Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de nasale potentiaalverschil in muizen. De test kwantificeert de functie van transmembraan ion vervoerders zoals de cystic fibrosis transmembrane huidgeleiding regelgever en de epitheliale natrium-kanaal. Het is waardevol om te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor cystic fibrosis.

Abstract

De nasale potentiële verschil test is gebruikt voor bijna drie decennia om te helpen bij de diagnose van cystic fibrosis (CF). Het heeft bewezen nuttig zijn in gevallen van verzwakt, oligo - of mono-symptomatische vormen van CF meestal gediagnosticeerd later in het leven, en van CF-gerelateerde aandoeningen zoals congenitale bilaterale afwezigheid van zaadleiders, idiopathische chronische pancreatitis, allergische broncho aspergillose en bronchiëctasieën. In zowel klinische en preklinische instellingen, is de test gebruikt als een biomarker te kwantificeren reacties op gerichte therapeutische strategieën voor CF. aanpassing de test een muis uitdagend is en leiden een geassocieerde mortaliteit tot kan. Deze paper beschrijft de voldoende diepte van verdoving nodig om te handhaven een nasale katheter in situ voor continue perfusie. Het somt de maatregelen ter voorkoming van broncho-aspiratie van oplossingen geperfundeerd in de neus. Hierin wordt ook de verzorging van de dieren aan het einde van de test, met vermelding van de administratie van een combinatie van antidota van de verdoving drugs, leidt tot snel het omkeren van de narcose met volledig herstel van de dieren. Representatieve gegevens verkregen uit een CF en een wild-type muis tonen aan dat de test tussen CF en niet-CF discrimineert. Over het geheel genomen kunnen het protocol hier beschreven betrouwbare metingen van de functionele status van trans-epitheliale chloride en natrium vervoerders in spontaan ademhaling muizen, evenals meerdere tests in hetzelfde dier terwijl het verminderen van test-gerelateerde sterfte.

Introduction

Voor bijna drie decennia, zijn elektrische potentiële verschil (PD) metingen gebruikt voor de evaluatie van de functionele status van transmembraan ion vervoerders uitgedrukt op de nasale mucosa, als vertegenwoordiger van de distale airways¹. Zoals een meerstaps dynamische test^2,3, nasaal PD functionele dissectie van Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) en epitheliale natrium kanaal (ENaC) activiteit maakt, gelokaliseerde zowel in de apicale membraan van epitheliale cellen en belangrijke rol in de luchtweg oppervlakte hydratatie uit te oefenen. De belangrijke kli....

Protocol

De studies en de procedures werden goedgekeurd door het ethisch comité voor dierlijke onderzoek van de UCL (2017/UCL/MD/015) en in overeenstemming met de verordeningen van de Europese Gemeenschap voor dierlijk gebruik in onderzoek (CEE n ° 86/609/EEG). De onderzoekers zijn gekwalificeerd voor de dierproeven na de richtlijn 2010/63/EU van het EuropeesParlement en de Raad van 22 September 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt.

1. vooraf testen overstromingsbeoordeling en -beheer

1. De dubbele lumen nasale katheter voor te bereiden.
   Opmerking: Een nasale katheter is gemaakt a....

Results

Om te illustreren de karakteristieke ion vervoer abnormaliteiten in CF, werden nasale PD-metingen uitgevoerd volgens de hierboven beschreven in een F508del-CF-muis en een wild-type controle van de genetische achtergrond van FVB/129 van de Brussel kolonie protocol CFTR^tm1Eur muizen³⁰. Dit klinisch relevante model, herbergen van de meest voorkomende en één van de ernstigste F508del-CFTR mutatie^23,24

Discussion

Het doel van deze paper is te beschrijven een voldoende protocol voor het meten van de nasale PD onder continue perfusie van oplossingen in spontaan ademhaling muizen voor een lengte van de tijd die nodig is voor het testen van de integriteit van ion vervoerders, voornamelijk CFTR en ENaC. Alle stappen van het protocol zijn zorgvuldig geoptimaliseerd om ervoor te zorgen volledige dierlijke herstel en goede kwaliteit en reproduceerbare gegevens. In bepaalde, kritische stappen zijn verdoving beoordeling en beheer, en voldo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Portex polyethylene tube	Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL	Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD	to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream	Parker, Fairfield, NJ, USA	Redux cream	to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes	Biomedical, Clinton Township, MI, USA	JNS BNT131-1,0	measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride	Sigma, St Louis, MI, USA	A7410	to prepare perfusion solutions
forskolin	Sigma, St Louis, MI, USA	F6886	to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Portavo 904 pH	to measure potential difference
Paraly SW 112 Software	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Paraly SW112 software	to capture potential difference data
midazolam	Mylan, Hoeilaart, Belgium	Dormicum 15mg/3ml	to serve as anaesthetic premedication
fentanyl	Janssen Cilag, Berchem, Belgium	Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml	to serve as anaesthetic medication
medetomidine	Orion Pharma, Espoo, Finland	Domitor 1 mg/ml	to serve as anaesthetic medication
droperidol	Janssen  Cilag, Berchem, Belgium	Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml	to serve as anaesthetic medication
clonidine	Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany	Catapressan 0.15 mg/ml,	to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter	Becton Dickinson, Sandy, UT, USA	24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W	to build electrode bridges
forceps	Fine science Tools, Heidelberg, Germany	Dumont #5, Fine science Tools	to place the nasal catheter
naloxone	Braun Medical, Brussels, Belgium	Narcan, 0.4 mg/ml	to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole	Zoetis, Bloomberg, Belgium	Antisedan, 5 mg/ml	to serve as a medetomedine specific antidote
Heating pads	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm	to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1	GE Life Sciences, Uppsala, Sweden	18111091	to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue	Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany	super glue 3	to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0926S-A7	Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	M7304	Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	1551128	Pharma-Grade, USP
K2HPO4	Sigma, St Louis, MI, USA	1551139	Pharma-Grade, USP
Na gluconate	Sigma, St Louis, MI, USA	S2054	Pharma-Grade, USP
Ca gluconate	Sigma, St Louis, MI, USA	C8231	Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0089M-A7	Pharma-Grade, USP
BD needle	Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	BD 26G (0.45x10 mm)	intraperitoneal injection