Method Article

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De fluorescentie microscopie heeft grote bijdragen geleverd in de ontrafeling van de mechanismen van complexe biologische processen op het niveau van één molecuul. In één molecuul testen voor de studie van DNA-eiwit interactie, zijn er twee belangrijke factoren ter overweging: de DNA-substraat met voldoende lengte voor gemakkelijk waarneming en labelen van een eiwit met een geschikt fluorescente sonde. 48.5 kb λ DNA is een goede kandidaat voor de DNA-substraat. Quantumdots (Qdots), toestaan als een klasse van fluorescerende sondes, dat lange tijd observatie (minuten tot uren) en kwalitatief hoogwaardige Beeldacquisitie. In deze paper presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interacties op het niveau van de single-molecuul, waarin de voorbereiding van een site-specifically gemodificeerde λ DNA en labelen van een target eiwit met streptavidine beklede Qdots. Voor een proof of concept, wij kiezen voor ORC (oorsprong erkenning complexe) in ontluikende gist als een proteïne van belang en visualiseren de wisselwerking daarvan met een ARS (autonoom replicerende sequence) met behulp van TIRFM. Vergeleken met andere tl sondes, Qdots hebben duidelijke voordelen in één molecuul studies als gevolg van de hoge stabiliteit tegen photobleaching, maar hierbij moet worden opgemerkt dat deze eigenschap de toepassing ervan in kwantitatieve tests beperkt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interacties tussen eiwitten en DNA zijn essentieel voor vele complexe biologische processen, zoals DNA-replicatie, DNA-reparatie en transcriptie. Hoewel conventionele benaderingen licht op de eigenschappen van deze processen werpen hebben, zijn vele belangrijke mechanismen zijn nog onduidelijk. Onlangs, met de zich snel ontwikkelende enkel molecuul technieken, sommige van de mechanismen zijn geadresseerd1,2,3.

De toepassing van single-molecuul fluorescentie microscopie op het visualiseren van eiwit-DNA interacties in real-time voornamelijk hangt af van de ontwikkeling van fluorescentie detectie en fluorescerende sondes. Voor de studie van een enkel molecuul is het belangrijk om de proteïne van belang van een label met een geschikt fluorescente sonde aangezien fluorescentie detectiesystemen meestal commercieel beschikbaar zijn.

Fluorescerende eiwitten worden vaak gebruikt in moleculaire biologie. Echter beperken de lage fluorescerende helderheid en stabiliteit tegen photobleaching de toepassing ervan in veel enkel molecuul testen. Quantumdots (Qdots) zijn kleine lichtgevende nanodeeltjes4. Vanwege hun unieke optische eigenschappen, Qdots zijn 10 - 20 keer helderder en verscheidene duizend keer meer stabiel dan de gebruikte organische kleurstoffen5. Bovendien hebben de Qdots een grote Stokes shift (het verschil tussen de positie van excitatie en emissie pieken)5. Dus, is dat de Qdots kan worden gebruikt voor lange tijd waarneming (minuten tot uren) en verwerving van beelden met hoge signaal-ruis verhoudingen, terwijl ze kunnen niet worden gebruikt in de kwantitatieve tests.

Tot op heden zijn er twee benaderingen van label een doel eiwit met Qdots site-specifically: labelen met behulp van Qdot-geconjugeerde primaire of secundaire antilichamen6,7,8; of het doel-eiwit met Qdots direct, dat is gebaseerd op de sterke wisselwerking tussen Biotine en daar9,10,11,12,13te labelen. Daar beklede Qdots zijn commercieel verkrijgbaar. In onze recente studie site-specifically biotinyleerd eiwitten in de ontluikende gist met hoge efficiëntie werden gezuiverd door co-overexpressie van BirA en Avi-gelabelde proteïnen in vivo10. Door het volgende en het optimaliseren van de single-molecuul testen14,15,16,17, nageleefd wij de interacties tussen Qdot-geëtiketteerden eiwitten en DNA op de enkel molecuul niveau met behulp van TIRFM10.

