Experimentele Protocol voor de behandeling van de gedragsmatige reactie profielen in larvale vissen: toepassing op de Neuro-stimulerende cafeïne

Summary

Hier presenteren we een protocol te onderzoeken larvale zebravis en fathead minnow motorische activiteiten en photomotor Reacties (PMR) met behulp van een geautomatiseerd tracking-software. Wanneer opgenomen in algemene toxicologie bioassays, geven analyses van deze gedragingen een diagnostisch instrument om te onderzoeken van chemische topicale. Dit protocol wordt beschreven met behulp van cafeïne, een neurostimulant model.

Abstract

Vis modellen en gedrag worden steeds vaker gebruikt in de Biomedische Wetenschappen; echter, vis al lang het onderwerp van ecologische, fysiologische en toxicologische studies. Met behulp van geautomatiseerde digitale tracking platformen, recente inspanningen in neurofarmacologie leveraging larvale vissen locomotor gedrag om te identificeren van potentiële therapeutische doelen voor nieuwe kleine moleculen. Gelijkaardig aan deze inspanningen, onderzoek in de milieuwetenschappen en vergelijkende farmacologie en toxicologie bestudeert verschillende gedragingen van vis modellen als diagnostische hulpprogramma's van trapsgewijze beoordeling van verontreinigingen en real-time bewaking van de oppervlaktewateren voor verontreinigingen bedreigingen. Overwegende dat de zebravis een model van de populaire larvale vissen in de Biomedische Wetenschappen is, is de fathead minnow een gemeenschappelijk model van het larvale vissen in ecotoxicologie. Helaas, fathead minnow larven hebben aanzienlijk minder aandacht gekregen in behavioral studies. Hier, we ontwikkelen en demonstreren van een gedrags profiel-protocol met behulp van cafeïne als een model neurostimulant. Hoewel photomotor reacties van fathead minnows werden soms beïnvloed door cafeïne, zebravis waren duidelijk gevoeliger is voor photomotor en motorische eindpunten, die op milieu relevante niveaus reageerde. Toekomstige studies zijn nodig om vergelijkende gedrags gevoeligheid verschillen tussen vis met leeftijd en de tijd van dag te begrijpen, en om te bepalen of soortgelijke gedragsmatige gevolgen zou in de natuur treden en indicatief zijn voor nadelige resultaten op individueel of populatie van biologische organisatie.

Introduction

Hoewel vis modellen steeds vaker voor biomedische studies gebruikt worden, zijn vis routinematig tewerkgesteld voor ecologie en fysiologie studies, onderzoeken van de verontreiniging van oppervlaktewateren, en begrijpen van toxicologische drempels van chemische stoffen. Dergelijke inspanningen zijn belangrijk, omdat chemische verontreiniging kan aantasten van aquatische ecosystemen en de kwaliteit van de bron watervoorziening^1,2in gevaar brengen. Allermeest naar de chemische stoffen in de handel, maar ontbreken zelfs elementaire toxicologie informatie³.

Diermodel assays traditioneel gebruikt bij regelgevende toxiciteitstests zijn arbeidsintensief en beschikken niet over de hoge doorvoer, vroege tier screening die nodig zijn voor de toxiciteit in de 21ste eeuw⁴. Vervolgens is er een groeiende impuls aan te nemen en gebruik maken van de in vitro modellen die sneller en efficiënter compounds voor biologische activiteit^{3,5 beschermen kunnen}. Hoewel cellen gebaseerde modellen veel mogelijkheden presenteren, ze vaak niet biologische complexiteit, en dus geen rekening met voor vele belangrijke hele organisme processen, met inbegrip van metabolisme⁶.

De zebravis is een gemeenschappelijk biomedische diermodel die wint aan populariteit als een alternatief model in aquatische toxicologie en de ecotoxicologie^7,8. Gezien hun geringe omvang, snelle ontwikkeling en hoge vruchtbaarheid, kunnen vis modellen worden gebruikt om snel en efficiënt scherm chemicaliën voor topicale en toxiciteit op het hele organisme schaal⁹. Met de hulp van geautomatiseerde opsporingssoftware bieden larvale zebrafish gedrag verbeterde diagnostische hulpprogramma bij bevolkingsonderzoek contaminanten voor toxiciteit^10,11. Studies in de farmaceutische wetenschappen hebben aangetoond dat locomotor eindpunten informatief van chemische mechanismen van actie zijn, kunnen worden gebruikt om fenotype gedrag, en vervolgens voorlopig subcellular doelstellingen voor nieuwe moleculen^{12vaststellen, 13}. Overwegende dat de zebravis een model van de populaire larvale vissen in de Biomedische Wetenschappen is, de fathead minnow is een gemeenschappelijk, ecologisch belangrijk vis-model dat wordt gebruikt voor Ecotoxicologie studies en tijdens toekomstige (bijvoorbeeld nieuwe chemische evaluaties) en milieubeoordelingen retrospectief (bijvoorbeeld ambient oppervlaktewater of afvalwater afvalwater kwijting toezicht). Helaas hebben gedrags reacties van larvale fathead minnows aanmerkelijk minder aandacht dan zebrafish gekregen. Onze lopende onderzoek met twee gemeenschappelijke larvale vissen modellen, de zebravis en fathead minnow, suggereert dat larvale vissen zwemmen patronen verschijnen uniek zijn voor de verwachte modi of mechanismen van actie voor diverse chemische stoffen. Dus, gedrags eindpunten verschaffen over de mogelijke te snel en zorgvuldig bestuderen chemicaliën voor toxiciteit en te identificeren subcellular doelstellingen voor industriële chemische en andere verontreinigingen, met name tijdens de vroege fase evaluaties.

