Methodenartikel

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

DOI:

10.3791/57971

⸱

27 juli 2018

 ,  , 
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bulk autophagy wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van grote delen van het cytoplasma in dubbele/multi-membrane structuren genoemd autophagosomes. Hier is een eenvoudig protocol volgen van dit proces beschreven. Bovendien, de typische resultaten en experimentele validatie van de methode onder autophagy-inducerende omstandigheden in verschillende soorten gekweekte zoogdiercellen worden geleverd. Tijdens bulk autophagy sekwestreren autophagosomes cytosol, en daarmee ook oplosbare cytosolische eiwitten, naast andere autophagic lading. LDH is een stabiel en zeer overvloedig, oplosbaar cytosolische enzym dat is non-selectief afgezonderd in autophagosomes. De hoeveelheid LDH sekwester weerspiegelt dan ook de hoeveelheid bulk autophagic sekwester. Efficiënt en nauwkeurig bepalen van LDH sekwester in cellen, hanteren wij een electrodisruption gebaseerde fractionering protocol dat effectief sedimentable van cytosolische LDH scheidt, gevolgd door meting van enzymatische activiteit in sedimentable breuken versus geheel-celsteekproeven. Autophagic sekwester wordt bepaald door het aantal sedimentable LDH in onbehandelde cellen uit dat in behandelde cellen af te trekken. Het voordeel van de bepaling van de sekwestratie LDH is dat het geeft een kwantitatieve meting van de autophagic sekwestratie van endogene lading, in tegenstelling tot andere methoden dat ofwel ectopische uitdrukking van sekwester sondes of semi-kwantitatieve protease betrekken de analyses van de bescherming van autophagy markeringen of receptoren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autophagy (Grieks voor "zelf eten") is een evolutionaire geconserveerde proces voor vacuolar/lysosomale afbraak van intracellulaire materiaal. Bij ontdekking van de genen autophagy-gerelateerde ("ATG"), die belangrijk voor autophagy in gist en mensen zijn, en het besef dat autophagy speelt een belangrijke rol in de menselijke gezondheid en ziekte (erkend door 2016 de Nobelprijs voor geneeskunde of fysiologie aan Yoshinori Ohsumi), autophagy snel uitgegroeid tot een van de meest intensief bestudeerde processen in1,2van de biologie van de cel.

Macroautophagy (hierna te noemen "autophagy") wordt gekenmerkt door de expansie en vouwen van intracellulaire membraan cisternae ("phagophores") in hermetisch gesloten, dubbel - of multi - membrane structuren ("autophagosomes") die effectief sekwestreren de enwrapped materiaal van de rest van het cytoplasma. Na de fusie van autophagosomes met lysosomen, is de innerlijke autophagosomal membraan de afgezonderd lading gedegradeerd en gerecycleerd. Autophagosomes kan sekwestreren cytoplasmatische materiaal in zowel willekeurige (niet-selectieve autophagy) en selectieve (selectieve autophagy) manieren. Bulk autophagy waarschijnlijk vertegenwoordigt een mix van niet-selectieve en selectieve autophagy.