Hier, we kiezen de ontluikende gist oorsprong erkenning complexe (ORC), die kan worden specifiek herkend en binden aan de autonoom replicerende volgorde (ARS), als onze proteïne van belang. Het volgende protocol presenteert een stapsgewijze procedure voor het visualiseren van de interactie van Qdot-label ORC met ARS met behulp van TIRFM. De voorbereiding van het site-specifically gemodificeerde DNA substraat, de biotinylation van DNA, het dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, de vergadering van de stroom-cel en de single-molecuul beeldvorming worden beschreven.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van de λ-ARS317 DNA substraat

  1. DNA substraat bouw en verpakking
    1. Verteren inheemse λ DNA met behulp van Xhoik enzym; versterken van 543 bp DNA fragment invloed ARS317 uit de genomic DNA van ontluikende gist gebruikend inleidingen met 20 bp homologe reeksen van stroomopwaarts en stroomafwaarts van Xhoik enzym site op lambda DNA. Voeg 100 ng van Xhoverteerd ik λ DNA en 10 ng van DNA fragment aan 10 µL van homologe recombinatie reactie systeem, en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.
    2. Als wilt inpakken de DNA recombinatie λ, voeg 25 µL van extracten van de verpakking van de lambda in het product recombinatie en Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 90 min. Vervolgens voegt u een extra 25 µL van extracten van de verpakking van de lambda in de reactiebuis. Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 90 minuten blijven.
    3. Voeg 500 µL van steriele verdunning buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) in het reactie-systeem, en meng zachtjes door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen. Voeg 25 µL van chloroform, meng zachtjes en bewaren bij 4 ° C.
    4. Voeg 100 µL van verpakte bacteriofaag en 100 µL van bacteriën LE392MP (gekweekt op 0.8 - 1.0 LB via toevoegen met 10 mM MgSO4) in een nieuwe buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
    5. Voeg 200 µL van phage-bacterie mengsel in 4 mL oftop agar (LB medium + 0,7% agar + 10 mM MgSO4, afgekoeld tot 48 ° C). Meng onmiddellijk door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen en giet het op een bord voorverwarmde (37 ° C) LB.
    6. Na een nacht bebroeden de plaat bij 37 ° C en de λ-ARS317 plaquette met behulp van PCR en het rangschikken van het scherm.
  2. DNA substraat zuivering van vloeibare lysates11,18
    1. Kies een plaque in 200 µL van steriele ddH2O met 10 mM MgCl2 en 10 nM CaCl2. Meng met 200 µL van bacteriën LE392MP (gekweekte overnachting in LB medium) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
    2. Voeg het mengsel faag-bacterie in 100 mL NZCYM (10 g/L NZ-amine, 5 g/L gist extract, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino hydrolysaat en 2 g/L MgSO4·7H2O) medium en cultuur gedurende 7 uur bij 37 ° C. Voeg 250 µL van chloroform in de cultuur en schud voor een ander 10 min.
    3. Breng de cultuur in een maatkolf van 200 mL. Voeg 5.8 g NaCl (1 M eindconcentratie), roer om op te lossen met de hand, en broeden op het ijs gedurende 30 minuten.
    4. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin van de cel. Verzamelen van de bovendrijvende substantie in een maatkolf van 200 mL en voeg toe 10% PEG8000 (m/V). Roer om los door magnetische roeren apparaat en incubeer op ijs gedurende 30 minuten of langer.
    5. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het neerslaan van de bacteriofaag. Verwijder het supernatant.
    6. Resuspendeer de neerslag in 2 mL zuiver faag verdunning buffer. Breng dit in een tube van 15 mL en voeg 10 µL van RNase (eindconcentratie is 20 µg/mL) en 40 µL van DNase (eindconcentratie is 5 µg/mL). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    7. Voeg toe 2 mL 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 µL proteïnase K (eindconcentratie is 10 µg/mL). Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
    8. Voeg toe 2 mL pre gekoelde Kaliumacetaat (3 M, pH 4.8), en de buis op ijs gedurende 10 minuten uit te broeden.
    9. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van de onoplosbare materialen.
    10. Voeg 0.7 x hoeveelheid isopropanol in het supernatant. Meng door te draaien aan de buis ondersteboven meerdere malen en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    11. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten op RT te precipiteren DNA. Verwijder het supernatant.
    12. Wassen het DNA zodra met 70% ethanol door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 10 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
    13. Elueer het DNA met 500 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) zachtjes, en breng het DNA in 1,5 mL-buis.
    14. Uitpakken van het DNA tweemaal met behulp van fenol: chloroform door centrifugeren bij 8.000 g gedurende 10 minuten.
    15. Neerslag met 0.7 x volumedelen isopropanol. Meng door de buis opwaartse zachtjes naar beneden, en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 10 minuten.
    16. Een keer wassen met 70% ethanol, resuspendeer in 200 µL voor TE. Meten van de concentratie van DNA, en opgeslagen bij-20 ° C in 12,5 µg aliquots.

