Methodenartikel

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

DOI:

10.3791/57941

⸱

17 oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Vascular Biology Research Centre, Westmead Hospital, 2Westmead Clinical School, Department of Surgery, The University of Sydney, 3Westmead Research Hub, Westmead Institute for Medical Research, 4Institute for Clinical Pathology and Medical Research, Westmead Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyten zijn belangrijke medewerkers in diverse inflammatoire aandoeningen en wijzigingen aan deze cellen, met inbegrip van hun subset proporties en functies, pathologische betekenis kunnen hebben. Een ideale methode voor de behandeling van wijzigingen in monocyten is volledig bloed stroom cytometry zoals de minimaal hanteren van monsters door deze methode artefactuele cel activatie beperkt. Echter worden veel verschillende benaderingen genomen om de poort van de deelverzamelingen van de monocyt leiden tot inconsistente identificatie van de deelverzamelingen tussen studies. Hier tonen we een methode met behulp van volledig bloed stroom cytometry te identificeren en te karakteriseren van menselijke monocyt deelverzamelingen (klassieke, intermediate en niet-klassieke). Duidelijk naar voren komt hoe te bereiden de bloedmonsters voor stroom cytometry, poort van de deelverzamelingen (garanderen contaminerende cellen zijn verwijderd), en bepalen monocyt deelverzameling expressie van oppervlakte markers — in dit voorbeeld M1 en M2 markers. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere studies waarvoor een standaard gating methode voor de beoordeling van monocyt deelverzameling proporties en monocyt deelverzameling expressie van andere functionele merkers.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyten zijn een soort witte bloedcellen die een belangrijke rol spelen bij bevordering van en het oplossen van de ontsteking. Er zijn drie voornaamste deelverzamelingen van monocyten erkende, klassieke (~ 85%), intermediate (~ 5%), en niet-klassieke monocyten (~ 10%), die worden gekenmerkt door hun niveau van cluster van differentiatie (CD) 14 en CD16 expressie1. De verhoudingen van monocyt deelverzamelingen kunnen verschillen met de aanwezigheid van ziekte, zoals een grotere aandeel van tussenproducten in verschillende inflammatoire Staten2,3 , met inbegrip van hart-en vaatziekten, waar het niveau van tussenproducten is in verband met klinische gebeurtenissen4,5. Bovendien, in ziekten, monocyten kunnen ook functionele veranderingen ondergaan, met vele veranderingen waarneembaar door een verschil in oppervlakte marker expressie6,7. Een voorbeeld hiervan is monocyt M1-scheeftrekken, een toename van markeringen gekoppeld M1 macrofagen, die is waargenomen in hart-en vaatziekten, diabetes, overgewicht en metabool syndroom7,8,9 , 10.

Ondanks de populariteit van stroom cytometry monocyt deelverzameling aandeel en functie te beoordelen, is er een aanzienlijke variabiliteit in de bereiding van de monsters en subset gating tussen studies waardoor het moeilijk te vergelijken bevindingen tussen dergelijke studies. Nog belangrijker is, is er geen consensus in de afbakening van monocyt deelverzamelingen, maar een gestandaardiseerde aanpak is essentieel gezien de klinische betekenis van wijzigingen in deelverzameling verhoudingen in verschillende ziekten. Onderdeel van de moeilijkheid in het gating vloeit voort uit het feit dat monocyten onderscheiden van de klassieke via de intermediaire tot en met de niet-klassieke deelverzameling11 en als zodanig, monocyten bestaan als een continu spectrum in plaats van verschillende populaties12 . Interessant, toonde Zawada et al. dat met behulp van ofwel een rechthoekige of trapezium gating van de tussenliggende subset, beide hebben geleid tot een hogere tussenliggende subset die voorspeld een cardiovasculaire eindpunt13. Hieruit blijkt dat, ten minste voor het berekenen van de verhoudingen, het hoofdthema is toepassing van een consistente gating strategie tussen verschillende monsters (en studies), in plaats van proberen te definitief discrimineren tussen deelverzamelingen. Hoewel definitieve gating wellicht belangrijker zijn, bij de beoordeling van de functie, de verandering in de marker expressie tussen deelverzamelingen is incrementele12,14, en dus opnieuw, consistentie in het gating is misschien belangrijke. Als zodanig is een doelstelling gating methode die reproducibly apportions de monocyt subsets tussen verschillende monsters nodig. Het doel van de methode die hier gepresenteerd is aan de gate monocyt deelverzamelingen met een heldere uitleg en rechtvaardiging voor het gating techniek werkzaam en beoordelen van de deelverzamelingen voor oppervlakte marker expressie, waardoor een methode waarmee onderzoekers te hebben vertrouwen in het gebruik van deze techniek bij de beoordeling van de verschillende monsters.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie is goedgekeurd door de WSLHD menselijke onderzoek ethische Commissie (HREC) (goedkeuring AU rood HREC/15/WMEAD/289).