In de jaren 1960 en 70 ("de morfologische tijdperk" van autophagy onderzoek), was autophagic sekwester vooral beoordeeld via ultrastructurele analyses. In de jaren 1980 en begin van de jaren 1990 ("de biochemische tijdperk") Per Seglen en medewerkers — die studeerde autophagy in primaire rat hepatocyten — de eerste methodes voor het kwantitatief meten van autophagic sekwester activiteit3ontwikkeld. Met behulp van deze tests, Seglen gedefinieerd en gekenmerkt van de verschillende stappen van de autophagic-lysosomale traject4,5, ontdekt en bedacht de amphisome6 (het product van endosome-autophagosome fusion) en was de eerste die beschrijven de rol voor Proteïne Fosforylatie in autophagy verordening7. Echter, na de ontdekking van de ATGs in de jaren 1990 ("de moleculaire tijdperk") en de eerste karakterisering van een zoogdieren ATG8 eiwit, microtubulus-geassocieerde proteïne 1A/1B-licht ketting 3 (LC3) in 20008, het gebruik van eiwitten van de ATG als markers voor de autophagic proces snel aan populariteit gewonnen en de oudere en meer moeizaam biochemische methoden werden achtergelaten. In feite, in de laatste 18 jaren, westelijke vlek en fluorescentie microscopie analyses van LC3 de veruit het meest populair zijn geworden (en in veel gevallen de enige) vervoermiddel studeren autophagy in de cellen van zoogdieren. Het voordeel is het relatieve gemak waarmee deze methoden kunnen worden uitgevoerd. Het nadeel is dat men bestudeert een kar component (LC3) in plaats van de werkelijke autophagic lading. Dit is een vrij ernstige nadeel, omdat de relatie tussen de Staten en/of flux van LC3 via het traject ten opzichte van de sekwestratie en flux van lading zeer onduidelijk is. In feite, we hebben aangetoond dat bulk cargo flux kan worden gehandhaafd op een hoog niveau in omstandigheden waar er geen LC3 flux, ondanks de aanwezigheid van geconjugeerd LC3 in de cellen9. Bovendien, we laten zien dat bulk autophagy niet wordt beïnvloed door efficiënte LC3 uitputting, en is dus waarschijnlijk LC3-onafhankelijke9. Deze bevinding is later bevestigd door LC3 knock-out studies10,11, waaruit ook blijkt dat Parkin-afhankelijke mitophagy (de selectieve autophagy mitochondria) onafhankelijk is van LC310,11 .

Kortom, er is duidelijk behoefte aan lading gebaseerde testen om autophagic activiteit te controleren. Optimaal moet deze gehaltebepalingen in grote lijnen die van toepassing zijn, duidelijk omschreven en gemakkelijk uit te voeren. De afgelopen jaren hebben wij een bijzonder belang bij het LDH sekwester assay, die werd ontwikkeld door Per Seglen in de jaren 1980-12, en is gebaseerd op de meting van de overdracht van cytosolische LDH aan sedimentable, autophagic vacuole-bevattende cel genomen breuken. LDH is een stabiele, oplosbare cytosolische eiwit dat is gemakkelijk samen afgezonderd wanneer phagophores wrap cytoplasmatische lading. Sekwestratie van LDH is daarom een algemene maatregel autophagic sekwester. LDH is uitsluitend afgebroken door de autophagic-lysosomale traject12. Dus, in het bijzijn van de lysosomale afbraak-remmers, bijvoorbeeld bafilomycin A1 (Baf)13, experimentele behandeling effecten direct bijgewerkt met de wijzigingen in autophagic sekwester activiteit. Bij gebrek aan degradatie remmers, kan het netto-effect van wijzigingen in het LDH sekwestratie en afbraak worden gemeten.

De bepaling van de sekwestratie LDH is breed toepasbare, aangezien LDH zeer en overal in alle celtypes uitgedrukt is, en LDH niveaus kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd met een enzymatische assay14,15. Echter, de oorspronkelijke protocol12 — vastgesteld in primaire rat hepatocyten — was nogal tijdrovend en vereist een hoge hoeveelheid materiaal, evenals een op maat gemaakte elektrische kwijting condensator beginnen. Op een stapsgewijze manier, hebben wij de bepaling geleidelijk omgevormd tot een gemakkelijke en veelzijdige methode. Ten eerste, was het oorspronkelijke protocol aangepast voor gebruik in zoogdiercellen lijnen16. Ten tweede, de methode was aanzienlijk radiolink3,9. Derde, verschillende stappen in het protocol werden geëlimineerd, met inbegrip van een moeizame dichtheid kussen stap17. Hierdoor tegelijkertijd een nog verdere inkrimping van de methode van het oorspronkelijke beginpunt van het gebruik van een 10 cm plaat per monster16 naar het gebruik van een enkele goed uit een plaat van de 12-well per monster (dat wil zeggen, ongeveer 15-fold minder beginnen materiaal)17. Ten vierde, we een commerciële electroporation apparaat dat zou kunnen van de op maat gemaakte elektrische kwijting condensator17 vervangenvastgesteld.

Hier wordt onze meest recente protocol van het LDH sekwester assay, waarin sommige verdere vereenvoudigingen van de methode in vergelijking met de eerder gepubliceerde17 gepresenteerd. Bovendien, een typische resultaten die zijn verkregen in een aantal verschillende soorten cellen worden weergegeven, en belangrijker, meerdere tekstregels experimentele validaties van de methode met behulp van zowel farmacologische als genetische knockdown en knock-out benaderingen worden meegeleverd. Voor een algehele regeling van de stroom van het hele protocol, Zie Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cel zaaien en behandeling

  1. Cultuur Adherente cellen in 75 cm2 weefselkweek kolven in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C, met behulp van het medium van de cultuur voor het celtype in kwestie. De cellen groeien totdat ze een in de buurt van-heuvels cellaag bereiken toestaan.
    Opmerking: Gebruik RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) voor LNCaP, HEK293, muis embryonale fibroblasten (MEFs), BJ, MCF-7 en RPE-1 cellen.
    1. Wassen van de cellen met 3 mL 37 ° C-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4. De PBS vervangen door 3 mL 0,25% (m/v) trypsine-ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) en Incubeer de kolf in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C, totdat de cellen los (2-5 min).
    2. Resuspendeer de vrijstaande cellen met 7 mL gestolde voedingsbodem met 10% FBS. Meng een hoeveelheid van 10 µL cel schorsing met 10 µL 0,4% blauw van de Trypan in een microcentrifuge buis, met behulp van een 0,5 – 20 µL pipette uiteinde. Gebruik het dezelfde pipette uiteinde te vullen onmiddellijk een dia kamer tellen en tellen van de cellen in een geautomatiseerde cel teller.
  2. Bereiden een geschikte verdunning (zie hieronder nota) van de celsuspensie van stap 1.1.2 met cultuur gemiddeld met 10% FBS, en zaad 1 mL van de verdunde celsuspensie in ieder putje van een 12-well weefselkweek plaat (oppervlakte ~3.8 cm2) met behulp van aseptische techniek. Groei in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C toestaan, totdat de gewenste celdichtheid is bereikt, bijvoorbeeld 60 – 90% samenvloeiing bij de oogst.
    Opmerking: De aangewezen verdunning van de celsuspensie krijgt de gewenste cel confluentie bij de oogst zal variëren van celtype celtype, en volgens de duur en de soort experimentele behandelingen. Dus, dit moet worden empirisch beoordeeld in elk geval.
    1. Voor experimenten die moeten worden beide behandeld en geoogst van 2 dagen na het zaaien, zaad 2.5 x 10,5 LNCaP, HEK293, of MCF-7 cellen, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ of 1.5 x 10-5 RPE-1 cellen in elk putje van de plaat 12-well.
    2. Voor cellen die losjes houden, jas u de platen met het type coating aanbevolen voor het celtype in kwestie. Gebruik platen bedekt met poly-D-lysine (PDL) voor LNCaP (en HEK293) cellen.
    3. Te dien einde 500 µL PDL op 2,5 µg Mo/mL in steriel H2O toevoegen aan elk putje en Incubeer de platen in een steriele omgeving gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C). Verwijder de PDL afzuigen en wassen elk goed kort met 1 mL steriele H2O.
      Opmerking: In het algemeen, stap 1.2.1 gebeurt zonder enige experimentele behandelingen. Het uitvoeren van RNAi, kan het wel handig om te beginnen een omgekeerde transfectie met de seeding9.
  3. Het uitvoeren van experimentele behandelingen in dubbele of drievoudige wells per voorwaarde.
    1. Bijvoorbeeld, het behandelen van de cellen met 50 nM van de mTOR-remmer Torin1, die over het algemeen is een efficiënte inductor autophagic sekwester, of onder de cellen zijn acute honger van de serum- en aminozuur door het wassen van de cellen met 1 mL aminozuur-vrije Earle is evenwichtig Zout oplossing (EBSS) medium, en vervolgens Incubeer de cellen in EBSS 1 mL in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C.
    2. Een set van putten ter vastlegging van de achtergrondniveaus van sedimentable LDH onbehandeld verlaten.
    3. Voeg een saturating hoeveelheid de post sekwester remmer bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 in de afwezigheid of de aanwezigheid van de experimentele behandelingen, 3-4 h voor cel oogst. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C.
      1. Gebruik 100 nM Baf voor LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 en RPE-1 de cellen, en 10 nM Baf voor MEFs.
      2. Voor experimentele behandelingen hebben een duur van slechts 3-4 h (zoals deze blijkt in stap 1.3.1 hebben meestal), tegelijk met de behandelingen Baf toevoegen. Wachten tot 3-4 uur vóór de oogst voor meer experimentele behandelingen, en voeg 2 µL van een 500 x geconcentreerd Baf voorraad direct in het medium.
      3. Meng door schudden van de plaat onmiddellijk na de toevoeging van Baf. Op dit punt is het ook aan te bevelen om toe te voegen macroautophagic sekwester remmers als besturingselementen, bijvoorbeeld 10 mM van de pan-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) remmer 3-methyl adenine (3MA)19of 10 µM van de selectieve PI3K klasse III remmer SAR-40520.

