Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57982

⸱

22 oktober 2018

 , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Samenvatting

Global gebreken in RNA polymerase II transcriptie kunnen worden overzien door transcriptomic studies analyseren steady-state RNA. Inderdaad, de globale daling in mRNA-synthese is aangetoond te worden gecompenseerd door een gelijktijdige afname van de aantasting van het mRNA om te herstellen van de normale niveaus van de stationaire toestand. De genoom-brede kwantificering van mRNA-synthese, onafhankelijk van mRNA verval, is dus de beste directe reflectie van RNA polymerase II transcriptionele activiteit. Hier bespreken we een methode met behulp geen storing veroorzaakt metabole labeling van ontluikende RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In het bijzonder de cellen worden gekweekt voor 6 min met een uracil analoge 4-thiouracil en de gelabelde nieuw getranscribeerde RNAs worden gezuiverd en gekwantificeerd om te bepalen van de tarieven van de synthese van alle individuele mRNA. Bovendien, met behulp van label Schizosaccharomyces pombe cellen als interne standaard dit toelaat vergelijken van mRNA-synthese in verschillende S. cerevisiae stammen. Met behulp van dit protocol en de gegevens met een dynamisch kinetische model passend, kunnen de bijbehorende mRNA verval tarieven worden bepaald.

Inleiding

Cellen reageren op signalen van endogene en exogene, via de dynamische wijziging van hun gen expressie programma. In de afgelopen jaren kunt een enorme ontwikkeling van genoom-brede methodologieën de nauwkeurige en uitgebreide beschrijving van transcriptome wijzigingen in verschillende omstandigheden. In de meeste studies van de transcriptomic, microarray kruising of high-throughput sequencing worden gebruikt om RNA niveaus van een totale breuk van de stationaire toestand RNA te kwantificeren. Transcriptionele wijzigingen onder een specifieke perturbation kunnen een breed scala van mogelijke uitkomsten, met specifiek gen expressie veranderingen of een groot spectrum van genen up - of werden weergegeven. Genexpressie is het resultaat van een verfijnd evenwicht — of stationaire toestand — tussen RNA synthese van RNA polymerase en andere processen op het gebied van RNA niveaus. RNA polymerase II transcriptie, met inbegrip van haar drie verschillende fasen (initiatie, rek, en beëindiging), is zeer en ingewikkeld gekoppeld mRNA verwerking, cytoplasmatische export, vertaling en afbraak.

Verscheidene recente studies aangetoond dat mRNAs synthese en verval gekoppelde mechanismen en toonde dat transcriptionele effecten bij mutatie of onder prikkels worden over het hoofd gezien kunnen wanneer de totale steady-state RNA te kwantificeren. Ten eerste hangt de detectie van transcriptionele veranderingen door de analyses van de stationaire toestand niveaus van mRNA altijd mRNAs half-life. Zodra de verstoring wordt ingevoerd, zal de steady-state niveaus van mRNAs met lange halfwaardetijd veel minder dan die van mRNAs met korte halfwaardetijd worden beïnvloed. De detecteerbaarheid van de veranderingen in RNA-synthese is daarom sterk bevooroordeeld ten gunste van kortstondige afschriften, terwijl de analyse van langduriger mRNA soorten mislukken te onthullen van dynamische veranderingen in de transcriptie tarief. Ten tweede, verschillende rapporten is gebleken dat zowel in gist en zoogdieren, mondiale veranderingen in de transcriptie worden over het hoofd gezien kunnen bij het analyseren van de niveaus van de stationaire toestand van mRNA. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de mechanismen die link mRNA-synthese en degradatie resulterend in mRNA bufferen. Dit leidde tot de ontwikkeling van nieuwe protocollen te kwantificeren van mRNA-synthese rekken van degradatie, door de analyse van nieuwe getranscribeerde mRNA. In de afgelopen jaren zijn diverse alternatieven ingediend, met inbegrip van mondiale run-on sequencing (GRO-seq)1en inheemse rek transcript sequencing (NET-seq)2,3. Hier, presenteren we een protocol oorspronkelijk is ontwikkeld in zoogdiercellen4,5,6 en vervolgens aangepast aan gist7,8,9,10, 11, die is gebaseerd op RNA labelen met een thiolated nucleoside of base analoog, 4-thiouridine (4sU) of 4-thiouracil (4tU), respectievelijk.