1. monstervoorbereiding voor volbloed Stroom Cytometry

Opmerking: Zoals menselijk bloed potentieel besmettelijk is, de set-up van het monster moet worden verricht in een biohazard kap.

  1. De bloedmonsters van de deelnemers in 3 mL ethyleen diamine tetra azijnzuur (EDTA) buizen verzamelen.
  2. De telling van de witte bloedcellen (WBC) met behulp van een hematologie analyzer of hemocytometer te bepalen.
  3. Verdund met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH ~ 7.4) aanpassen van de concentratie op ~ 5 x 106 WBC/mL.
  4. Het aantal buisjes (bijvoorbeeld voor 14 buizen, bereiden 16 x master mix) voldoende master mix voorbereiden door het combineren van 16 x hoeveelheid 50 µL bloed, 0,75 µL anti CD14-V450, 0,5 µL anti CD16-APC en 0.625 µL anti HLA-DR-PerCP. Vortex en Pipetteer 51.9 µL van mix in elke buis (tabel 1).
    Opmerking: Antilichamen moeten worden getitreerd om te bepalen van de optimale kleuring concentraties voor de fluorescerende antilichamen gebruikt.
  5. Bovengrondse markering (M1 en M2 of isotype control, phycoerythrin (PE) geëtiketteerd) toevoegen antilichamen (voorbeeld volgens tabel 2) en PE geëtiketteerd markers voor T-cellen (CD3), de B cellen (CD19), de neutrofiele granulocyten (CD66b) en natural killer (NK) cellen (CD56) (tabel 3). Vortex en incubeer gedurende 30 min, 4 ° C in het donker.
    Opmerking: Markers voor lymfocyten, neutrofielen en NK-cellen zijn opgenomen alleen voor de validatie van de gating methode.
  6. Voeg 250 µL van gecombineerde rode bloedcellen lysis/WBC fixing oplossing, vortex zachtjes onmiddellijk, en incubeer gedurende 10 min in het donker bij 4 ° C.
  7. Voeg 250 µL van PBS en spin cellen naar beneden bij 260 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Verwijder de bovendrijvende substantie, resuspendeer de cellen in 300 µL van 1% formaldehyde.
    Opmerking: Formaldehyde is giftig. Gebruik van nitril handschoenen en gebruik in de zuurkast.
  9. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht, totdat de analyse wordt uitgevoerd.
    Opmerking: Flow analyse wordt aanbevolen binnen de 48u van bereiding van de monsters.

