Method Article

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De fluorescentie microscopie heeft grote bijdragen geleverd in de ontrafeling van de mechanismen van complexe biologische processen op het niveau van één molecuul. In één molecuul testen voor de studie van DNA-eiwit interactie, zijn er twee belangrijke factoren ter overweging: de DNA-substraat met voldoende lengte voor gemakkelijk waarneming en labelen van een eiwit met een geschikt fluorescente sonde. 48.5 kb λ DNA is een goede kandidaat voor de DNA-substraat. Quantumdots (Qdots), toestaan als een klasse van fluorescerende sondes, dat lange tijd observatie (minuten tot uren) en kwalitatief hoogwaardige Beeldacquisitie. In deze paper presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interacties op het niveau van de single-molecuul, waarin de voorbereiding van een site-specifically gemodificeerde λ DNA en labelen van een target eiwit met streptavidine beklede Qdots. Voor een proof of concept, wij kiezen voor ORC (oorsprong erkenning complexe) in ontluikende gist als een proteïne van belang en visualiseren de wisselwerking daarvan met een ARS (autonoom replicerende sequence) met behulp van TIRFM. Vergeleken met andere tl sondes, Qdots hebben duidelijke voordelen in één molecuul studies als gevolg van de hoge stabiliteit tegen photobleaching, maar hierbij moet worden opgemerkt dat deze eigenschap de toepassing ervan in kwantitatieve tests beperkt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interacties tussen eiwitten en DNA zijn essentieel voor vele complexe biologische processen, zoals DNA-replicatie, DNA-reparatie en transcriptie. Hoewel conventionele benaderingen licht op de eigenschappen van deze processen werpen hebben, zijn vele belangrijke mechanismen zijn nog onduidelijk. Onlangs, met de zich snel ontwikkelende enkel molecuul technieken, sommige van de mechanismen zijn geadresseerd1,2,3.

De toepassing van single-molecuul fluorescentie microscopie op het visualiseren van eiwit-DNA interacties in real-time voornamelijk hangt af....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van de λ-ARS317 DNA substraat

  1. DNA substraat bouw en verpakking
    1. Verteren inheemse λ DNA met behulp van Xhoik enzym; versterken van 543 bp DNA fragment invloed ARS317 uit de genomic DNA van ontluikende gist gebruikend inleidingen met 20 bp homologe reeksen van stroomopwaarts en stroomafwaarts van Xhoik enzym site op lambda DNA. Voeg 100 ng van Xhoverteerd ik λ DNA en 10 ng van DNA fragment aan 10 µL van homologe recombinatie reactie systeem, en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.
    2. Als wilt inpakken de DNA recombinatie λ, voeg 25 µL van extracten van de verpakking van de lambda....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te visualiseren de interactie tussen Qdot-geëtiketteerden ORC en de ARS, gebouwd we eerst de λ-ARS317 DNA substraat. Een fragment van DNA met ARS317 werd geïntegreerd in Xhoik (33,5 kb) site van inheemse λ DNA door homologe recombinatie (figuur 1A). De recombinatie product is verpakt met behulp van extracten en de verpakte phage deeltjes werden gekweekt op LB platen (figuur 1B). De positieve faag plaquette werd gescre.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te zien hoe de interactie tussen het eiwit Qdot-label en het DNA van de site-specifically gemodificeerde λ met behulp van de TIRFM in een flow-cel. De noodzakelijke stappen omvatten site-specific wijziging van DNA substraat, DNA biotinylation dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, stroom-cel voorbereiding en single-molecuul imaging. Er zijn twee cruciale aandachtspunten die dient te worden opgemerkt. Ten eerste, al de stappen met λ DNA moeten zachtjes worden gemanipuleerd om .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Hasan Yardimci en Dr.Sevim Yardimci van het Francis Crick Instituut voor soort helpen in de single-molecuul experimenten, Dr. Daniel Duzdevich van Dr. Eric C. Greene's lab van Columbia University, Dr. Yujie Sun van de Universiteit van Peking en Dr. Chunlai Chen van Tsinghua Universiteit voor nuttige discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisciplinaire innovatie Team en de Newton geavanceerde Fellowship (NA140085) van de Royal Society.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Store 25 μL aliquots at -20 ºC.
XhoI enzymeThermo Fisher ScientificFD0694
Quick-fusion cloning kitBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Packaging Extracts		EpicentreMP5110Bacterial strain LE392MP
is included in this package.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10013092Any brand is acceptable.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/AAny brand is acceptable.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AAny brand is acceptable.
NZ-amineAmrescoJ853-250G
Casamino acidsSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Magnetic stirring apparatusIKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf tubeEppendorf3012215115 mL, sterile, bulk, 500pcs
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Biotinylated primersThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009259
Potassium hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetoneThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80120891sulfuric acid
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd1001121830% Hydrogen peroxide
MethanolSigma-Aldrich322415-2L
Acetic acidSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(methoxy-polyethylene glycol)		LysanmPEG-SVA-5000
biotin-PEG
(biotin-polyethylene glycol)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Vacuum desiccatorTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Vacuum sealerMAGIC SEALWP300
Diamond-tipped glass scribeELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
Glass slideSail Brand7101
Inlet tubingSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.
Outlet tubingSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.
Double-sided tapeSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005five minutes epoxy
StreptavidinSigma-AldrichS4762
Fluorescence MicroscopeOlympusIX71
Infusion/withdrawal
programmable pump		Harvard apparatus70-4504
532 nm laserCoherentSapphire-532-50
640 nm laserCoherentOBIS-640-100
EMCCD CameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
splitting optics		Hamamatsu photonics K.K.A12801-01
TIRF illumination systemOlympusIX2-RFAEVA2
60×TIRF objectiveOlympusAPON60XOTIRF
Quad-edge laser dichroic
beamsplitter		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Quad-band bandpass filterSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dichroic beamsplitterSemrockFF649-Di01-25x36
Emission filterChroma Technology CorpET585/65m
Emission filterChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore at 4 ºC, do not freeze.
ATPAmresco0220-25GPrepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GPrepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles