Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57988

⸱

7 januari 2019

 ,  , 
1Institut NeuroMyoGène, CNRS UMR5310, INSERM U1217, Université Lyon, 2Unité Fonctionnelle de Neurogénétique Moléculaire, Hospices Civils de Lyon, 3Centre de Biotechnologie Cellulaire, Hospices Civils de Lyon

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van deze techniek is om voor te bereiden een hoogverrijkt cultuur van primaire motoneurons (MNs) van lymfkliertest ruggenmerg. Om te beoordelen van de gevolgen van mutaties veroorzaakt MN ziekten, beschrijven we hier het isolement van deze geïsoleerd MNs en hun transfectie door magnetofection.

Samenvatting

Neurodegeneratie van spinale motoneurons (MNs) is betrokken bij een groot spectrum van neurologische stoornissen zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth en spinale musculaire atrofie, die allen geassocieerd met atrofie van de spieren. Primaire culturen van spinale MNs zijn wijd gebruikt om blijk te geven van de betrokkenheid van specifieke genen in dergelijke ziekten en karakteriseren van de cellulaire gevolgen van hun mutaties. Dit protocol modellen een primaire MN cultuur is afgeleid van het baanbrekende werk van Henderson en collega's meer dan twintig jaar geleden. Ten eerste, we detail een methode voor het ontleden van de voorste hoorns van het ruggenmerg van het embryo van een muis en het isoleren van de MNs van naburige cellen met behulp van een dichtheid verloop. Vervolgens presenteren we een nieuwe manier van efficiënt transfecting MNs met expressie plasmiden met behulp van magnetofection. Tot slot, we illustreren hoe op te lossen en immunokleuring primaire MNs. met behulp van neurofilament mutaties die leiden type 2 ziekte Charcot-Marie-Tooth tot, dit protocol toont aan een kwalitatieve benadering van uiten van proteïnen van belang en het bestuderen van hun betrokkenheid bij MN groei, onderhoud en overleving.

Inleiding

Neuromusculaire ziekten omvatten een scala aan klinisch en genetisch verschillende aandoeningen die worden gekenmerkt door de verandering van de spier en/of het zenuwstelsel. Vanwege de vooruitgang in sequencing technologieën, honderden genen die verantwoordelijk zijn voor deze zeldzame aandoeningen zijn vastgesteld tijdens het laatste decennium (lijst beschikbaar op de neuromusculaire ziekte Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). De verscheidenheid van geïdentificeerde mutaties geeft aan dat er verschillende mutaties in een enkel gen leiden verschillende fenotypes en ziekten1,2,3 tot kunnen en dat mutaties in verschillende genen soortgelijke fenotypen kunnen produceren 4 , 5. in dit verband zijn er inspanningen voor de ontwikkeling van cellulaire modellen die krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van de gevolgen van de mutatie en pathologische mechanismen kunnen worden.

Spinale MNs hebben grote Soma gelegen in de ventrale hoorns van het ruggenmerg, formulier lange axons te richten skelet spiervezels en voor vrijwillige bewegingen door het vrijkomen van acetylcholine bij neuromusculaire kruisingen. Aangezien MNs worden beïnvloed door neuromusculaire ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT), en spinale musculaire atrofie, Dr Henderson en collega's ontwikkelde de eerste protocol6 , dat is toegestaan voor de teelt van in vitro spinale MNs en de ontdekking van neurotrophic factor GDNF7 (gliale cel afgeleide neurotrophic factor). Technische verfijningen sindsdien hebben toegestaan voor nauwkeuriger zuivering van spinale MNs en de bijbehorende subtypen FACS8gebruikt, maar verrijking door dichtheid verloop blijft krachtige en meest gebruikte in laboratoria die momenteel werken met primaire spinale MNs 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. vervolgens is het ook mogelijk te krijgen een hogere rang van MN zuivering door middel van immunopanning door gebruik te maken van oppervlakte marker p75(NTR)15,16,17.