Deze methode specifiek zuivert nieuw getranscribeerde RNA van cellen in welke RNA zijn pols-aangeduid met 4sU met vrijwel geen inmenging in de homeostase van de cel. Zodra de cellen worden blootgesteld aan 4sU, is het molecuul dus snel uptaken, phosphorylated aan 4sU-trifosfaat, en opgenomen in de RNAs wordt getranscribeerd. Als puls-label, is het mogelijk om uit te pakken van totale cellulaire RNA (overeenkomend met de steady-state niveaus van RNA) en vervolgens de 4sU-geëtiketteerden RNA breuk thiol-specifiek is gewijzigd, wat leidt tot de vorming van een Zwavelbrug tussen Biotine en de nieuw Getranscribeerd RNA4,5. 4sU kunnen echter alleen uptaken door de uiting van een nucleoside-vervoerder, zoals de menselijke equilibrative nucleoside vervoerder (hENT1), voorkomen van het directe gebruik ervan in de ontluikende of kernsplijting gist cellen. Terwijl men kon hENT1 S. pombe of S. cerevisiaeexpress, kan een eenvoudiger aanpak worden bereikt met behulp van de gewijzigde basis 4tU, aangezien de gistcellen kunnen duren van 4tU, zonder de behoefte aan expressie van een nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. In feite, het metabolisme van 4tU de activiteit van het enzym uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) vereist. In verschillende organismen, met inbegrip van gist maar niet zoogdieren, is UPRT essentieel voor een pyrimidine berging traject, uracil aan uridine monofosfaat recycling.

Een belangrijke vertekening in transcriptomic studies kan worden ingevoerd door de normalisatie tussen verschillende monsters geanalyseerd in parallel. Inderdaad, de vele afwijkende factoren kunnen invloed hebben op de vergelijkende analyse van de transcriptome van mutant en wild-type stammen: de efficiency van lysis van de cel, verschillen in de extractie en het herstel van RNA, en afwijkingen in de kalibratie van de scanner voor microarray analyse , onder anderen. Zoals hierboven besproken, kunnen dergelijke variaties vooral misleidend zijn als globale effecten op RNA polymerase II transcriptie worden verwacht. Een elegante betekenen voor het nauwkeurig vergelijken van mRNA synthese tarieven tussen de verschillende monsters werd ontworpen met behulp van de verte verwante kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe als een interne standaard. Daarvoor een vast aantal label S. pombe cellen wordt toegevoegd aan de S. cerevisiae monsters, wild-type of gemuteerde cellen, voorafgaand aan cellysis en RNA extractie10. Vervolgens worden zowel stationaire als nieuw samengestelde RNAs van S. pombe en S. cerevisiae gekwantificeerd door RT-qPCR of via het gebruik van spaanders microarray of high-throughput sequencing10. Het combineren van deze gegevens met kinetische modellering, kan absolute van mRNA-synthese en verval in de ontluikende gist worden gemeten.

