding van Islet Disc (Figuur 1)

1. Bij het eerste gebruik, de gel (bijvoorbeeld Histogel) bij 70 ° C smelten en maak aliquots in 1,5 mL microfuge buizen voor lange termijn opslag. Volume van de hoeveelheid is niet kritisch, aangezien aliquots hergebruikt worden kunnen.
2. De gel (ongeveer 100 µL per monster) bij 70 ° C warm door het plaatsen van microfuge buis met de gel aliquot in een blok van de warmte ingesteld op 70 ° C.
3. Pipetteer agarose blauwe kralen (10 µL voor elk monster) in een 1,5 mL schoon microfuge buis. Resuspendeer de kralen grondig voordat pipetteren.
   Opmerking: Blauwe kralen worden vermengd met de eilandjes om te helpen bij de visuele identificatie van het ingesloten materiaal in de agarose knop en het blok van paraffine. Het aantal blauwe kralen gebruikt is niet essentieel voor het resultaat, maar het vermijden van buitensporige kralen (> 5 x het aantal eilandjes) om de optimale verdeling van kleine eilandjes in secties.
4. De blauwe kralen met 1mL PBS, twee keer wassen. Voor elke wassen, draai de parels 1 min op 800 x g. Na de tweede wash, resuspendeer de kralen in (n+ 2) x 10 µL PBS, waarbij n staat voor het aantal monster buizen; bijvoorbeeld, voor 2 monster buizen zou het PBS-volume toe te voegen aan de kralen 40 µL.
5. Centrifugeer de microfuge buis met eilandjes (korte spin tot 200 x g) en allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Het puntje van een 10 µL micropipet tip afgesneden met schaar of een mes en voeg 10 µL van parels aan elke islet buis, met behulp van een schone tip voor elk monster. Meng geen (om te voorkomen dat verliezen eilandjes).
6. Centrifugeer eilandjes en kralen (korte spin tot 200 x g). Verwijder zo veel PBS mogelijk met een Onbesneden 10 µL micropipet tip.
7. Label de Microscoop dia's voor de identificatie van het monster. Twee tot drie monsters kunnen worden voorbereid op elke dia. Plaats de dia op de Bank in de buurt van het blok van de warmte met de verwarmde gel. Snijd de toppen van drie tot vijf 20 µL lage bindende micropipet tips per monster met een scheermesje of schaar. Laden van twee P20 micropipetten met gesneden tips om snel over te schakelen van de ene naar de andere.
8. 15-20 µL van warme gel met behulp van de eerste micropipet, toevoegen aan de eilandjes/kralen microfuge buis; onmiddellijk meng, vermijden van bubbels; en het vloeibare mengsel van de agar/eilandjes/kralen toepassen op de dia te vormen een < 1 cm diameter schijf. Plaats de disc in de buurt van de rand van de dia, verlaten ruimte voor de buitenste gel-ring (volgende stap). Tik zachtjes een paar keer op de dia te vestigen de eilandjes en kralen.
9. Met behulp van een tweede micropipet, 20 µL van warme gel aan het monsterbuisje toevoegen. Met behulp van de eerste micropipet, de nieuwe gel mix met eventuele resterende eilandjes/kralen, opnieuw opwarming van de aarde in de warmte blok als het begint te stollen, mag dit mengsel vervolgens toepassen op de dia, rondom de oorspronkelijke schijf. Herhaal indien nodig, met behulp van extra voorgesneden tips, totdat de schijf de gewenste grootte en dikte is.
   Opmerking: De gegeleerde cd Handling is gemakkelijker als de buiten ring iets dikker is. 3 x 20 µL van gel is meestal voldoende. Deze stap verlies van eilandjes minimaliseert door buis wast en islet-armen agarose voegt aan de buitenkant van de schijf schijf verwerking vlotter verloopt.
10. Bereiden van elke schijf afzonderlijk en zorgvuldig bijhouden van monster bestelling als meerdere schijven op elke dia plaatst.
11. Plaats de dia's op een vlakke ondergrond van nat ijs, met een deksel, gedurende 10 minuten of totdat de gel stolt. Het is moeilijker te glijden van de schijf uit het glas als het droogt uit.
12. Label biopsie verwerking/sluiten weefsel cassettes met potlood, één per monster. Droog de achterkant van de dia te vermijden bevochtiging van het Blauwboek.
13. Met de botte rand van een scheermesje, duw voorzichtig de schijf in elke richting om uit het glas. Wanneer het glijdt gemakkelijk, langzaam de schijf uit het microscoopglaasje op het Blauwe tissue papier te duwen. Plaats de schijf, de platte kant naar beneden, rechtstreeks op het papier.
14. Het bijhouden van de schijf plat, vouw het papier rond de schijf om verkeer te voorkomen, plaats de schijf in gevouwen papier in de cassette en sluiten van de cassette. Als de schijf niet netjes het glas glijden doet, toevoegen meer gel en/of retourneren van de dia aan ijs voor een paar minuten.
15. Het onderdompelen van de cassette in PBS in een bekerglas. Proces voor paraffine insluiten van dezelfde dag voor optimale morfologie.