2. cel oogst en voorbereiding voor Electrodisruption

  1. Aan het eind van de behandelingsperiode, gecombineerd het medium afzuigen en 200 µL cell detachement oplossing (pre-water verwarmd tot 37 ° C) toe te voegen aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C, totdat de cellen los (meestal ongeveer 5 min).
    Opmerking: Overwegende dat 0,25% (m/v) trypsine-EDTA mogen worden gebruikt in plaats van de mobiele-detachement oplossing, deze laatste bevat DNase, die helpt het verminderen van de viscositeit van de vrijstaande cellen. Zo lang als het medium is grondig aanzuiging, is het niet nodig om te wassen van de cellen vóór toevoeging van trypsine-EDTA of cel detachement oplossing.
  2. Voeg 500 µL kamertemperatuur (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, met 2% (g/v) bovien serumalbumine (BSA) aan elk putje, en resuspendeer met de pipet zolang geen klontjes cel niet zichtbaar zijn. Onmiddellijk overdracht de celsuspensie 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs.
    Opmerking: Tenzij anders vermeld, uitvoeren van alle volgende stappen op het ijs.
  3. Sediment de cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  4. Grondig gecombineerd het supernatant (afzuigen) te laten de cel pellets zo droog mogelijk.
  5. Voeg 400 µL 10% (m/v) sacharose (in ultrazuiver H2O) aan elke buis.

3. plasmamembraan Electrodisruption en scheiding van Sedimentable - en totaal-cel breuken