Wij rapporteren hier, een protocol voor de behandeling van de gedragsmatige reactie profielen in larvale vissen. Wij tonen deze methoden gebruik van cafeïne, een model neurostimulant en een gemeenschappelijk aquatische verontreinigingen die is ingevoerd om aquatische systemen door lozing van afvalwater behandelingen planten na consumptie van voedingsmiddelen, dranken, en farmaceutische uitgewerkt met de cafeïne¹⁴. We onderzoeken gedrags reacties op cafeïne in beide larvale zebravis en fathead minnow, met inbegrip van een plotselinge verandering in de verlichting voorwaarde, die is vaak aangeduid als een photomotor reactie (PMR) tijdens het farmaceutische onderzoek met embryonale en larvale zebravis^13,15. Wij nader effecten van cafeïne over verschillende motorische eindpunten te ontwikkelen van chemische reactie profielen voor elke vis-model te identificeren. Cafeïne behandeling niveaus in deze studie gebruikt vertegenwoordigen de bovenste centiles van blootstelling distributies gebaseerd op milieu meetwaarden van cafeïne¹⁶. Wij omvatten ook behandelingen gebenchmarked larvale vissen LC₅₀ waarden en het gevaar voor de therapeutische waarde (THV), een farmaceutische concentratie in water dat naar verwachting resulteren in plasma concentraties in de vis consistent met een menselijk plasma van de therapeutische dosis.

Protocol

Studies in dit protocol in het algemeen volgen gestandaardiseerde proefopzet en statistische analyse richtsnoeren aanbevolen het ons Environmental Protection Agency (EPA no. 2000.0) voor fathead minnows en de organisatie voor economische samenwerking en Ontwikkeling (OESO nr. 236) voor zebrafish. Deze experimentele designs (bijvoorbeeldverhoging van replicatie) kunnen worden gewijzigd binnen het huidige protocol voor toekomstige studies. Vis cultuur voorwaarden eerder volgen gepubliceerde literatuur¹⁷. Alle experimentele procedures en vis protocollen van de cultuur volgde institutionele Animal Care en gebruik Comité protocollen goedgekeurd op Baylor University.

1. het blootstellen van vis tot chemische behandeling

1. Bereiden cafeïne blootstelling oplossingen door het oplossen van cafeïne in synthetisch hard water. Juiste seriële verdunningen door verder verdunnen van hogere cafeïne behandelingen met hard water voor de productie van lagere niveaus van cafeïne behandeling uitvoeren
   Opmerking: Tabel 1 geeft een overzicht van elk van de niveaus van de behandeling in dit experiment gebruikt.

	Zebravis			Fathead Minnow
Behandeling	Nominale cafeïne concentratie (mg/L)	Gemeten cafeïne concentratie (mg/L)	Behandeling	Nominale cafeïne concentratie (mg/L)	Gemeten cafeïne concentratie (mg/L)
Controle	0	< LOD	Controle	0	< LOD
75e Centile *	0,001	0,001	75e Centile *	0,001	0,001
95e Centile *	0.039	0.013	95e Centile *	0.039	0.009
99e Centile *	0.412	0.361	99e Centile *	0.412	0.310
THV	4,07	3,81	THV	4,07	4.12
10% LC50	48.46	46.66	10% LC50	14.1	14,7
40% LC50	193.82	186.67	40% LC50	56.38	53.91

Tabel 1: Experimental cafeïne behandelingen voor zebravis en fathead minnow experimenten. Nominale en gemeten waarden van cafeïne voor elke behandeling worden gegeven. * De behandelingen van de cafeïne in deze studie gebruikt vertegenwoordigen de bovenste centiles van blootstelling distributies gebaseerd op milieu meetwaarden van cafeïne¹⁶. THV: Gevaar voor de therapeutische waarde. LOD: Aantoonbaarheidsgrens limiet