2. λ-ARS317 DNA Biotinylation

  1. Om phosphorylate biotinyleerd oligonucleotides (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotine-3') complementair aan het linkereinde van native λ DNA, voeg 1 µL (100 µM) van oligonucleotides, 7,5 µL van ddH2O, 1 µL van 10 x ligase buffer en 0,5 µL van T4 PNK. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 3 uur.
  2. Λ-ARS317 phosphorylate, toevoegen van 12,5 µg λ-ARS317, 3 µL van 10 x ligase buffer, Incubeer 1 µL van T4 PNK en ddH2O tot totale hoeveelheid 30 µL. de reactie bij 37 ° C gedurende 3 uur.
  3. Toevoegen om te ontharden oligonucleotides met λ-ARS317, 0,5 µL van gefosforyleerd oligonucleotides, 195 µL van ddH2O, 25 µL van 10 × ligase buffer in de gefosforyleerd λ-ARS317 buis. Meng zachtjes door te draaien aan de buis ondersteboven en Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 min. beurt uit het blok kachel, en laat het monster koel aan minder dan 33 ° C in het blok.
  4. Om het afbinden oligonucleotides met λ-ARS317, voeg 1 µL van T4 DNA ligase en 0.63 µL van ATP (200 mM). Meng voorzichtig door de buis ondersteboven draaien en na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur voor 2 uur of 4 ° C. Bewaren bij 4 ° C gedurende 1 maand.
    Opmerking: Om te voorkomen dat de sloop van het DNA, alle mengen stappen moeten worden gedaan door zachtjes draaien de buis ondersteboven, in plaats van mengen met behulp van pipetten.