  1. Resuspendeer de pellet van de cel met een pipet te verkrijgen van een in de omgeving van eencellige schorsing en overbrengen naar een 4 mm electroporation cuvette.
    Opmerking: Pipetting en neergaande ~ 10-15 keer, met behulp van een 100-1000 µL Pipetteer tip, is meestal voldoende.
  2. Plaats de cuvette in een exponentiële afname Golf electroporator en kwijting een enkele elektrische puls op 800 V, 25 µF en 400 Ω; deze instellingen produceren een puls van ~ 8 ms duur.
  3. Gebruik een nieuwe tip van de pipet om de cel disruptate overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 400 µL ijskoude fosfaatgebufferde sacharoseoplossing (100 mM natrium monofosfaat, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA en 1,75% sucrose, pH 7.5) en meng kort door pipetteren.
    1. Optioneel: Controleer of efficiënte plasmamembraan electrodisruption17, meng 10 µL van de disruptate van de verdunde cel uit stap 3.3 met 10 µL 0,4% Trypan blauw in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Overbrengen naar een tellen kamer en controleer of het percentage Trypan blauw positieve cellen > 99%.
      1. Laat het monster in het tellen kamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C), en controleer dat het percentage Trypan blauw positieve cellen gebleven > 99%.
    2. Optioneel: Om te controleren dat de electrodisruption niet te hard is geweest, dat wil zeggen, het heeft niet verstoord intracellulaire organellen, voert u stappen 1.1 – 3.3 zoals hierboven beschreven, maar gebruiken een grotere grondstof (een goed uit een 6-well-plaat met een confluente cellaag van ~ 80%), en gebruik 150 µL 10 gewichtspercenten sacharose in stap 2.5 en 150 µL fosfaatgebufferde sacharoseoplossing zonder DTT in stap 3.3.
      1. Gebruik een pipet aan zorgvuldig laag 200 µL van de verdunde cel disruptate oplossing op de top van een 1.2 mL dichtheid-kussen van fosfaatgebufferde 8% (m/v) dichtheid kleurovergang medium (bijvoorbeeld8% Nycodenz, 50 mM natriumfosfaat, 2,2% sucrose, 1 mM EDTA) in een centrifuge 2 mL buis. Centrifugeer bij 20.000 x g voor 45 min bij 4 ° C in een microcentrifuge met zachte-mode functie (voor zachte versnelling en vertraging), en zorgvuldig zet de buizen op ijs.
      2. Verwijder voorzichtig 60 µL van de ~ 200 µL top breuk, om ervoor te zorgen niet te halen een kleurovergang middellange oplossing dichtheid, en overbrengen naar een verse microcentrifuge buis.
        Opmerking: Dit moet bevatten cytosol van uitzonderlijke zuiverheid, genoemd "cel sap"21.
      3. Test de zuiverheid van de breuk in de bovenstaande stap, verkregen door het uitvoeren van analyses van de westelijke vlek van organel-bevat eiwitten, met behulp van standaard technieken en 4 – 20% kleurovergang gels16.
      4. Uitvoeren bijvoorbeeld immunoblotting voor cathepsin B21, cytochroom c, en eiwit dissulfide isomerase, om te verifiëren dat de elektrische schok in stap 3.2 heeft niet verstoord lysosomen en mitochondriën, endoplasmatisch reticulum, respectievelijk, en immunoblot voor LDH om te controleren of de aanwezigheid van een cytosolische eiwit in het sap van de cel.
      5. Uitvoeren in parallel, immunoblotting op eiwithoudende extracten gemaakt van de cel Totaal disruptate oplossing16 om te bevestigen dat de antilichamen die gebruikt het organel-bevat eiwitten die zijn onderzocht kunnen detecteren.
  4. Herhaal stap 3.1-3.3 voor elk monster.
  5. Verwijderen van 550 µL van elke oplossing van verdunde cel disruptate (verkregen bij stap 3.3) 2 mL microcentrifuge buizen met 900 µL ijskoude resuspensie buffer (50 mM natrium monofosfaat, 1 mM DTT, 1 mM EDTA en 5,9% sucrose, pH 7.5) aangevuld met 0,5% BSA en 0,01% Tween-20 en mix kort door pipetteren.
  6. Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 45 min bij 4 ° C tot pellets die bevat "gesedimenteerd LDH". Grondig gecombineerd het supernatant (afzuigen) te laten de korrels zo droog mogelijk. Leg de monsters in een vriezer-80 ° C.
  7. 150 µL van elke oplossing van verdunde cel disruptate (verkregen bij stap 3.3) overbrengen naar nieuwe buizen, en plaats de monsters in een vriezer-80 ° C. Gebruik deze voorbeelden om de "totale LDH" niveaus in de cellen.
    Opmerking: Op dit punt het experiment kan worden onderbroken voor zo lang als gewenst.