In het kader van dit manuscript, zullen we laten zien hoe de analyse van nieuwe getranscribeerde RNA toegestaan te onthullen van een mondiale rol voor de coactivator complexen SAGA en TFIID in RNA polymerase II transcriptie in ontluikende14,15gist, 16. Bovenal afgelopen studies gekwantificeerd steady-state mRNA niveaus in S. cerevisiae en gesuggereerd dat SAGA speelt een overheersende functie op een beperkt aantal gist genen die sterk beïnvloed door mutaties in SAGA, maar relatief resistent tegen TFIID mutaties17,18,19. Verrassend, werden de SAGA enzymatische activiteiten getoond om op te treden op het hele getranscribeerde genoom, suggereren een bredere rol voor deze co activator in RNA polymerase II transcriptie. Verminderde RNA polymerase II recruitment meest uitgedrukte genen werd waargenomen op de inactivering van SAGA of TFIID, suggereren dat deze coactivators samen op de meeste genen werken. Vandaar, de kwantificering van nieuw getranscribeerde mRNA geopenbaard dat SAGA en TFIID nodig voor de transcriptie van bijna alle genen door RNA polymerase II14,15,16 zijn. De toepassing van compenserende mechanismen komt naar voren als een manier voor de cellen om te gaan met een algemene afname van de mRNA-synthese die door een gelijktijdige wereldwijde afname van de aantasting van het mRNA is gebufferd. SAGA toegevoegd aan de lijst van factoren die een globaal effect op RNA polymerase II transcriptie, zoals RNA Pol II subeenheden10, de bemiddelaar coactivator complexe20, de algemene transcriptie factor TFIIH21,22 , en indirect, elementen van de mRNA afbraak machines9,10,23. Dergelijke compenserende evenementen werden universeel waargenomen in SAGA mutanten, administratieve verwerking van de bescheiden en beperkte veranderingen in stationaire toestand mRNA niveaus ondanks een globale en ernstige daling in mRNA synthese14. Soortgelijke analyses werden ook uitgevoerd in een BRE1 schrapping stam, wat resulteert in een volledig verlies van Histon H2B ubiquitination. Interessant is dat kon een veel mildere maar consistent globaal effect op RNA polymerase II transcriptie worden opgespoord in de afwezigheid van Bre1, die aangeeft dat metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA in gist kan detecteren en kwantificeren van een breed scala van veranderingen in mRNA synthese tarieven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. cel kweken en Rapamycin uitputting van een Subunit SAGA

  1. Voor elke S. cerevisiae stam en repliceren enten met inbegrip van wild-type of control stammen, een één kolonie van een verse plaat op 5 mL van YPD medium (2% pepton, gistextract 1% en 2% glucose).
  2. S. cerevisiae cellen 's nachts bij 30 ° C met constante agitatie (150 rpm) groeien.
  3. Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) en Verdun de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 100 mL van YPD medium en laten groeien tot de OD600 rond 0,8 is.
  4. Parallel, enten een één kolonie van S. pombe cellen uit een verse plaat op 50 mL van Ja medium (0,5% gistextract; 250 mg/L adenine, histidine, uracil, leucine en lysine; 3% glucose) en groeien de cellen 's nachts bij 32 ° C, met constante agitatie (150 rpm).
  5. Meten van de OD600 van de S. pombe overnachting cultuur en verdunnen van de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 500 mL ja voedingsbodem en laten groeien tot de OD600 ongeveer is 0,8.
  6. Voor elke S. cerevisiae anker-away stam en repliceren enten met inbegrip van wild-type of control stammen, een één kolonie van een verse plaat op 5 mL van YPD medium (2% pepton, gistextract 1% en 2% glucose).
  7. Groeien de cellen 's nachts bij 30 ° C met constante agitatie (150 rpm).
  8. De volgende ochtend, meten van de OD600, Verdun de cultuur op een600 van de OD van ongeveer 0.1 in 100 mL van YPD medium en laten groeien tot de OD600≈ 0.8.
  9. Voeg 100 µL van rapamycin aan de cultuur van een stamoplossing van 1 mg/mL (laatste rapamycin concentratie 1 µg/ml) en laat de cellen Incubeer bij 30 ° C met constante agitatie voor de tijd die nodig is voor de proteïne van belang worden voorwaardelijk uitgeput van de nucleus ( 30 min is meestal voldoende). Voor het besturingselement, gebruiken een soortgelijke gist-cultuur, maar in plaats van toe te voegen rapamycin, voeg de gelijkwaardige hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO).