2. Giet de bereide oplossing in individuele blootstelling champers. Gebruik 100 mL glazen bekers gevuld met 20 mL oplossing van de blootstelling van zebravis blootstelling chambers en bekerglazen van 500 mL met 200 mL van blootstelling oplossing voor fathead minnow blootstelling kamers.
3. Plaats met een overdracht Pipetteer 10 zebrafish embryo's leeftijd 4-6 h post bevruchting (hpf) in elk van de vier repliceren blootstelling kamers per behandeling.
4. Plaats 10 fathead minnow larven leeftijd binnen de 24 uur van het uitbroeden, in elk van de drie repliceren blootstelling kamers per behandeling. Aangepast aan de grotere omvang van fathead minnow larven, afgesneden het uiteinde van de pipet overdracht vóór overdracht.
5. Zebravis experimenten te handhaven op een 16:8 h licht: donker fotoperiode en een constante temperatuur van 28 ± 1 ° C. Gebruik dezelfde fotoperiode regeling voor fathead minnow studies, maar bij een temperatuur van 25 ± 1 ° C.
6. Na 96 h van blootstelling aan chemische stoffen platen de afzonderlijke vissen belasting in aparte putjes van 48 (voor zebravis) en 24 (voor fathead minnow) goed.
   1. Om ervoor te zorgen dat elk goed een gelijk volume oplossing bevat, kunt u het zebrafish larven overbrengen door 48 goed platen met behulp van een autopipette 5.000 µL voor een volume van 1.000 µL per putje. Gebruik de autopipette in te trekken en de overdracht van zowel de zebravis larven en de blootstelling oplossing gelijktijdig.
   2. Als gevolg van hun grotere omvang, transfer fathead minnow larven met behulp van een pipet overdracht met het topje afgesneden. Voordat u overdraagt fathead minnow larven aan individuele putjes, vullen elkaar goed aan 2.000 µL met behulp van een autopipette. Bij het overbrengen van individuele fathead larven aan putjes, plaats van het uiteinde van de Pipet van de overdracht in de goed oplossing en laat de vis om te zwemmen vanaf de punt van de pipet in de put.

2. kalibratie van de Parameters van de Video-tracking

1. Voordat gedrags maatregelen, observatie en calibratie parameters instellen in de videotrack software (zie tabel van materialen).
   1. Plaats een goed plaat in de zaal van de opname met ten minste 1 larvale vissen in een individuele goed. Gebruik de plaat en de bijbehorende vis als representaties Calibratieparameters in te stellen.
   2. In de videotrack software, klik op "bestand | Het genereren van Protocol", die een"wizard protocol maken"-dialoogvenster wordt geopend. In het veld "locatie Count" Geef het aantal individuen putjes van de plaat goed en klik op "OK".
   3. De bovenkant van het scherm, klik op "View | Full Screen", die vraagt het systeem om een overhead cameraweergave van de plaat goed weer te geven.
   4. Klik op het pictogram van de "Tekenen gebieden", die wordt weergegeven als drie veelkleurige vormen. Aan de rechterkant van de goed plaat weergavegebied, selecteert u het pictogram van de cirkel in het veld "Gebieden".
   5. Gebruik de cursor om af te bakenen de circulaire video gebied in de linksboven putje van de plaat goed bijhouden. Selecteer "Rechts boven Mark" en vervolgens een overzicht van het weergavegebied van de bovenkant recht goed. Selecteer vervolgens "Onder Mark" te schetsen van de onderkant rechts goed.
      Opmerking: Na het trekken van de circulaire omtrek, haar standpunt zal waarschijnlijk moeten worden aangepast.  Pas de positie van het overzicht, klikt u op "selecteren" en vervolgens de cursor gebruiken om de aangegeven gebied te verplaatsen. Ook, kunnen overzichten worden gerepliceerd door te klikken op "kopiëren" en dan "Plakken".
   6. Nadat de bovenkant links, rechts, boven en onderkant rechts goed bijhouden gebieden zijn gedefinieerd, klikt u op "Bouwen" om te vragen van de software af te bakenen automatisch de gebieden van de weergave van de resterende putten.
   7. In het gebied met de label "Kalibratie", klikt u op "Tekenen schaal". Gebruik de cursor om een horizontale lijn aanzuigen en over de plaat. Zodra de lijn is getekend, zal een dialoog met het label "Kalibratie measurement" verschijnen. Geef aan hoe lang goed plaat en klik op "OK".
   8. De tekening manager afsluit door te klikken op het pictogram "Tekenen gebieden".
   9. Klik op de "Tegels" pictogram.  Met behulp van de cursor, Markeer alle dozen die worden weergegeven op het scherm bekijken, zodat elk vak groen is.
      Opmerking: De tegels-pictogram wordt weergegeven als een groep van zes afzonderlijke kleine vierkantjes
   10. "Klik op View | Full Screen".  Aan de rechterkant van de plaat weergavegebied, klikt u op "Bkg" in het vak met het label "Detectie drempel". Gebruik de balk voor aanpassing van de drempel om te stellen van de pixel detectie drempel. Eens, de juiste pixel detectie drempel is geselecteerd, klikt u op "Toepassen aan de groep".
       Opmerking: Dit protocol stelt de detectie drempel bij 13 in zwarte modus voor zebrafish waarnemingen en 110 in transparante modus voor fathead minnow waarnemingen.
   11. Voer in het vak met het label "Drempel blijft", de snelheid van de gewenste beweging bijhouden van parameters. Zodra de snelheid parameters zijn ingesteld, klikt u op "Toepassen aan de groep".
       Opmerking: Dit protocol stelt kleine/grote verplaatsingen naar 20 mm/s en inactief/kleine bewegingen op 5 mm/s. Deze selecties program de software voor het bijhouden van larvale vissen beweging op drie verschillende snelheidsniveaus: inactief (bevriezing) = < 5 mm/s, klein (varen) = 5 – 20 mm/s, en grote (barsten) = > 20 mm/s.
   12. Klik op "Parameters | Protocol Parameters"uit het drop-down menu. Selecteer in het dialoogvenster, de "Tijd" tab. Enter de observatietijdstip en de tijd van de integratie. Klik op "Ok" nadat parameters zijn ingevoerd.
   13. Om in te stellen drop de tijden van de licht/donker fotoperiode en lichtintensiteit voor elke fotoperiode open die de lichte stuurprogramma-instellingen voor dialoog vak door het selecteren van "Licht Driving" uit de "Parameters"-down menu.
       Opmerking: Zie protocol video voor het instellen van meerdere licht-donker photoperiods.
   14. Nadat de video voor het bijhouden van parameters zijn ingesteld, opslaan het observatie-protocol.
       Opmerking: Dit protocol merkt vis gedrag gedurende 50 min waarin een 10 min acclimatisering fase gevolgd door 4 licht/donker fasen bestaande uit twee 10 min lichte perioden en twee 10 min donkere periodes wijzigen. De integratie-tijd is ingesteld voor het meten van gedrag voor elke minuut van de gedragsmatige proef van 50 min.