2. Stroom Cytometry

  1. Controleer stroom cytometer log om faciliteit personeel hebben kwaliteitscontroles uitgevoerd.
    Opmerking: Om te zorgen voor samenhang tussen de analyses, de controle van de kwaliteit van het instrument en het behoud van consistente doel fluorescentie intensiteiten met behulp van controle kralen worden aanbevolen.
  2. Voor het instellen van de stroom cytometry experiment, klik op ' nieuw experiment dan "nieuw model" en "nieuwe tube" toe te voegen van buizen. Selecteer bivariate percelen door te klikken op het pictogram en gebruik de uitrolmenu's om te selecteren van de parameters van de as. Zorgen voor opneming van een CD16/CD14 plot en een plot een detector naast tijd weergeven om te controleren de overname.
  3. Buis invoegen en klik op "Verwerven". Controleer de instrument voltage instellingen ervoor te zorgen dat detector signalen niet uit schaal.
  4. Observeren van cellen die vallen in de monocyt-poort van het CD14/CD16 perceel. Opname-drempel ingesteld op 5.000 gebeurtenissen voor de klassieke monocyt-poort en klik op "Record".
  5. Registratie van de gegevens voor overige buizen blijven. Nadat de gegevens voor alle buizen geconstateerd, stroom gegevens exporteren als .fcs-bestanden voor analyse.
    Opmerking: Om ervoor te zorgen nauwkeurigheid, enkele kleur compensatie besturingselementen moeten worden geregistreerd. Een matrix van schadevergoeding kan worden berekend en toegepast op de gegevens vóór de analyse ter verantwoording voor spectrale spill over15,16.

3. monocyt Gating

  1. Geopende bestanden in de analysesoftware. Tweevoudig tikken buis naam en selecteer parameters uit de dropdown menu's te visualiseren van de cellen in een gebied van voorwaartse scatter FSC (A) / hoogte FSC(H) scatterplot toekomen. Een doublet uitsluiting poort maken door te klikken op het gereedschapspictogram van veelhoek poort en bijvoeging van de cellen zoals (figuur 1A).
  2. Selecteer de gated cellen (door te dubbelklikken op de gated regio) en in de nieuwe weergave aanpassen vak dropdown menu parameters weer te geven van de cellen op een FSC (A) / kant scatter SSC(A) perceel. Klik op het pictogram van de rechthoekige poort en royaal Selecteer de bevolking van de monocyt op basis van voorwaartse en zijdelingse scatter eigenschappen moeten worden uitgesloten van de meerderheid van de lymfocyten, NK-cellen en granulocyten (figuur 1B).
  3. Selecteer de gated cellen en opnieuw op een perceel van CD14/CD16, selecteren van de parameters met behulp van de dropdown menu's. Klik op de poort van de veelhoek te selecteren monocyten op basis van hun karakteristieke "┐"-vorm (Figuur 1 c).
  4. Selecteer de gated cellen en de monocyten op een perceel van CD16/HLA-DR met behulp van de dropdown menu's om te selecteren parameters weer te geven. Klik op de poort van de veelhoek tot de HLA-DR positieve cellen selecteren en eventuele overige NK cellen en neutrofielen17 (Figuur 1 d) uit te sluiten.
  5. Selecteer de gated cellen en de HLA-DR positieve cellen weergeven op een perceel van de CD14/HLA-DR dropdown menu's gebruiken om te selecteren parameters. Klik op de poort van de veelhoek en tekenen van een poort als u wilt uitsluiten van de HLA-DR hoge/CD14 laag cellen (B-cellen express hoge niveaus van HLA-DR maar niet CD14) (figuur 1E).
    Opmerking: B-cel verontreiniging kan optreden en daarom moeten worden onderzocht. Als de niet-klassieke bevolking in Figuur 1 c niet verschillend van de cellen aan de linkerkant is, dan is besmetting is waarschijnlijk. Stap 3.5 kan worden overgeslagen als deze B-cellen niet overlappen met niet-klassieke monocyten.
  6. Selecteer de gated cellen en gebruik de uitrolmenu's worden weergegeven op een perceel van CD16/CD14. Selecteer in het vak perceel opties "Zebra perceel" waardoor monocyt deelverzameling poorten moeten worden getrokken om te bepalen van de deelverzameling verhoudingen (figuur 1F).
    Opmerking: zebra plot is niet beschikbaar op de analysesoftware, pseudo-kleur (vloeiend) of contour perceel geschikt kan zijn.
  7. Klik op het pictogram van de rechthoekige poort en selecteer de klassieke monocyten door het tekenen van een geschatte rechthoekige poort rond de CD14 hoge/CD16 laag, klassieke monocyt bevolking. Selecteer "Toon medianen" onder "Display" om de intensiteit van de fluorescentie van de mediaan voor klassieke monocyten weer te geven. Stel de poort zo in dat de bevolking heeft een gelijke verdeling van de mediaan op de linker- en omvat alle cellen naar links.
  8. Selecteer de tussenliggende bevolking door het opstellen van een rechthoekig hek dat de cellen rechts van de klassieke poort omvat. Aanpassen van de onderkant van de poort naar de niet-klassieke cellen uitsluiten door de poort met de onderkant van de concentrische cirkels die volledig binnen de klassieke monocyt-poort, die zorgt ervoor dat de tussenliggende deelverzameling een CD14 expressie vergelijkbaar is met heeft de belangrijkste klassieke bevolking conform de geldende nomenclatuur.
  9. De niet-klassieke subset poort door het opstellen van een rechthoekige doos neer uit de onderste rand van de tussenliggende subset, alle van de cellen naar de onderkant van de bevolking (figuur 1F) te selecteren.
  10. Selecteer "Toon gate frequenties" onder "Display" om te bepalen van het percentage van elke monocyt deelverzameling.