2. 4tU labelen met S. pombe als een Spike (Counting)

  1. Bereid een verse oplossing van 2 M 4-thiouracil. Zodra voorbereid, houd het op kamertemperatuur en weg van licht.
    1. Nauwkeurig wegen 64.1 mg 4-thiouracil voor elke cultuur S. cerevisiae en los het dan op in 250 µL van dimethylformamide (DMF) of 250 µL van DMSO.
    2. Voor de cultuur van de S. pombe moet worden gebruikt als spike, weeg 320.5 mg 4-thiouracil en los het in 1250 µL van DMSO.
  2. De 4-thiouracil-oplossing toevoegen aan S. cerevisiae en S. pombe culturen voor een eindconcentratie van 5 mM en uit te broeden ze voor 6 min met constante agitatie bij 30 ° C en 32 ° C, respectievelijk.
  3. Verwijder na 6 min, een kleine hoeveelheid van elke cultuur voor het tellen van de cel. Met behulp van een automatische cel teller of een kamer Neubauer cellen tellen.
  4. Verzamelen van de cellen door middel van centrifugeren (2.500 x g) gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  5. Verwijder het supernatant, wassen van de cellen met ijskoude 1 x PBS en centrifuge opnieuw (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Bereken het totale aantal cellen in elk van de monsters S. cerevisiae en S. pombe .
  7. Resuspendeer de cellen in 5 mL ijskoud 1 x PBS en S. cerevisiae meng met S. pombe cellen met een 3:1 verhouding.
  8. Centrifugeer de cellen (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), verwijderen de PBS, flash-freeze de cellen in vloeibare N2en bewaren van het monster bij-80 ° C tot verder gebruik.

3. RNA extractie en DNase behandeling

  1. Ontdooi de cellen op het ijs voor ongeveer 20-30 min.
  2. Ga verder met de RNA extractie met behulp van een gist-RNA extractie kit (Tabel of Materials) met een paar aanpassingen.
  3. Per elk monster, giet u 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen in een buis van de 1.5-mL schroefdop die bij de kit geleverd. Houd in gedachten dat per elke buis, RNA van maximaal 109 cellen efficiënt kan worden geëxtraheerd. Daarom bereid het aantal buisjes nodig voor elk monster. Bijvoorbeeld, een cultuur van S. cerevisiae van 100 mL (OD600≈ 0.8) kan ertoe leiden dat ongeveer 2 x 10,9 tot en met 3 x 109 cellen, aanloop naar een totaal van 2,7 x 109 tot en met 4 x 109 cellen in totaal (na de piek-in met een derde van de S. pombe cellen). In dit geval zou maximaal 3-4 reactie buizen per elk monster/conditie/mutant/repliceren nodig.
  4. Per elke 1 x 109 cellen, 480 µL van de lysis-buffermengsel voorzien van de kit, 48 µL van 10% SDS en 480 µL van fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, v/v/v) toevoegen.
  5. Meng de cellen met behulp van een vortex-mixer en hen overbrengen in de buizen met de ijskoude Zirkonia kralen.
  6. Geschikt voor de buizen op een vortex-mixer adapter, draai de vortex op maximale snelheid en verslaan voor 10 min Lyse de gistcellen (in een kamer bij 4 ° C). Als alternatief, voer lysis van de cellen in een automatische kraal-beater.
  7. Centrifugeer buizen bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zorgvuldig verzamelen de bovenste fase (RNA-bevattende) voor een tube van de falcon vers 15 mL. Het volume per elke buis hersteld is meestal rond 500-600 µL.
  8. Toevoegen aan de 15 mL tubes met de gedeeltelijk gezuiverde RNA, de bindende buffer voorzien van de kit en meng grondig. Per elke 100 µL van RNA oplossing, Voeg 350 µL van bindende buffer (dat wil zeggen, wanneer het volume van de waterfase oplossing 600 µL, 2.1 mL van de buffer bindend is moeten worden toegevoegd).
  9. Aan het voorgaande mengsel, het toevoegen van de 100% ethanol en meng. Per elke 100 µL van RNA oplossing, voeg 235 µL van 100% ethanol (dat wil zeggen, wanneer het volume van de waterfase oplossing is 600 µL, 1.41 mL ethanol toevoegen).
  10. Breng maximaal 700 µL van het mengsel uit stap 3.9 een filterpatroon geassembleerd in een collectie buis, beide voorzien van de kit.
  11. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 16.000 x g. Als het centrifugeren duur niet genoeg voor het totale volume was aan het filter passeren, herhaalt u het centrifugeren voor 30 s.
  12. Negeren de doorstroming en hergebruiken van de dezelfde collectie buis. Voeg een andere 700 µL van RNA-bindende buffer-ethanol oplossing aan de filter en centrifuge weer bij 16.000 x g voor 1 min.
  13. Negeren de doorstroming en herhaal stap 3.11 en 3.12 totdat de RNA-oplossing is voltooid.
  14. Was het filter 2 x met 700 µL oplossing 1 te wassen. Verzamel oplossing via centrifugeren in de wasmachine bij 16.000 x g gedurende 1 minuut en houd altijd de collectie buis.
  15. Was het filter 2 x met 500 µL oplossing 2 te wassen. Verzamel oplossing via centrifugeren in de wasmachine bij 16.000 x g gedurende 1 minuut en houd altijd de collectie buis.
  16. Centrifugeer de buizen nogmaals bij 16.000 x g gedurende 1 minuut volledig drogen het filter.
  17. Het filterelement overbrengen in de laatste collectie buis (RNA-geschikte buis) en elueer RNA met 50 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O (voorverwarmd tot 100 ° C).
  18. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 16.000 x g.
  19. Elueer RNA weer (aan de dezelfde buis) met 50 µL voorverwarmde DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O. ervoor dat al het volume heeft doorgegeven door het filter; anders, Centrifugeer gedurende langere periodes.
  20. Als meerdere buizen voor één enkel monster worden gebruikt, bundelen ze allemaal in één buis.
  21. Kwantificeren en controleer de zuiverheid van het monster met behulp van de juiste apparatuur.
    Opmerking: Terwijl 4tU alleen in nieuw samengestelde RNA opgenomen is, is er een kans van secundaire besmetting met DNA. Om die reden, het is altijd aan te raden voor de behandeling van de monsters met DNase ik. Gebruik daarvoor de reagentia voorzien van de RNA-extractie kit (Tabel of Materials) na de aanbevelingen van de fabrikant.