3. waarneming van larvale vissen motorische en Photomotor gedrag

1. Plaats de goed plaat met experimentele vis in de zaal gedrags opname.
2. In de video voor het bijhouden van software, open het tracking-protocol ontwikkeld in stap 3.
3. Controleer in het bijhouden van de video-viewer, om ervoor te zorgen dat alle larven zichtbaar op het computerscherm zijn, dat slechts één individuele larve is aanwezig in elk putje, en dat de individuele putten worden uitgelijnd in de observatie-gebieden die zijn gedefinieerd in stappen 2.1.5 en 2.1.6.
4. Klik op "Experiment | Uitvoeren".
   Opmerking: Het systeem zal de gebruiker een naam en locatie voor het opslaan van de gegevens van de waarneming te geven.
5. Eenmaal de naam en de opslaglocatie van de observatie gegevens zijn opgegeven, klik op het pictogram "Verschillende Live beelden" alle gebieden van de vooraf gedefinieerde weergave markeren
   Opmerking: Dit pictogram bevindt zich aan de bovenkant van het computerscherm en wordt weergegeven als een vak verdeeld in vier kleinere vierkantjes. Alle gebieden van de vooraf gedefinieerde weergave zal worden belicht door op dit pictogram te klikken.
6. Sluit het venster van de zaal van de opname en klik op "achtergrond | Start"op de computermonitor.

4. het analyseren van gedrags-gegevens

1. Larvale vissen activiteit om gegevens te halen, opent u het werkblad, die automatisch door de opsporingssoftware is samengesteld en is in de map die is opgegeven door de gebruiker voordat gedrags proeven (stap 3.4).
2. Verwijzen naar de cijfers 1A en 1B voor representatieve metingen van de motorische activiteit naïef van onbelicht zebravis en fathead minnow larven, respectievelijk. Verwijzen naar de cijfers 1 c en 1 D voor PMR berekeningen, die effectief de omvang van het verkeer verschil tussen overgangen van licht naar donker of donker tot licht onderzoekt.

Figuur 1: Voorbeeld van de basislijn activiteit van onbelicht zebrafish (A en B) en fathead minnow (C en D). De gemiddelde (± SEM) afstand zwom voor zebrafish (A) en fathead minnow (C) wordt gegeven door stippen elke vertegenwoordigen één minuut intervallen van activiteit. Twee donker en twee lichte perioden van photomotor reacties worden gemeten. De laatste (a, c, e en g) en eerste (b, d, f en h) minuut van elke fotoperiode worden gebruikt voor het berekenen van PMRs. Photomotor reacties van de zebravis (B) en fathead minnow (D) worden gemeten als de verandering in gemiddelde (±SEM) afgelegde tussen de laatste minuut van een eerste fotoperiode en de eerste minuut van de volgende periode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Results