4. bevestiging van het Gating methode

  1. Om te bepalen of potentieel verontreinigende celtypes effectief gated-out, eerst identificeren andere cel populaties met antilichamen tegen T-cellen (CD3), B-cellen (CD19), neutrofielen (CD66b) en NK-cellen (CD56) (Figuur 2).
    Opmerking: Hier T cellen en neutrofielen zijn gated die in Figuur 1 czit dicht bij de "┐"-vorm van de monocyten niet.
  2. Bevestigen dat NK-cellen zijn verwijderd in stap 3.4 (Figuur 1 d), en B cellen zijn verwijderd in stap 3.5 (1E cijfer) zoals aangegeven in Figuur 3. Als NK cellen of B cellen niet omheinde-out, opnieuw aanpassen de poorten.

5. fenotypische monocyt Marker expressie

  1. Selecteer cellen in elke monocyt deelverzameling. Wijzigen dropdown parameters worden gebruikt voor het maken van een histogram voor elke monocyt deelverzameling (figuur 1F) weergave van iedere markeerdraad en de overeenkomende isotype (Figuur 4).
  2. Berekenen van de mate van expressie van iedere markeerdraad (mediaan of meetkundige gemiddelde) in vergelijking met het respectieve isotype-besturingselement.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De monocyt gating strategie en stroom cytometry analyse hier gebruikt (Figuur 1) met succes de monocyt subsets gated en onthuld hun relatieve verhoudingen. De verhoudingen (voor dit voorbeeld) werden berekend als 88.1% klassiekers, 4.33% tussenproducten en 7,49% niet-klassiekers. Deze subset poorten waren niet besmet met de B-cellen T-cellen, neutrofielen en NK-cellen, die werd bevestigd met markeringen, CD19, CD3, CD56 en CD66b, respectievelijk. Door de beoordeling van de relatieve positie van andere populaties, is het duidelijk dat de T-cellen en neutrofielen ook buiten de shape monocyt "┐" op een perceel van CD16/CD14 (figuur 2A en 2D vallen). Echter zowel de NK-cellen en B-cel populaties overlapt met de niet-klassieke monocyt bevolking (figuur 2B en 2 C). De stappen van de gating strategie (Figuur 1 d en 1E) werden bevestigd om de NK-cellen (Figuur 3 bis) en de B-cellen (figuur 3B) te sluiten. Hoewel de B-celpopulatie een klein gedeelte van niet-klassieke monocyten opgenomen, was het bedrag te verwaarlozen.

De subsets kunt weergeven, de mate waarnaar ze verschillende oppervlakte markers, M1 uitgedrukt hebben gated (CD64, CD86 en CD120b) en M2 (CD163, CD11b en CD93) werd beoordeeld. De markeringen toonde positieve expressie ten opzichte van hun bijbehorende isotype-besturingselementen, zoals gezien door de verschuiving van de histogrammen (Figuur 4). De mediaan van de markers was groter dan die van de isotype-besturingselementen.