4. paraffine insluiten

Opmerking: Proces de gel-islet schijven naar paraffineblokken met behulp van een verkorte uitdroging serie zoals hieronder beschreven. Deze techniek werd geoptimaliseerd met behulp van een geautomatiseerde processor, maar handmatige verwerking moet vergelijkbare resultaten geven.

1. Cassettes in 85% ethanol onderdompelen gedurende 15 minuten.
2. Cassettes in 95% ethanol onderdompelen gedurende 15 minuten.
3. Cassettes in 100% ethanol onderdompelen gedurende 15 minuten. Herhaal tweemaal voor een totaal van drie wast.
4. Cassettes in xyleen onderdompelen gedurende 15 minuten. Herhaal tweemaal voor een totaal van drie wast.
5. Cassettes in gesmolten paraffine onderdompelen gedurende 10 minuten.
6. Cassettes: Transfer naar verse gesmolten paraffine voor 10-30 minuten.
7. Voorzichtig open de cassette en uitpakken van het Blauwboek. Verwijder de schijf gel, het bijhouden van het platte oppervlak dat was tegen het papier. De schijf in een kleine schimmel, insluiten met het platte (islet-bevattende) oppervlak neer, parallel aan het snijvlak. Voor de plug, zorgvuldig verwijderen uit de cassette en insluiten in een kleine schimmel met de tip die wijst naar het snijvlak.

5. de paraffine segmenteren en kleuring

1. Label dia's opeenvolgend als seriële secties vereist zijn.
2. Heb 5 µm paraffine secties gesneden door een ervaren histotechnologist. Het maximaliseren van rendement, slaat u alle secties die materiaal bevatten. In het algemeen, het verzamelen van de 20 secties kunt vangen van het merendeel van het materiaal.
3. Secties bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Secties zijn vatbaar voor routinematige histologische vlekken (bijvoorbeeld H & E) en immunofluorescentie (bijvoorbeeld insuline, glucagon en DAPI). Fixatie voor andere antigenen, optimaliseren indien nodig.

Resultaten

Een geïllustreerde schematische voorstelling van de stappen ter voorbereiding van de gel-schijf wordt weergegeven in Figuur 1. Deze gel disc methode resulteert in paraffine secties met een voldoende aantal eilandjes verspreid in een enkel vliegtuig dat zinvolle kwantificering van resultaten. Figuur 2 toont beelden van de lage-vergroting van de resulterende secties om te illustreren het aantal eilandjes gevangen per sectie. In het...

Discussie

Deze gewijzigde gel schijf-gebaseerde insluiten methode biedt een eenvoudige, goedkope en efficiënte manier voor het genereren van een hoog rendement van eilandjes per sectie. Bouw van de gel-schijf op een plat glazen oppervlak vergemakkelijkt verspreiden eilandjes in een gelijkmatige verdeling over een welomschreven gebied. Verspreiding van de eilandjes in een platte schijf biedt het voordeel van het plaatsen van de vele eilandjes in het langsvlak van deel, optimaliseren van rendement en waardoor minder eilandjes worden...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin Classic Pipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001