Cafeïne behandeling niveaus deed niet merkbaar variëren tijdens de 96 h experimenten met zebravis en fathead minnows. Tabel 1 geeft bijvoorbeeld analytisch geverifieerde concentraties van elk niveau van de behandeling. Dit protocol geverifieerd watermonsters voor cafeïne behandeling niveaus door isotoop-verdunning vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) in het algemeen na eerder gemelde methoden²⁸. De vorming van paraxanthine, de primaire metaboliet van cafeïne, was ook gekwantificeerd. Een beschrijving van deze analytische procedures vindt u in de aanvullende analytische informatie. Vanwege de overeenkomsten tussen nominale en analytische controle van behandelingen, worden nominale behandeling niveaus gepresenteerd op de rest van dit manuscript. Cafeïne ingrijpend veranderd zebravis en fathead minnow gedrag. Zebravis motorische reacties waren echter consequent meer gevoelig zijn voor cafeïne dan fathead minnows. De meest gevoelige gedrags eindpunten voor zebravis en fathead minnow larven werden beïnvloed door cafeïne bij een concentratie van 0.039 mg/L. tabel 2 geeft een overzicht van laagste waargenomen effecten concentraties (LOECs) en geen waarneembaar effect concentraties (NOEC's) voor elk gedrags eindpunt in beide modellen van vis.

Zebravis			Fathead minnow
Eindpunt	LOEC (mg/L)	NOEC (mg/L)	Eindpunt	LOEC (mg/L)	NOEC (mg/L)
Totale afstand donker	0.412	0.039	Totale afstand donker	−	56.38
Totale afstand licht	48.46	4,07	Totale afstand licht	−	56.38
In totaal telt donker	0.412	0.039	In totaal telt donker	−	56.38
In totaal telt licht	48.46	4,07	In totaal telt licht	−	56.38
Barsten van afstand donker	−	193.82	Barsten van afstand donker	−	56.38
Barsten van afstand licht	193.82	48.46	Barsten van afstand licht	−	56.38
Barsten telt donker	193.82	48.46	Barsten telt donker	−	56.38
Barsten van tellingen licht	193.82	48.46	Barsten van tellingen licht	−	56.38
Barsten duur donker	193.82	48.46	Barsten duur donker	−	56.38
Barsten duur licht	−	193.82	Barsten duur licht	−	56.38
Cruising afstand donker	0.412	0.039	Cruising afstand donker	−	56.38
Cruising afstand licht	48.46	4,07	Cruising afstand licht	−	56.38
Dark telt Cruising	0.412	0.039	Dark telt Cruising	−	56.38
Cruising graven licht	48.46	4,07	Cruising graven licht	−	56.38
Cruising duur donker	0.412	0.039	Cruising duur donker	−	56.38
Cruising duur licht	48.46	4,07	Cruising duur licht	−	56.38
Bevriezing afstand donker	0.412	0.039	Bevriezing afstand donker	0.039	0,001
Afstand lichte bevriezing	0.039	0,001	Afstand lichte bevriezing	−	56.38
Bevriezing telt donker	0.412	0.039	Bevriezing telt donker	−	56.38
Bevriezing telt licht	48.46	4,07	Bevriezing telt licht	−	56.38
Bevriezing duur donker	−	193.82	Bevriezing duur donker	56.38	14.10
Duur lichte bevriezing	48.46	4,07	Duur lichte bevriezing	−	56.38
Donkere 1 PMR	48.46	4,07	Donkere 1 PMR	0.039	0,001
Licht 1 PMR	48.46	4,07	Licht 1 PMR	−	56.38
Donkere 2 PMR	48.46	4,07	Donkere 2 PMR	−	56.38
Licht 2 PMR	48.46	4,07	Licht 2 PMR	−	56.38
Barsten van donkere 1 PMR	−	193.82	Barsten van donkere 1 PMR	−	56.38
Barsten van licht 1 PMR	−	193.82	Barsten van licht 1 PMR	−	56.38
Barsten van donkere 2 PMR	193.82	48.46	Barsten van donkere 2 PMR	−	56.38
Barsten van licht 2 PMR	−	193.82	Barsten van licht 2 PMR	−	56.38
Cruising donker 1 PMR	48.46	4,07	Cruising donker 1 PMR	−	56.38
Cruisen licht 1 PMR	48.46	4,07	Cruisen licht 1 PMR	−	56.38
Cruising donker 2 PMR	48.46	4,07	Cruising donker 2 PMR	−	56.38
Cruising licht 2 PMR	193.82	48.46	Cruising licht 2 PMR	56.38	14.10
Bevriezing donker 1 PMR	48.46	4,07	Bevriezing donker 1 PMR	−	56.38
Bevriezing van licht 1 PMR	193.82	48.46	Bevriezing van licht 1 PMR	−	56.38
Bevriezing van donkere 2 PMR	48.46	4,07	Bevriezing van donkere 2 PMR	−	56.38
Bevriezing van licht 2 PMR	193.82	48.46	Bevriezing van licht 2 PMR	−	56.38

Tabel 2: zebravis en fathead minnow gedrags NOEC's en LOECs voor cafeïne. Geen waargenomen Effect concentratie (NOEC) en laagste waargenomen Effect concentratie (LOEC) (mg/L) waarden voor elk van de licht/donker zwemmen de eindpunten van de activiteit en photomotor reacties voor zebravis en fathead minnows blootgesteld aan cafeïne. Streepjes aangeven dat geen effecten werden waargenomen bij een bepaald eindpunt op alle niveaus van de behandeling.