Toepassing van deze gating strategie op een bloedmonster, die werd opgesplitst in vier buizen, gekleurd en geanalyseerd afzonderlijk, opbrengsten vergelijkbare resultaten tussen de buizen (tabel 4).

figure-results-1
Figuur 1: vertegenwoordiger monocyt strategie in gehele menselijk bloed gating. (A) FSC(A) vs. FSC(H) perceel: Gating de cellen hebben een gelijk oppervlak en hoogte, dus het verwijderen van bosjes (grotere FSC(A) ten opzichte van FSC(H)) en puin (zeer lage FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs. SSC(A) perceel: brede waaier van monocyten op basis van hun WS/FSC-eigenschappen. (C) CD16 vs. CD14 perceel: Gating Schakel monocyten op basis van hun karakteristieke "┐"-vorm. (D) CD16 vs. HLA-DR perceel: Gating HLA-DR positieve cellen selecteren en verwijderen van NK-cellen. (E) CD14 vs. HLA-DR: Gating uit te sluiten van de B-cellen (HLA-DR hoge/CD14 laag) van de monocyten. (F) geselecteerd monocyten opnieuw weergegeven op CD16 vs. CD14 perceel aan de poort van de monocyt subsets. Voor A-F vertegenwoordigt kleur celdichtheid met blauw en groen met vermelding van lage dichtheid, rood en oranje met vermelding van hoge dichtheid en oranje mid-range dichtheid aangeeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: validatie van gating strategie door identificatie van potentieel verontreinigende cellen. Potentieel verontreinigende cellen worden geïdentificeerd door markeringen (A) T cellen (CD3), (B) B cellen (CD19), (C) NK-cellen (CD56) en (D) neutrofiele granulocyten (CD66b). De linker zijpanelen Toon identificatie van elk volk na het gating volgens figuur 1A en 1B, met kleur vertegenwoordigen celdichtheid van hoog (rood) naar laag (blauw). De rechterkant panelen tonen elke celpopulatie (blauw) bovenop de laatste monocyt CD16/CD14 plot te onthullen van de nabijheid van deze bevolking monocyten (rood). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Afbeelding 3: bevestiging dat gating stappen verwijdert u contaminerende cellen. Warmte kaarten tonen de mate van expressie van hoog (rood) naar laag (blauw) van (A) CD56 en (B) CD19. Gating stappen succesvol uitsluiten cellen met hoge CD56 (NK-cellen) en hoge CD19 (B-cellen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: monocyt expressie van M1 (CD120b) en M2 (CD93) markeringen. Gladgestreken histogrammen van monocyt M1 en M2 marker expressie (blauw) toont duidelijke verschuiving van de isotype (rood) voor (A) klassiekers, tussenproducten (B) en (C) niet-klassiekers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

AntilichaamVolume (50 µL bloed)Volume (16 x) 800 µL bloed
CD14 - V4500,75 ΜL12 ΜL
CD16 - APC0,5 ΜL8 ΜL
HLA-DR-PerCP0.625 ΜL10 ΜL

Tabel 1: Antistoffen voor volbloed stroom en master mix.

BuisPE antilichamenCodeIsotype MatchVoorraad concentratieWerkende Volume
1IgG1BD (555749)NB1.0 µg/20 µL0.625 ΜL
2CD163BD (556018)BD IgG10,125 µg/20 µL5 ΜL
3CD64BD (558592)BD IgG10.06 µg/20µL10 ΜL
4IgG1BD (555749)NB1.0 µg/20 µL1,25 ΜL
5CD86BD (555658)BD IgG11.0 µg/20 µL1,25 ΜL
6CD11bBD (561001)BD IgG11.0 µg/20 µL1,25 ΜL
7IgG2aO & O (IC003P)NB25 µg Mo/mL5 ΜL
8CD120b (TNFRII)O & O (FAB226P)R & D IgG2a25 µg Mo/mL5 ΜL
9IgG1BL (400112)NB0,2 mg/mL2.5 ΜL
10CD93BL (336108)BL IgG150 µg Mo/mL1,25 ΜL

Tabel 2: M1/M2-PE fluorescerende label monoclonal antilichamen voor geheel bloedstroom.