4. thiol-specifieke Biotinylation van nieuw samengestelde RNA

  1. Aanpassen van de concentratie van het RNA verkregen met punt 3 van het protocol tot 2 mg/mL. Aliquoot 200 µg totaal RNA, het gedurende 10 minuten bij 60 ° C verwarmen en koelen het onmiddellijk op het ijs gedurende 2 minuten.
  2. Toevoegen aan het RNA afgepipetteerde deel, de reagentia die hieronder vermeld in de volgende volgorde: 600 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O, 100 µL van biotinylation buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] en 10 mM EDTA, DEPC-op dezelfde manier afgehandeld, RNase-vrije H2O), en 200 µL van Biotine-HPDP uit een voorraad van 1 mg/mL Biotine-HPDP in DMSO of DMF.
    1. In sommige situaties neiging de Biotine-HPDP-oplossing te precipiteren, waarschijnlijk als gevolg van zijn lage oplosbaarheid in water. In deze situatie, Verhoog het volume van DMSO/DMF tot 40% van het volume van de reactie (aan het RNA-monster, toevoegen 400 µL van DEPC-behandelde H2O, 100 µL biotinylation buffer en 400 µL van biotine-HPDP uit een voorraad van 0,5 mg/mL).
  3. Incubeer het monster bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht voor 3 h, met zachte agitatie.
  4. Na incubatie, toevoegen van een ongeveer gelijke volume van chloroform om de buizen en krachtig mengen.
  5. Draai het monster bij 13.000 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C. Deze stap kan het verwijderen van overtollige Biotine dat deed niet biotinylate de RNA. Als alternatief, voer deze stap met behulp van fase-lock buizen (zware). Daarvoor, spin down de fase-lock buizen voor 1 min bij 13.000 x g, voeg het mengsel van RNA en een gelijke hoeveelheid van chloroform, meng ze krachtig en centrifugeer ze bij 13.000 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
  6. Breng zorgvuldig de bovenste fase in nieuwe 2 mL buizen.
  7. Voeg een tiende van het volume van 5 M NaCl en meng van het monster.
  8. Voeg een gelijke hoeveelheid isopropanol toe, meng het monster en draai het bij 13.000 x g gedurende ten minste 30 minuten, bij 4 ° C.
  9. Voeg voorzichtig het supernatant verwijderen en voeg 1 mL ijskoud 75% ethanol.
  10. Draaien op 13.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C.
  11. Zorgvuldig Verwijder supernatant, quick-spin de buis, en de resterende ethanol-oplossing. Zorg ervoor dat de RNA-pellet niet droogt.
  12. Opschorten van de RNA in 100 µL DEPC-behandeld, RNase-vrije H2O.