Figuur 2 toont totale motorische activiteit en PMRs van zebravis en fathead minnow na 96 uur blootstelling aan cafeïne. Fathead minnow larven die PMRS werden veranderd door cafeïne op lagere behandeling niveaus (0.038 mg/L) dan zebrafish, maar een aanzienlijk groter aantal photomotor eindpunten werden getroffen in zebrafish. Het hoogste niveau van de behandeling van cafeïne (193.82 mg/L) gewijzigd PMR in zebrafish, waarin deze antwoorden precies tegenovergestelde waren van besturingselementen. Op dit niveau verhoogde behandeling echter PMRs daalde in donker en toegenomen in lichtomstandigheden.

Figuur 2: Zwemmen activiteit en photomotor reacties van de zebravis (A en B) en fathead minnow (C en D) na 96 uur blootstelling aan cafeïne. De gemiddelde (± SEM) afstand zwom voor zebrafish (A) en fathead minnow (C) wordt gegeven door stippen elke vertegenwoordigende 1-min-intervallen van activiteit. Photomotor reacties van de zebravis (B) en fathead minnow (D) worden gemeten als de verandering in gemiddelde (± SE) totale afgelegde tussen de last minutes van een eerste fotoperiode en de eerste minuut van de volgende periode. Twee donker en twee lichte periode photomotor reacties werden gemeten. Totaal 24 zebrafish (4 wordt gerepliceerd elke van 6 larven) en 12 (3 wordt gerepliceerd elke van 4 larven) fathead minnows werden gebruikt voor gedrags observatie. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Naast het meten van larvale PMRs, werd lichte en donkere motorische activiteit geanalyseerd in drie snelheid drempels voor afstand verplaatst, aantal bewegingen, en duur van bewegingen. Deze data worden gebruikt voor het ontwikkelen van de gedragsmatige reactie profielen voor cafeïne (Figuur 3, Supplemental Figuur 1). Zowel van de modellen van de vis beïnvloed cafeïne geremd activiteit helemaal sterk locomotor eindpunten. Beide vissen modellen aangetoonde verhoogde activiteit op de barst snelheid drempels na blootstelling aan cafeïne, maar niet significant. Vergelijkbaar met de resultaten van de PMR-opmerkingen, cafeïne verricht een groter aantal zebrafish locomotor eindpunten. In feite, cafeïne ingrijpend veranderd worden verschillende motorische reacties onder donkere omstandigheden op een ecologisch realistisch niveau beneden de THV. Fathead minnow motorische activiteit was echter niet aanzienlijk beïnvloed onder lichtomstandigheden door elk niveau van de behandeling.

Figuur 3: reactie profielen van larvale zebravis en fathead minnows na 96 uur blootstelling aan cafeïne. Bedoel zebrafish donker (A) en licht (B) zwemmen activiteit in vergelijking met fathead minnow donker (C) en licht (D) activiteit betekent na 96 uur blootstelling aan cafeïne. Vertegenwoordigt gegevens op activiteit over twee 10 min donker photoperiods en twee 10 min lichte photoperiods voor elk model vis uitgezet. Gegevens is genormaliseerd naar controle, die wordt vertegenwoordigd op de 0 as in elk figuur. Gedrags parameters omvatten afstand zwom, aantal bewegingen (graven), en de duur van elke beweging over 3 snelheidsniveaus, barsten (> 20 mm/s), cruising (5-20 mm/s), en bevriezing (< 5 mm/s). Naast bewegingspatronen bij elk van de drempels van snelheid, totale afstand zwom en totaal aantal bewegingen wordt vertegenwoordigd. ↑ vertegenwoordigt een significante toename in activiteit in vergelijking met controle en ↓ geeft een significante daling in activiteit in vergelijking met controle. Totaal 24 zebrafish (4 wordt gerepliceerd elke van 6 larven) en 12 (3 wordt gerepliceerd elke van 4 larven) fathead minnow wanneer gebruikt in behavioral opmerkingen voor elke groep. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: Photomotor reacties van de zebravis (A en B) en fathead minnow (C en D) over drie snelheid drempels. Zebrafish (A, B en C) en fathead minnow larven (D, E en F) photomotor reacties over drie snelheid drempels (bevriezing: 20 mm/s) na 96hr blootstelling aan cafeïne. Photomotor reacties van zebravis en fathead minnow worden gemeten als de verandering in gemiddelde (±SE) totale afgelegde tussen de last minutes van een eerste fotoperiode en de eerste minuut van de volgende periode. Twee donker en twee lichte periode photomotor reacties werden gemeten. Totaal 24 zebrafish (4 wordt gerepliceerd elke van 6 larven) en 12 (3 wordt gerepliceerd van 4 larven) fathead minnows werden gebruikt voor gedrags observatie. * p < 0,01 Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Bij het selecteren van chemische behandeling niveaus voor gedrags toxicologische studies, moeten verschillende factoren worden overwogen. Cafeïne behandeling niveaus in de huidige studie werden geselecteerd op basis van de bovenste centile waarden voor voorspelde omgevingsblootstelling scenario's uit afvalwater afvalwater¹⁶. Indien mogelijk, selecteren wij uit routine behandeling niveaus voor aquatische toxicologische studies met behulp van probabilistische blootstelling evaluaties van milieu observaties^19,20,21. Een THV, oftewel berekenbare voor geneesmiddelen, werd ook opgenomen als een niveau van de behandeling in de huidige studie. THV waarden (Eq. 1)^22,23 worden gedefinieerd als water van de voorspelde concentraties leiden tot menselijke therapeutische doses (Cmax) van geneesmiddelen in vis²³, zijn geïnspireerd door de eerste plasma inspanningen²⁴modelleren, en zijn berekend op basis van bloed: water chemische partitioneren coëfficiënten (Eq. 2)²⁵.