BuisAntilichaamWerkende Volume
11CD35 ΜL
12CD195 ΜL
13CD66b1,25 ΜL
14CD565 ΜL

Tabel 3: PE fluorescerende label monoclonal antilichamen voor lymfocyten (T-cellen, B-cellen), neutrofielen en NK-cellen.

Buis% Klassiek% Intermediair% Niet-klassieke
184,35.1110.1
284,25.0510.5
384,35.0310,7
481,65.0312.1

Tabel 4: Monocyt deelverzameling proporties van een bloedmonster gekleurd en afzonderlijk geanalyseerd.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volbloed stroom cytometry is een ideale aanpak monocyten bestuderen, zoals de cellen in voorwaarden dicht bij hun fysiologische communicatie een inzicht te geven in hun rollen in infectie en inflammatoire voorwaarden worden onderzocht. Bovendien, het gebruik van verse (dat wil zeggen, onbewerkte) bloedmonsters minimaliseert de verbouwingen of de cel transformaties die kunnen optreden als gevolg van opslag of verwerking van18,19, zoals die optreden bij het bevriezen-ontdooid monocyten 20. snelle monstervoorbereiding is aanbevolen omdat sommige markeringen upregulated zijn als monsters vóór verwerking19op kamertemperatuur worden bewaard. De optimale concentratie van M1 en M2 markeringen werden bepaald door titratie, en dit moet gebeuren voor alle nieuwe antilichamen tegen niet-specifieke binding te beperken en tegelijkertijd te waarborgen dat de mate van verschuiving te wijten aan antigeen expressie is en niet door een gebrek aan antilichaam beperkt. De verwijdering van rode bloedcellen en fixatie van de witte bloedcellen met lysis van de oplossing is een belangrijke stap in dit protocol als de aanwezigheid van rode bloedcellen met stroom cytometry21,22 interfereren kan. Merk op dat terwijl sommige lysis oplossingen compatibel met neen-wash kleuring zijn, duidelijker populaties duidelijk in onze handen zijn als een wassen stap wordt gebruikt.

Juiste installatie van de cytometer van de stroom is ook cruciaal bij het vergelijken van expressie van monocyt markers. Het is raadzaam dat onderzoekers consistent doel fluorescentie intensiteiten van controle kralen blijven en kwaliteitscontrole uitvoeren op het instrument worden gebruikt om te zorgen voor consistente resultaten over verschillende steekproeven worden uitgevoerd op verschillende dagen. Naast dit, worden isotype besturingselementen gebruikt om te helpen bij de interpretatie van elke niet-specifieke achtergrond signaal gegenereerd door niet-specifieke antilichaam binding. Monocyten hebben hoge niveaus van Fc receptoren11 en daarom zijn vatbaar voor niet-specifieke binding. Van de nota, het niveau van niet-specifieke binding verschilt voor de verschillende subgroepen, en dus het gebruik van een besturingselement isotype wordt belangrijk bij het vergelijken van de mate van marker expressie tussen deelverzamelingen.

Een ander belangrijk criterium moet worden beschouwd is de gating stappen werkzaam. Sommige studies suggereren dat het is van cruciaal belang om te tekenen van een strakke hek rond de monocyt bevolking in FSC(A)/SSC(A) plot om zich te ontdoen van het merendeel van de niet-monocytic CD16 positieve cellen23,24,25, maar dit kan leiden tot verlies van enkele monocyten zoals niet-monocyt cellen kunnen overlappen met de monocyten op FSC/SSC percelen26. Als u wilt uitsluiten van andere bloedcellen die de monocyten besmetten kan, is de opneming van een derde monocyt markering naast CD14 en CD16, veeleer essentiële26,27. Om deze reden, HLA-DR wordt vaak gebruikt en is ideaal als het niet wordt uitgedrukt door NK cellen of neutrofielen17,-28. Hoewel lymfocyten (B-cellen en T-cellen) kunnen HLA-DR express, verschillen ze van de monocyten met betrekking tot CD14 expressie. Hoewel HLA-DR een ideale derde markeerdraad is, CD86 is ook aanbevolen5,27,29 , maar werd niet hier gebruikt als het is ook een marker van de M1 en dus de mate van expressie op monocyt deelverzamelingen werd beoordeeld.