5. reiniging van nieuw samengestelde breuk van totale en labelloze RNA met streptavidine beklede magnetische kralen

  1. Verhit de biotinyleerd RNA gedurende 10 minuten bij 65 ° C en vervolgens koelen de monsters op ijs gedurende 5 minuten.
  2. Voeg 100 µL van daar beklede magnetische kralen aan de biotinyleerd RNA (bij een eindvolume van 200 µL). Specifiek, is het aanbevolen om het gebruik van de kralen die is aangegeven in de Tabel van materialen, sinds, na gesprekken met andere laboratoria, deze leek het meer consistent en betrouwbaar.
  3. Incubeer het monster met lichte schudden voor 90 min, bij kamertemperatuur.
  4. Plaats de kolommen de kit (Tabel van materialen) in de magnetische standaard voorzien.
  5. Voeg 900 µL van kamertemperatuur wassen buffer (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl, en 0,1% Tween 20, DEPC-op dezelfde manier afgehandeld, RNase-vrije H2O) naar de kolommen (vooraf uitvoeren en equilibreer).
  6. Kralen/RNA mengsel (200 µL) toepassen op de kolommen.
  7. Verzamel de doorstroming in 1.5-mL buizen en opnieuw toepassen op dezelfde magnetische kolom. Indien nodig, houden deze doorstroomtest zoals het vertegenwoordigt de labelloze RNA-Fractie.
  8. Was de kolommen 5 x met toenemende volumes buffer te wassen (600, 700, 800, 900 en 1000 µL).
  9. Elueer de nieuw samengestelde RNA met 200 µL van 0,1 M DTT.
  10. Een tweede elutie, 3 min later, met een gelijk volume van 0,1 M DTT uitvoeren.
  11. Na eluerende RNA, toevoegen van 0.1 volumes van 3 M NaOAc (pH 5.2), 3 volumes ijskoude 100% ethanol en 2 µL van 20 mg/mL glycogeen (RNA-grade) en laat de RNA overhaaste overnachting, bij-20 ° C.
  12. Herstellen van het RNA door centrifugeren (13.000 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C) en resuspendeer het in 15 µL van DEPC-behandeld, RNase-vrije H20. Het aandeel van de label-naar-totaal RNA naar ongeveer 2-4% (meestal meer richting de onderkant), waardoor ongeveer 2,0 µg nieuw samengestelde RNA verwachting. Deze hoeveelheid is genoeg te doen verschillende experimenten van de qPCR, evenals voor microarray/sequencing analyses.

6. RT-qPCR validatie van de verschillende fracties

  1. Synthetiseren cDNA van 2 µg totaal RNA of 10 µL van gelabelde RNA met willekeurige hexamers en de reverse-transcriptase van keuze, volgens de instructies van de fabrikant (Tabel van materialen).
  2. CDNA versterken door real-time qPCR met behulp van een standaard protocol (Tabel van materialen).
    Opmerking: Alle monsters moeten in drievoud met een minimum van twee biologische replicatieonderzoeken worden uitgevoerd. Corrigeer alle ruwe waarden voor de uitdrukking van S. pombe tubuline.