3. dekglaasje aan reinigings- en Functionalization

  1. Dekglaasje aan schoonmaken
    1. Plaats 20 coverslips in 4 kleuring potten (5 coverslips/pot), bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten in ethanol, en spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 3 keer.
    2. Bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten met 1 M kaliumhydroxide (KOH), en spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 3 keer. Herhaal de ethanol en KOH ultrasoonapparaat eens.
    3. Bewerk de ultrasone trillingen ten met aceton gedurende 30 minuten, en spoel na met ultrazuiver H2O grondig (minstens 3 maal).
      Opmerking: Aceton moet worden verwijderd grondig door spoelen met ultrazuiver H2O, omdat het leiden een explosie tot kan bij organische oplosmiddelen (zoals aceton) vermenging met de piranha-oplossing per ongeluk14.
    4. Plaats de coverslips in piranha-oplossing (3:1 mengsel van H2SO4 en 30% H2O2) en Incubeer bij 95 ° C gedurende 1 uur.
      Opmerking: Piranha-oplossing is zeer energiek en erosieve, dus gebruik met voorzichtigheid. Bij de voorbereiding van piranha-oplossing, voegt toe 50 mL H2O2 eerst in een bekerglas van 500 mL glas, en vervolgens 150 mL H2dus4 langzaam af in het bekerglas.
    5. Spoel de coverslips met ultrazuiver H2O 5 keer. Vervolgens wassen elke dekglaasje aan met ultrazuiver H2O grondig met behulp van 3 bekerglazen gevuld met ultrazuiver H2O en droog het dekglaasje aan met behulp van papier vanaf de rand van het dekglaasje aan. Plaatst het dekglaasje aan in de kleuring pot en droog het dekglaasje aan grondig in een oven van 110 ° C gedurende 30 minuten.
      1. Spoel het dekglaasje aan met methanol en plaats de kleuring pot in de oven van 110 ° C opnieuw aan het dekglaasje aan goed afdrogen.
        Opmerking: Het dekglaasje aan grondig drogen is zeer belangrijk, omdat APTES veel mogelijke oppervlakte structuren hebben zal zodra het in aanwezigheid van water19.
  2. Dekglaasje aan functionalization
    1. Voeg 70 mL silane oplossing (93% methanol, 5% azijnzuur en 2% APTES) in elke pot, schroef de dop en laat de pot bij kamertemperatuur 's nachts.
    2. Was en droog de coverslips zoals beschreven in stap 3.1.5, behalve droog de coverslips grondig met stikstofgas in plaats van ze in de oven plaatsen.
    3. Los 150 mg voor mPEG (methoxy-polyethyleenglycol) en 6 mg Biotine-PEG (Biotine-polyethyleenglycol) grondig in 1 mL 0,1 M vers-en-klare NaHCO3 (pH 8.2). Vervolgens centrifuge op 17, 000 x g voor 1 min te verwijderen van de onoplosbare pinnen.
      Opmerking: Versgemaakte NaHCO3 is klaar; Er is geen behoefte aan te passen van de pH.
    4. Plaats van de coverslips gesilaneerde in vakken, en zet twee kleine coverslips op de bovenkant van twee uiteinden van de gesilaneerde coverslips. Pipetteer 100 µL van PEG oplossing in het midden van de gesilaneerde dekglaasje aan en plaats een andere gesilaneerde dekglaasje aan op de top.
    5. Sommige ultrazuiver H2O toevoegen in het vak te vochtig houden, en de coverslips met PEG oplossing voor ten minste 3 uur in het donker uit te broeden. Een overnachting incubatie kan eveneens werken.
    6. Scheiden van de paren dekglaasje aan en houden de functionalized oppervlakte gezicht, spoel de coverslips uitgebreid met behulp van ultrazuiver H2O en droog ze met stikstofgas.
    7. Markeer de functionalized kant van de coverslips op een van de hoeken gebruikmakend van een viltstift, houden de functionalized kant onder ogen zien, plaats ze in vakken en opslaan van de vakken in het vacuüm exsiccator voor 1 maand.
    8. Voor het opslaan van de coverslips voor een langere tijd, breng een dekglaasje aan in een tube van 50 mL geboord met een gat in de dop, dan zet de buis in een plastic zak en sluit de zak met behulp van een vacuum sealer. Op deze manier kunnen de coverslips worden opgeslagen bij-20 ° C ongeveer 3 maanden.

4. flow cel vergadering

  1. Het snijden van een kanaal van 15 mm × 2 mm in het midden van een stukje dubbelzijdig tape (30 mm × 12 mm) met behulp van een perforatie.
  2. Afschilferen van de kant van de papier van de dubbelzijdige tape en plak deze op het glasplaatje met twee gaten. Druk op om luchtbellen te verwijderen. Gebaseerd op onze ervaring, is het makkelijker te verwijderen van luchtbellen door peeling uit de kant van de papier dan de plastic kant van de dubbelzijdige tape.
  3. Snijd een functionalized dekglaasje aan (60 mm × 24 mm) in vier stukken (30 mm × 12 mm) met behulp van een diamant-tipped glas scribe en verwijderen van het puin met stikstofgas. Vergeet niet om de functionalized kant onder ogen zien.
  4. Afschilferen van de plastic kant van de dubbelzijdige tape, en plak de dia op de functionalized dekglaasje aan. Druk zachtjes op luchtbellen tussen het dekglaasje aan en de band verwijderen. Het grondig verwijderen van luchtbellen kan behoeden de stroom cel terwijl buffers werden gepompt in het lekken.
  5. Invoegen inlaat en uitlaat slang in kleine en grote gaten, respectievelijk. Bevestigen van de buis met behulp van epoxy.
  6. Pomp 20 µL van daar (0,2 mg/mL) in cel van stroom met behulp van een injectiespuit handmatig en Incubeer bij RT gedurende 10 min. Vervolgens pomp blokkerende buffer10 in stroom cel ter vervanging van daar, en bewaar deze bij kamertemperatuur.