Validatie van de gating strategie gebruikt is van cruciaal belang. Terwijl de NK-cellen zijn gekend om te overlappen met niet-klassiekers als ze niet uit28 omheinde zijn, zien we dat de B-cellen ook kunnen overlappen met de niet-klassiekers (figuur 2B); of dit het geval in andere studies is kan afhangen van de fluorescerende keuze, instrument configuratie, gevoeligheid van de detector of zelfs de ziekte conditie onderzocht. Hier, de overlappende B cellen bleek hoge expressie van HLA-DR en waren niet uit door selectie van HLA-DR positieve cellen in Figuur 1 d. Eerder verwijderen van B-cellen gebruikten we een extra perceel van CD14 / HLA-DR, waar de B-cellen scheiden van niet-klassiekers als gevolg van hun hogere HLA-DR en lage CD14 expressie.

Er zijn ook veel verschillende manieren waarin de poorten voor de monocyten zelf zijn getekend in de literatuur; het gaat hierbij om kwadranten (de subsets zijn gescheiden door Kwadrant markeringen) en rechthoekige of trapezium vakken13 (met aparte vakken voor elke deelverzameling getekend) die bovendien verschillen in hun plaatsing uitgezet waar een subset eindigt en een andere begint. Deze waarschijnlijk verschillen weerspiegelen het feit dat monocyten bestaan als een continuüm van cellen, differentiëren van klassieke tot niet-klassiek, in plaats van als duidelijk zijn te onderscheiden populaties. Nochtans, omdat variaties in technieken voor de identificatie van de deelverzamelingen zelf tot verschillen in de verhoudingen van de deelverzameling berekende monocyt leiden kunnen, wordt het belangrijk dat de gating methode is redelijk objectieve, in plaats van subjectieve, zoals dit zal de methode robuuster en reproduceerbaar maken Een besturingselement voor een isotype voor CD16 sommige studies gebruiken om te bepalen van de grens tussen de klassieke en tussenliggende subsets30. Aan de andere kant, als u wilt definiëren de scheiding tussen tussenproducten en niet-klassiekers, wordt er geopperd dat de afbakeningslijn mogelijk verticale of schuine, met de keuze tot de onderzoekers, de voorwaarde dat het moet reproduceerbaar, maar een rechthoekige gate heeft aanbevolen om vergelijkingen tussen studies13,30,31. Verhoogde objectiviteit was hier, verkregen door het uitzetten van de gegevens op een perceel van zebra en de toepassing van objectieve visuele regels, omdat zebra percelen een extra visualisatie cue bieden door het mengen van kleurverloop aan elke gelijke waarschijnlijkheid bin over een traditionele contour plot. De rechterrand van de klassieke subset werd getrokken zodat de bevolking was gelijkmatig verdeeld rond de mediaan van de bevolking. De scheiding tussen de tussenproducten en de niet-klassiekers werden ook gestandaardiseerd door het hebben van de base van de tussenproducten uitlijnen met de onderkant van de concentrische cirkels binnen de klassieke bevolking (dat wil zeggen, de tussenliggende bevolking duidelijk spreekt van hoge niveaus van CD14, volgens de Standaardnomenclatuur1).