7. de Microarray kruising

  1. RNA monsters op de spaanders van de voorkeur microarray volgens de instructies van de fabrikant te vermengen (Zie Tabel van materialenvoor dit specifieke protocol). Kort, bereiden biotinyleerd cRNA doelstellingen van 150 ng van RNA met behulp van de Premier RNA amplificatie Kit (Tabel of Materials), volgens de instructies van de fabrikant. 4 mg versnipperde cRNAs voor 16 h bij 45 ° C en 60 rpm op spaanders microarray te vermengen.
  2. Wassen, vlekken en scan de chips met behulp van het opgegeven station en de scanner (Tabel van materialen). Pak de onbewerkte gegevens (CEL intensiteit bestanden) van de gescande beelden met behulp van de opdrachtenconsole (AGCC, versie 4.1.2).
  3. De bestanden van de CEL met expressie Console softwareversie 1.4.1 om te berekenen sonde signaal intensiteit, met behulp van de statistische gegevens gebaseerde algoritmen MAS 5.0 met standaardinstellingen en wereldwijde geschaalde uitbreiding als normalisatie methode verder te verwerken.
    Opmerking: De intensiteit van de bijgesneden gemiddelde doel van elke chip was willekeurig ingesteld op 100. Het uitvoeren van alle experimenten met behulp van ten minste twee onafhankelijke biologische wordt gerepliceerd. Normaliseren van onbewerkte gegevens aan de S. pombe signaal en vouw veranderingen in totale en nieuw samengestelde RNA te berekenen.

8. de data-analyse met behulp van een bestaande R-pijpleiding

  1. Berekenen van synthese en verval tarieven met behulp van een pijplijn en R/Bioconductor pakket openbaar toegankelijk is, als eerder beschreven8,10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bij het uitvoeren van metabole labeling van nieuw getranscribeerde RNA, verschillende aspecten moeten worden gecontroleerd: de tijd en de efficiëntie van de etikettering, de spike-in verhouding, het protocol van de extractie en de doeltreffendheid van de biotinylation (inclusief signal-to-noise verhouding), onder anderen. Deze voorwaarden zijn uitgebreid en methodisch aangetoond door anderen7,10,11

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Terwijl genoom-brede tools om te analyseren van wijzigingen in de transcriptie nog steeds verbeteren zijn, kan de enige analyse van transcriptome door middel van de kwantificering van de stationaire toestand niveaus van RNA niet nauwkeurig overeen wijzigingen in RNA polymerase II activiteit. Inderdaad, mRNA niveaus worden geregeld, niet alleen door RNA-synthese, maar ook door hun rijping en afbraak. Voor het meten van mRNA-synthese rekken van mRNA afbraak, zijn verschillende protocollen ontwikkeld in de afgelopen jaren v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Laszlo Tora voor zijn steun en V. Fisher, K. Schumacher en F. El Saafin voor hun discussies. T.B. werd gesteund door een Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) en de Fondation ARC. Dit werk werd gesteund door fondsen van het Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Deze studie werd ook ondersteund door ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door de Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-ThiouracilSigma-AldrichCat# 440736
RapamycinEuromedexCat# SYN-1185
Countess II FL Geautomatiseerde celtellerThermoFisherN/A
RiboPure RNA-zuiveringskit, gistThermoFisherCat# AM1926
NanoDrop 2000 SpectrofotometerThermoFisherND-2000
TURBO DNA-vrij KitThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotineThermoFisherCat# 21341
ThiolutinAbcamab143556
µMACS Streptavidin kitMiltenyi BiotecCat# 130-074-101
Transcriptor Reverse TranscriptaseRoche03 531 295 001
SYBR Green I MasterRoche4707516001
GeneChip Gistgenoom 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Fluidics Station 450ThermoFisher00-0079
GeneChip Scanner 3000 7GThermoFisher00-0210

Referenties

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857(2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741(2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822(2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

mRNA syntheseSchizosaccharomyces pombeRNA extractiebiotinyleringstreptavidine beadsRT qPCR
Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.