THV = C_max / log P_BW (Eq. 1)

log P_BW = log [(10^{0,73. log Kow} · 0.16) + 0.84] (Eq. 2)

Hier, selecteren wij ook subletale behandeling niveaus ten opzichte van de zebravis en fathead minnow LC50-waarden. Wij vinden deze aanpak een nuttige benchmarking-procedure voor gedrags reacties, met name bij het vergelijken van drempels van specifieke problemen met een vis model over meerdere chemische stoffen. Het vergemakkelijkt verdere berekeningen van acute naar chronische ratio's, die in de aquatische toxicologie voor mechanistische studies en evaluaties diagnostisch nuttig kunnen zijn. LC50-waarden werden verkregen uit voorlopige toxiciteit bioassays volgens de gestandaardiseerde richtlijnen gegeven in stap 2.1.

In dit protocol, hanteren wij gemeenschappelijk experimentele designs en statistische technieken die worden aanbevolen door de US EPA en de OESO gestandaardiseerde methoden voor toxicologische studies met vis modellen. Hoewel wij verslag p -waarden (bv., < 0,01, < 0,05, < 0.10), verschillen (α = 0.10) activiteit levels worden geïdentificeerd onder behandelingen met behulp van variantieanalyse (ANOVA) als normaliteit en gelijkwaardigheid van variantie veronderstellingen wordt voldaan. De Dunnett- of Tukey de HSD post hoc tests worden uitgevoerd om te identificeren behandeling niveau verschillen. Wij selecteren deze alpha (α = 0.10) waarde te verminderen van type II fouten, met name voor vroege fase testen en wanneer een goed begrip van biologisch belangrijke gevolgen grootte is beperkt voor understudied gedrags eindpunten en model organismen²⁶, in plaats van procedures gemeenschappelijker in de Biomedische Wetenschappen voor meerdere vergelijkingen in dienst (bv., Bonferroni correctie voor RNA-Seq gegevens)²⁷.  Toekomstige studies zijn nodig om te begrijpen van de variabiliteit van deze gedrags antwoorden en potentieel experimentele designs (b.v., verhoging van de replicatie) aanpassen.

Een aantal factoren kan invloed hebben op gedrag van larvale vissen naast blootstelling aan chemische stoffen. Bijvoorbeeld, de tijd van dag, leeftijd, goed formaat, temperatuur, lichtomstandigheden en hoeveelheid blootstelling oplossing in elk goed vertegenwoordigen belangrijke overwegingen^11,30. Om deze redenen moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om het minimaliseren van de effecten van externe factoren die locomotor gedrag van de larvale vissen tijdens experimenten kunnen beïnvloeden. Gedrags opmerkingen moeten worden uitgevoerd in smalle tijd windows (3 tot 4 h) en in perioden wanneer tijd van dag effecten naar verwachting hebben minimale invloed op de larvale locomotor gedrag¹¹. Bovendien moet larvale vissen worden gehandhaafd op een consistente temperatuur (28 ± 1 ° C voor zebravis) en 24 ± 1 ° C voor FHM en op een gedefinieerde licht/donker cyclus in temperatuurgevoelig starterscentra gedurende de blootstelling. Bovendien moet de temperatuur van het laboratorium waar gedragingen worden opgenomen voorwaarden onderlinge aanpassing van de experimentele omstandigheden om te voorkomen dat de temperatuur invloeden op gedrag worden gehandhaafd. Verder moeten putten gebruikt tijdens gedrags opmerkingen op een consistent volume voor elke afzonderlijke vissen worden gehouden.