5. enkel molecuul visualisatie

  1. De focal uitlijning van rood en far-red met A5 op de fluorescentie Microscoop test dia #1 verkrijgen door gelijktijdige excitatie met behulp van een 532 nm laser en een 640 nm-laser. Produceren dubbele golflengte beelden met het splitsen van optica (Zie Tabel van materialen).
  2. Plaats van de cel van de stroom op de Microscoop en sluit haar uitlaat slang aan een langere buis aansluiten met een veer van de 10 mL op een geautomatiseerde infusie/intrekking programmeerbare pomp geïnstalleerd.
    Opmerking: Het pompen van buffers in de cel van de stroom onderstaande middelen intrekking van de buffers van de buizen van de inlaat van de stroom-cel met de spuit.
  3. Pomp buffer met blokkerend op 500 µL/min in de cel van de stroom lucht snel verwijderen en ervoor zorgen dat de buffer in de cel van de stroom opgeheven wordt. Vervolgens de buffer met blokkerend op 200 µL/min pomp in de cel van de stroom en de uitlaat slang om te verwijderen van luchtbellen uit de buis van de inlaat en de stroom-cel grondig wegknippen.
    Opmerking: Alle buffers in de cel stroom gepompt moeten worden ontgast in een vacuüm exsiccator gedurende ten minste 15 minuten vóór gebruik.
  4. Voeg 0,5 µL van biotinyleerd λ-ARS317 DNA in 80 µL van buffer met blokkerend, en pomp het in de cel van de stroom aan 25 µL/min gedurende 2 minuten. Vervolgens spoel λ-ARS317 DNA met behulp van 200 µL van buffer met blokkerend met een snelheid van 50 µL/min.
  5. Pomp 200 µL van bindende buffer10 bij een snelheid van 50 µL/min voor het verwijderen van de buffer met blokkerend in de cel van de stroom.
  6. Voeg 0.2 µL van daar beklede Qdot705 (1 µM) en 0.2 µL van biotinyleerd ORC (1,2 µM) in een buis, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Daarna voeg 20 µL van bindende buffer in de buis, en plaats het op het ijs. De uiteindelijke concentratie van ORC-Qdot705 is ongeveer 10 nM.
  7. Voeg 2 µL van ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL van DTT (100 mM), 1 µL van ATP (200 mM) in 96 µL van bindende buffer. De uiteindelijke concentratie van ORC-Qdot705 is 0,2 nM.
  8. Pomp 20 µL van 0,2 nM ORC-Qdot705 debiet van 10 µL/min in de cel van de stroom. Spoelen van buitensporige ORC-Qdot705 met behulp van 200 µL van bindende buffer tegen het tarief van 100 µL/min. Vervolgens pomp bindende buffer met 30 nM SYTOX oranje in de cel van de stroom aan de vlekken van DNA substraten met een snelheid van 100 µL/min.
  9. Wekken van het signaal van de705 ORC-Qdot en SYTOX oranje gekleurd DNA signaal met een 405 nm laser en 532 nm laser, respectievelijk. Observeren van de signalen gelijktijdig met 100 µL/min stroom met behulp van een Quad-band bandfilter filter (FF01-446/510/581/703-25) en het opnemen van de beelden door EM-CCD met 100 ms per frame. 20 afbeeldingsstapels verzamelen uit verschillende velden.