4. LDH extractie en meting van LDH enzymatische activiteit

  1. Ontdooi de "gesedimenteerd LDH" (uit stap 3.6) en de "total LDH" monsters (uit stap 3.7) op ijs.
  2. Voeg 300 µL van ijskoude resuspensie buffer met 1,5% Triton X-405 tot de "totale LDH" monsters (opbrengst een eindconcentratie van de Triton X-405 van 1%). De monsters op een roller in een koude kamer (4-8 ° C) gedurende 30 minuten draaien.
  3. Voeg 750 µL van ijskoude resuspensie buffer met 1% Triton X-405 tot de "gesedimenteerd LDH" monsters en resuspendeer de pellets met een pipet totdat een homogene oplossing is gevonden.
  4. Centrifugeer de monsters uit stap 4.2 en 4.3 bij 18.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C naar sediment onopgeloste cellulaire puin.
  5. Mix 4 delen van koude 65 mM imidazool (pH 7.5)/0.75 mM pyruvaat met een deel van koude 65 mM imidazool (pH 7.5) / 1,8 mM NADH te verkrijgen van een werkoplossing die is stabiel gedurende ten minste drie weken bij 4 ° C.
  6. Meng 3 – 30 µL van het supernatant uit stap 4.4 met 200 µL van de werkoplossing stap 4.5.
  7. De hoeveelheid LDH bepalen door het meten van LDH enzymatische activiteit als de daling in nicotinamide adenine dinucleotide (gereduceerde vorm) (NADH) absorptie bij 340 nm bij 37 ° C in vergelijking met een standaard met een bekende concentratie van LDH. Extinctie metingen uit te voeren tot de reactie heeft benaderd voltooiing, d.w.z. tot de absorptie bij 340 nm niet langer verandert met de tijd.
    Opmerking: Dit is de klassieke biochemische methode voor het meten van LDH activiteit. Hoewel het huidige protocol de reactie bij 37 ° C voert, kan het ook worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 ° C), die is aan te raden als het doen van handmatige spectrofotometrie. Het huidige protocol gebruikt een robotachtige multianalyzer instrument, die op een geautomatiseerde wijze mengt monsters met werkoplossing in een 96-wells-plaat, maatregelen de absorptie bij 340 nm bij 37 ° C elke 20 s gedurende 3 minuten. Daarna de instrument software berekent de concentratie van LDH, uitgedrukt als Units (U) / L, door het vergelijken van de helling van de extinctie metingen na verloop van tijd in vergelijking met een standaard curve verkregen door kalibratie met een norm van bekende LDH concentratie. Het lineaire bereik van detectie door deze aanpak is 30 – 1.500 U/L. Als alternatief, een breed scala aan commercieel beschikbare kits voor het meten van LDH bestaan. Sommigen van hen zijn gebaseerd op de koppeling van de enzymatische reactie op de generatie van colorimetrische of TL producten, detectie inschakelen door andere middelen dan UV-spectrofotometrie, en met andere lineaire bereiken van detectie.

5. berekening van LDH Sequestration

  1. Bereken het percentage van gesedimenteerd LDH aan totale LDH voor elk monster, nemen de verdunningen en bemonstering rekening:
    Gesedimenteerd LDH (%) =figure-protocol-1
    Opmerking: Tijdens stappen 3.1-3.3 ongeveer 50 µL is verloren als gevolg van overdracht naar en vanuit de electroporation cuvette. Dus, uit een totaal van 750 µL (in plaats van 800 µL) berekenen van verdunde cel disruptate in stap 3.3.
  2. Het percentage van de gesedimenteerd LDH verkregen in de monsters van onbehandelde cellen (stap 1.3.2) uit het percentage van de gesedimenteerd LDH verkregen in monsters van experimenteel behandelde cellen en kloof door de behandeltijd met Baf te verkrijgen van het percentage aftrekken afgezonderd LDH per uur gedurende de bemonstering:
    Afgezonderd LDH (% / h) =figure-protocol-2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het protocol beschreven hier, bulk autophagic sekwester activiteit in een aantal verschillende zoogdieren cellijnen, met inbegrip van LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, muis embryonale fibroblasten (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ en LNCaP cellen werd gemeten. Sekwester was beoordeeld onder basale omstandigheden (in volledige voedselrijke medium), of in cellen acuut uitgehongerd voor serum en aminozuren (een bona fide autoph...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kortom vertegenwoordigt het protocol beschreven hier een betrouwbare en breed toepasbaar methode om bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen te controleren. Vergeleken met de oorspronkelijke methode12,16, hebben we een aantal onnodige stappen verwijderd, vereenvoudigd verscheidene van de resterende stappen en introduceerde een aanzienlijke inkrimping. Dientengevolge, het protocol is sterk verbeterd ten opzichte van kosten - en tijd-efficiëntie, en d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflict van belang.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel ondersteund door de Raad onderzoek van Noorwegen, de Universiteit van Oslo, de Anders Jahre Foundation, de Nansen-Stichting en de erfenis in het geheugen van Henrik Homan. Wij danken Dr. Noboru Mizushima voor de ATG5 +/ + MEFs en ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu voor de ATG7 +/ + MEFs en ATG7-/-MEFs en Dr. Shizuo Akira voor het ATG9A +/ + MEFs en ATG9A-/-MEFs. Wij bedanken Frank Sætre voor technische bijstand, en Dr. Per O. Seglen voor constructieve methodologische discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes Eppendorf211-2130 and 211-2120
12-well plates Falcon353043
Accumax  cell detachment solutionInnovative Cell TechnologiesA7089Bewaar aliquoten jarenlang op -20 °C, en in de koelkast enkele maanden
Bafilomycin A1EnzoBML-CM110-0100Oplossen in DMSO
BJ cellsATCCCRL-2522gebruik bij passage <30
Bovine serum albumin (BSA)VWR422361V
Burker counting chamberFisher Scientific139-658585
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermoFisher ScientficC10228
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher ScientficAMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamberFisher Scientific139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Earle's balanced salt solution (EBSS)Gibco24010-043bevat 0,1% glucose
EDTASigma-AldrichE7889
Electroporation cuvette (4 mm)Bio-Rad1652088
Exponential decay wave electroporatorBTX Harvard Apparatus EMC 630
Fetal bovine serum (FBS)SigmaF752410% eindconcentratie in RPMI 1640 medium
HEK293 cellsATCCCRL-1573
ImidazoleSigma-Aldrich56750Steriliseer een 65 mM-oplossing en bewaar in de koelkast voor maanden
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubatorNuAireNU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher13778150
LNCaP cellsATCCCRL-1740gebruik bij passage <30
3-Methyl Adenine (3MA)Sigma-AldrichM9281Maak een 100 mM-stockoplossing in RPMI bij -20 °C.  Verwarm de stockoplossing gedurende 10 min. op 65 °C, en gebruik bij een 10 mM-eindconcentratie
Refridgerated MicrocentrifugeBeckman Coulter Life Sciences368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode functionEppendorf Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi)Sigma-AldrichSML0702Remt de ULK-kinaseactiviteit. Oplossen in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrumentErba DiagnosticsPL-II
MCF7 cellsATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL)VWR732-2223Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL)VWR732-2207 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL)VWR732-2355 Thermo Fischer ART Barrier tips
PipettesThermoFisher4701070Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407-10X5MGMaak een 1 mg/mL-stockoplossing in steriel H2O. Deze oplossing is stabiel bij -20 °C gedurende ten minste 1 jaar.
PyruvateMerck-Millipore1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883Remt phosphoinositide 3-kinase klasse III (PIK3C3). Oplossen in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)ThermoFisher/Ambions35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)ThermoFisher/Ambions18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)ThermoFisher/Ambions15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) Prolabo28014.291
SucroseVWR443816T10% eindconcentratie in water; filter door een 0,45 µm-filter en bewaar in de koelkast voor maanden
Thapsigargin

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836(2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fractionering door elektrodisruptiesedimenteerbare LDH metingvorming van autofagosomencelkweekprotocolbehandeling met Bafilomycine A1ATG gen knock outLDH enzymatische assaymethode voor monitoring van autofagie

Gerelateerde artikelen