Larvale en embryonale zebrafish die PMRS eerder in de biomedische wetenschappen gebruikt zijn aan het identificeren van potentiële therapeutische doelen over roman^12,,^{13 verbindingen}. Dit protocol wordt nader ingegaan op de vorige gedrags onderzoek met zebravissen door gebruik te maken van 38 eindpunten voor het onderzoek naar chemische topicale van milieucontaminanten. Hoewel cafeïne is een gemeenschappelijk aquatische verontreinigingen met een begrepen werkingsmechanisme (MoA), veel stoffen in de handel geen belangrijke mechanistische gegevens. Daarom kan dit protocol worden ingezet inzicht van MoAs voor verbindingen ontbreken er gegevens over toxiciteit, met inbegrip van commerciële chemicaliën³⁹. Bovendien is het protocol biedt methoden voor twee van de meest gebruikte vis-modellen. Zoals eerder opgemerkt, overwegende dat de zebravis is een gemeenschappelijk model voor biomedische vis die wordt steeds populairder in de ecotoxicologie, de fathead minnow wordt vaak gebruikt als een ecologisch model voor milieubeoordeling toepassingen maar heeft ontvangen relatief minder aandacht in behavioral studies met geautomatiseerde systemen ten opzichte van de zebravis. Hoewel er nog geen gestandaardiseerde regelgevende methoden voor vis gedrags toxicologische studies, biedt dit protocol een aanpak ter ondersteuning van toekomstige inspanningen.

Cafeïne ontlokte gedrags reacties in elk van de modellen van de vis op niveaus die in het aquatisch milieu¹⁶zijn gevonden. Rodriguez-Gil et al. 2018 ontwikkeld global omgevingsblootstelling distributies in aquatische systemen plaatsvindt op basis van gemeten waarden van cafeïne¹⁶. Specifiek, zou 95% van de voorspelde afvalwater afvalwater concentraties vallen onder de LOECs voor de meest gevoelige gedrags eindpunten van zebravis en fathead minnow in de huidige studie (tabel 2). Hoewel verschillende gedrags effecten van cafeïne in zebrafish (met name in donkere omstandigheden) op milieu relevante niveaus werden waargenomen, is het onduidelijk of deze gedrags wijzigingen kunnen optreden in natuurlijke vispopulaties of resulteren in ecologisch belangrijke nadelige resultaten. Hoewel handig voor gevoelige, diagnostische screening, larvale vissen gedrags drempels mogelijk geen vertegenwoordiger van de andere stadia van de levensloop of van vis in natuurlijke populaties. Verder onderzoek is noodzakelijk om te bepalen of soortgelijke gedragsmatige reactie drempels zou optreden in de natuur en indicatief zijn voor nadelige resultaten op het niveau van het individu of de bevolking van biologische organisatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ViewPoint Zebrabox	ViewPoint		ZebraLab en ZebraLab platform voor geautomatiseerde gedragswaarnemingen
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Studiechemisch product
Incubator	VWR	9110589	Onderhoudt licht/donkercyclus en temperatuur voor fathead minnow experimenten
Incubator	Thermo Fisher Scientific	35824-636	Onderhoudt licht/donkercyclus en temperatuur voor zebrafish experimenten
100 mL glazen bekers	VWR	89000-200	Zebrafish blootstellingskamers
500 mL glazen bekers	Pyrex	EW-34502-03	Fathead minnow blootstellingskamers
5.000 µL auto-pipet	Eppendorf	Research 5000	Gebaat om individuele putjes in putjesplaten te vullen
Transfer Pipetten	VWR	414-004-004	Gebaat om studieorganismen te verplaatsen
48-putjesplaten	Fisher Scientific	08-772-52	Larvale zebravis gedragsopnamekamers
24-putjesplaten	VWR	10062-896	Larvale fathead minnow gedragsopnamekamers
Calciumsulfaat dihydraat	Sigma-Aldrich	C3771	Voor gereconstitueerd hard water
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	M7506	Voor gereconstitueerd hard water
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S5761	Voor gereconstitueerd hard water
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P9333	Voor gereconstitueerd hard water
z-mod recirculatiesysteem	Marine Biotech Systems		Recirculatiesysteem om zebravisculturen te onderhouden
Statistisch analysesoftware	Sigma Plot	Versie 13.0	Gebaat om gedragsgegevens te analyseren en figuren te produceren
Statistisch analysesoftware	Graphpad Prism	Prism 5	Gebaat om figuren te produceren
Autosampler/quaternair pompsysteem	Agilent Technologies	Infinity 1260 model	Analytische verificatie van cafeïnebehandelingsniveaus
Jet stream thermische gradiënt elektrospray ionisatiebron	Agilent Technologies		Analytische verificatie van cafeïnebehandelingsniveaus
Triple quadrupole massa-analyzer	Agilent Technologies	Model 6420	Analytische verificatie van cafeïnebehandelingsniveaus
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ kolom (120Å, 2.7)	Agilent Technologies	685775-914T	Caffeïne chromatografie
MassHunter Optimizer Software	Agilent Technologies		Bepaal de ionisatiemodus, bewaakte overgangen en instrumentele parameters voor cafeïne/cafeïne-d9 en paraxanthine/paraxanthine-d6