Terwijl sommige studies hebben voorgesteld het gebruik van extra markers, zoals C-C chemokine receptor type 2 (CCR2) of 6-sulfo LacNAc (SLAN) voor het verkrijgen van succesvolle opsomming van monocyten en te onthullen hun klinische significantie32,33 , in onze handen het niveau van expressie van vele monocyt functionele merkers varieert sterk tussen individuen14. Deze variatie kan het nut van deze markers te definiëren op basis van hun uitdrukking deelverzamelingen beperken. Geautomatiseerde computationele benaderingen zijn ook gebruikt om te visualiseren en cluster monocyt deelverzamelingen met inbegrip van visuele interactieve stochastische buurman insluiten (viSNE), t-verdeelde stochastische buurman insluiten (tSNE) of progressie van de Spanning-boom Analyse van de gebeurtenissen van de dichtheid-genormaliseerd (SPADE)34,35, die voor visuele weergave van de cellen op basis van de set van meerdere markeringen gebruikt zorgen kan. Terwijl dit is aangetoond dat het verhogen van de nauwkeurigheid van de gating strategie in monocyt deelverzameling classificatie, wordt erkend dat een nadeel het aantal antilichamen (en bijbehorende fluorophore kanalen is) vereist. Het nut ervan zal afhangen van de vragen; de extra complexiteit kan niet gerechtvaardigd zijn, bijvoorbeeld in de opsomming studies.

Monocyten gated met onze techniek Toon verhoudingen in overeenstemming met de literatuur en de expressie van oppervlakte markeerders door de drie deelverzamelingen gemakkelijk kan worden bepaald. Over het geheel genomen biedt de techniek en de methodologie hier uitgelegd een gestandaardiseerde en eenvoudige methode opsommen monocyt deelverzameling verhoudingen en beoordelen van oppervlakte marker expressie, die kan worden uitgebreid tot andere markeringen alsmede, waardoor valideren hun functionele rol in verschillende andere omstandigheden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stroom cytometry werd uitgevoerd in de Stroom Cytometry Core faciliteit die wordt ondersteund door het Westmead Institute for Medical Research, Westmead onderzoek Hub, Cancer Institute New South Wales, en National Health and Medical Research Council. Deze studie werd ondersteund door klinische chemie onderzoek en Education Fund.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BD vacutainer blood collection setBecton Dickinson367286
BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mLBecton Dickinson7128959
Phospahate Buffered Saline (PBS)Lonza17-516F
5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style)Invitro technologies352054
V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9]BD Biosciences560349
APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8]Abcam Australiaab140477
Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243]BioLegend307628
PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21]BD Biosciences555749Lot # 4283901
PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61]BD Biosciences556018Lot # 2335626
PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1]BD Biosciences558592Lot # 36768
PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)]BD Biosciences555658Lot # 3109766
PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44]BD Biosciences561001Lot # 3228959
PE Mouse IgG2A Isotype control [20102]R&D SystemsIC003PLot # 1212031
PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235]R&D SystemsFAB226PLot # 612051
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21]BioLegend400112Lot # B220359
PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2]BioLegend336107Lot # B143544
PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7]BD Biosciences347347Lot # 3010929
PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19]BD Biosciences561741Lot # 2307721
PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159]BD Biosciences561903Lot # 3011796
PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5]BioLegend305105Lot # B154037
OptiLyse CBeckman CoulterA11895
Formaldehyde solution 37%SigmaF1635
BD FACSCanto II Flow CytometerBD Biosciences
Automatic haematology analyser, XT-1800iSysmex
Centrifuge GS-6RBeckman
Flowjo software v10.0.7Tree Star Inc

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  2. Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
  3. Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483(2016).
  4. Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
  5. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  6. Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
  7. Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
  8. Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7(2010).
  9. Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
  10. Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  12. Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339(2013).
  13. Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
  14. Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
  15. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
  16. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).
  17. Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
  18. Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886(2015).
  19. Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
  20. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
  21. Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
  22. Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
  23. Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
  24. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
  25. Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
  26. Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
  27. Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
  28. Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
  29. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  30. Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23(2013).
  31. Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
  32. Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
  33. Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
  34. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886(2011).
  35. Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CD14 CD16 gatingHLA DR markeranalyseM1 M2 markerexpressievoorbereiding van bloedmonsterslyse van rode bloedcellenforward scatter analysegating voor uitsluiting van doublettenverwijdering van contaminerende cellen

Gerelateerde artikelen