6. de gegevensanalyse

  1. Gewas de beelden met behulp van de Fiji-software met een nieuwe plugin, die door onszelf wordt gewijzigd op basis van de Image-plugin (OI_cut_RGBmerge), ontwikkeld door Dr. Ron Vale de lab aan de Universiteit van Californië, San Francisco.
    1. Het bijsnijden van een stapel van beelden (512 × 512 pixels) in twee stapels van beelden (256 × 256 pixels). Een is een 532 nm laser spannend resultaat, en anderzijds een 405 nm laser spannend resultaat.
  2. 61 opeenvolgende afbeeldingen met behulp van Fiji-beeld-Stacks-Z project (gemiddelde intensiteit) verwerken.
  3. De lengte van DNA (LDNA) en de afstand vanaf de site van ORC-Qdot705 (LORC) bindt DNA tot het DNA dat de maatregel vastgebonden einde handmatig.
  4. Het resultaat van LORC/lDNA berekenen met behulp van excel, analyseren van de gegevens met behulp van de bootstrap methode door R, dan maken van het histogram en passen Gaussian distributies.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te visualiseren de interactie tussen Qdot-geëtiketteerden ORC en de ARS, gebouwd we eerst de λ-ARS317 DNA substraat. Een fragment van DNA met ARS317 werd geïntegreerd in Xhoik (33,5 kb) site van inheemse λ DNA door homologe recombinatie (figuur 1A). De recombinatie product is verpakt met behulp van extracten en de verpakte phage deeltjes werden gekweekt op LB platen (figuur 1B). De positieve faag plaquette werd gescre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te zien hoe de interactie tussen het eiwit Qdot-label en het DNA van de site-specifically gemodificeerde λ met behulp van de TIRFM in een flow-cel. De noodzakelijke stappen omvatten site-specific wijziging van DNA substraat, DNA biotinylation dekglaasje aan schoonmaken en functionalization, stroom-cel voorbereiding en single-molecuul imaging. Er zijn twee cruciale aandachtspunten die dient te worden opgemerkt. Ten eerste, al de stappen met λ DNA moeten zachtjes worden gemanipuleerd om ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Hasan Yardimci en Dr.Sevim Yardimci van het Francis Crick Instituut voor soort helpen in de single-molecuul experimenten, Dr. Daniel Duzdevich van Dr. Eric C. Greene's lab van Columbia University, Dr. Yujie Sun van de Universiteit van Peking en Dr. Chunlai Chen van Tsinghua Universiteit voor nuttige discussie. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisciplinaire innovatie Team en de Newton geavanceerde Fellowship (NA140085) van de Royal Society.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Bewaar 25 μL aliquoten bij -20 ºC.
XhoI enzymThermo Fisher ScientificFD0694
Quick-fusion klonering kitBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Verpakking Extracten		EpicentreMP5110Bacterie strain LE392MP
is inbegrepen in dit pakket.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10013092Elke merk is acceptabel.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/AElke merk is acceptabel.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AElke merk is acceptabel.
NZ-amineAmrescoJ853-250G
Casamino zurenSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Magneet roer apparaatIKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf buisEppendorf3012215115 mL, steriele, bulk, 500st
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Biotinylerde primersThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reactie Buffer (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009259
Kalium hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetonThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80120891zwavelzuur
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd1001121830% Waterstofperoxide
MethanolSigma-Aldrich322415-2L
AzijnzuurSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(methoxy-polyethyleenglycol)		LysanmPEG-SVA-5000
biotin-PEG
(biotin-polyethyleenglycol)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Vacuum droogkastTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Vakuum sealerMAGIC SEALWP300
Diamant-tipped glazen schraperELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
GlijplaatSail Brand7101
Inlaat slangSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.
Uitlaat slangSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.
Dubbelzijdig plakbandSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005vijf minuten epoxy
StreptavidinSigma-AldrichS4762
Fluorescentie MicroscoopOlympusIX71
Infusie/terugtrekking
programmeerbare pomp		Harvard apparatus70-4504
532 nm laserCoherentSapphire-532-50
640 nm laserCoherentOBIS-640-100
EMCCD CameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
splitsingsoptiek		Hamamatsu photonics K.K.A12801-01
TIRF verlichtingssysteemOlympusIX2-RFAEVA2
60×TIRF objectiefOlympusAPON60XOTIRF
Quad-edge laser dichroic
beamsplitter		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Quad-band bandpass filterSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dichroic beamsplitterSemrockFF649-Di01-25x36
EmissieflitserChroma Technology CorpET585/65m
EmissieflitserChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescentie, microscoop test slide #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugaatThermo Fisher ScientificQ10163MPBewaar bij 4 ºC, niet bevriezen.
ATPAmresco0220-25GBereidt 200 mM ATP oplossing, gebruik ddH2O, pas pH aan tot 7.0, en bewaar 10 μL aliquoten bij -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GBereidt 1 M oplossing met behulp van ddH2O, en bewaar 10 μl aliquoten bij -20 ºC.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  3. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  4. Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
  5. Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
  6. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62(2014).
  7. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
  8. Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
  9. Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
  10. Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).
  11. Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
  12. Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
  13. Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
  14. Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  15. Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
  16. Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
  17. Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
  18. Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
  19. Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
  20. Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles