De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

Summary

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

Abstract

Bulk autophagy wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van grote delen van het cytoplasma in dubbele/multi-membrane structuren genoemd autophagosomes. Hier is een eenvoudig protocol volgen van dit proces beschreven. Bovendien, de typische resultaten en experimentele validatie van de methode onder autophagy-inducerende omstandigheden in verschillende soorten gekweekte zoogdiercellen worden geleverd. Tijdens bulk autophagy sekwestreren autophagosomes cytosol, en daarmee ook oplosbare cytosolische eiwitten, naast andere autophagic lading. LDH is een stabiel en zeer overvloedig, oplosbaar cytosolische enzym dat is non-selectief afgezonderd in autophagosomes. De hoeveelheid LDH sekwester weerspiegelt dan ook de hoeveelheid bulk autophagic sekwester. Efficiënt en nauwkeurig bepalen van LDH sekwester in cellen, hanteren wij een electrodisruption gebaseerde fractionering protocol dat effectief sedimentable van cytosolische LDH scheidt, gevolgd door meting van enzymatische activiteit in sedimentable breuken versus geheel-celsteekproeven. Autophagic sekwester wordt bepaald door het aantal sedimentable LDH in onbehandelde cellen uit dat in behandelde cellen af te trekken. Het voordeel van de bepaling van de sekwestratie LDH is dat het geeft een kwantitatieve meting van de autophagic sekwestratie van endogene lading, in tegenstelling tot andere methoden dat ofwel ectopische uitdrukking van sekwester sondes of semi-kwantitatieve protease betrekken de analyses van de bescherming van autophagy markeringen of receptoren.

Introduction

Autophagy (Grieks voor "zelf eten") is een evolutionaire geconserveerde proces voor vacuolar/lysosomale afbraak van intracellulaire materiaal. Bij ontdekking van de genen autophagy-gerelateerde ("ATG"), die belangrijk voor autophagy in gist en mensen zijn, en het besef dat autophagy speelt een belangrijke rol in de menselijke gezondheid en ziekte (erkend door 2016 de Nobelprijs voor geneeskunde of fysiologie aan Yoshinori Ohsumi), autophagy snel uitgegroeid tot een van de meest intensief bestudeerde processen in^1,2van de biologie van de cel.

Macroautophagy (hierna te noemen "autopha....

Protocol

1. cel zaaien en behandeling

1. Cultuur Adherente cellen in 75 cm² weefselkweek kolven in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 ° C, met behulp van het medium van de cultuur voor het celtype in kwestie. De cellen groeien totdat ze een in de buurt van-heuvels cellaag bereiken toestaan.
   Opmerking: Gebruik RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) voor LNCaP, HEK293, muis embryonale fibroblasten (MEFs), BJ, MCF-7 en RPE-1 cellen.
   1. Wassen van de cellen met 3 mL 37 ° C-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4. De PBS vervangen door 3 mL 0,25% (m/v) trypsine-ethyleendiaminetetraacetaat (E....

Results

Met behulp van het protocol beschreven hier, bulk autophagic sekwester activiteit in een aantal verschillende zoogdieren cellijnen, met inbegrip van LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, muis embryonale fibroblasten (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ en LNCaP cellen werd gemeten. Sekwester was beoordeeld onder basale omstandigheden (in volledige voedselrijke medium), of in cellen acuut uitgehongerd voor serum en aminozuren (een bona fide autoph.......

Discussion

Kortom vertegenwoordigt het protocol beschreven hier een betrouwbare en breed toepasbaar methode om bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen te controleren. Vergeleken met de oorspronkelijke methode^12,16, hebben we een aantal onnodige stappen verwijderd, vereenvoudigd verscheidene van de resterende stappen en introduceerde een aanzienlijke inkrimping. Dientengevolge, het protocol is sterk verbeterd ten opzichte van kosten - en tijd-efficiëntie, en d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	211-2130 and 211-2120
12-well plates	Falcon	353043
Accumax  cell detachment solution	Innovative Cell Technologies	A7089	Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1	Enzo	BML-CM110-0100	Dissolve in DMSO
BJ cells	ATCC	CRL-2522	use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA)	VWR	422361V
Burker counting chamber	Fisher Scientific	139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientfic	C10228
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber	Fisher Scientific	139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad	3450034
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS)	Gibco	24010-043	conatains 0.1% glucose
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Electroporation cuvette (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Exponential decay wave electroporator	BTX Harvard Apparatus	EMC 630
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F7524	10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells	ATCC	CRL-1573
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator	NuAire	NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher	13778150
LNCaP cells	ATCC	CRL-1740	use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge	Beckman Coulter Life Sciences	368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 hydrochloride (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument	Erba Diagnostics	PL-II
MCF7 cells	ATCC	HTB-22
NADH	Merck-Millipore	1.24644.001
Nycodenz	Axis-Shield	1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher	31985062
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL)	VWR	732-2223	Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL)	VWR	732-2207	Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL)	VWR	732-2355	Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate	Merck-Millipore	1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )	Prolabo	28014.291
Sucrose	VWR	443816T	10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% final
Trypan Blue stain 0.4%	Molecular Probes	T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)	Gibco	25200-056
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287	0.01% final