Het ruggenmerg bevat verschillende subtypen van cervicale, thoracale en lumbale MNs, evenals met mediaan en lateraal motor kolommen die verschilt van de vindplaats in de voorste hoorn op een dorso-ventrale as en de doelen onderling innervate ze8, 18. primaire MN culturen kunnen herstellen alle van deze subtypen MN in fysiologische verhoudingen. De belangrijkste beperking van deze techniek is het geringe aantal MNs bekomen op het einde van de procedure; in feite, kan worden verwacht te verkrijgen rond 105 MNs zes embryo's, die is geschikt voor microscopie maar voor Biochemie experimenten te beperken. Voor het uitvoeren van experimenten met meer gestandaardiseerde subtypen en overvloedige MNs (> 106 cellen), embryonale stamcel afkomstige MNs18moeten worden beschouwd.

De transfectie van wild-type/mutant transgenen of vechtpartij endogene genen in primaire MNs is een snelle en nuttig hulpmiddel voor het ontcijferen van de pathofysiologische trajecten, met name wanneer Muismodellen niet beschikbaar zijn. Magnetofection is een techniek voor transfecting primaire neuronen, vergelijkbaar met lipofection zonder de verwante neurotoxiciteit. Bovendien kan transfectie worden uitgevoerd op volwassen neuronen na verschillende dagen in vitro, in tegenstelling tot de technieken op basis van electroporation9. Een nadeel van deze techniek is echter dat de kralen nucleïnezuren in de cultuur binden, waardoor ruis in de DAPI labeling. Virale infectie is waarschijnlijk de meest efficiënte techniek voor transfecting MNs; magnetofection vereist echter geen bepaalde veiligheidsprocedures die nodig is voor virale productie en cellulaire infectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren werden aanvaard door de ethische commissie van de instelling.

1. oplossing voorbereiding

  1. 10 mL van 4% BSA dialyzed in L-15 medium voor te bereiden.
    1. Los bovien serumalbumine poeder op 4% (m/v) in 10 mL L-15 voedingsbodem.
    2. Voeg de oplossing op een 20 mL dialyse cassette met een 20 kDa cut-off. Dialyze tegen 500 mL L-15 voedingsbodem voor 3 dagen onder agitatie bij 4 ° C. Het veranderen van het medium van de L-15 elke dag.
    3. Filtreer de oplossing door een 0,22 µm membraan en aliquot in 15 mL tubes. Opslaan van de buizen bij-20 ° C.
      Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van de volgende referenties: ongewijzigde rauwe L-15 middellange = L-15 medium, zure L-15 middellange = pH L-15, en L-15 voedingsbodem = bicarbonaat L-15.
  2. 200 mL pH L-15 voor te bereiden.
    1. Breng de pH van het medium van de L-15: eerst een wash-fles vullen met enkele stukken van droogijs. Injecteren van gas (CO2) in het L-15 medium tot de kleur omslaat naar oranje (~ pH 6.4 en ~ 40 druk). De pH kan ook worden aangepast met een standaard pH-meter.
    2. Het filteren van het medium door een 0,22 µm membraan en bewaren bij 4 ° C voor een maand.
  3. 100 mL bicarbonaat L-15 voor te bereiden.
    1. Toevoegen van 2.5 mL van 7% natriumbicarbonaat aan 97,5 mL van L-15 medium en opslaan bij 4 ° C.
  4. Voorbereiden van de IPCS (insuline Putrescin Conalbumin seleniet) supplementen.
    1. Los 2,5 mg van insuline in 0,5 mL 0,1 M HCl. toevoegen 4.5 mL tweemaal gedestilleerd water.
    2. Los 8 mg als putrescine in 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    3. Los 100 mg conalbumin in 10 mL PBS.
    4. Los 1 mg Natriumseleniet in 19,3 mL water en breng de pH op 7.4 Verdun de oplossing 10-fold.
    5. 1 mL van insuline oplossing, 1 mL van de oplossing als putrescine, 1 mL van conalbumin en 0,1 mL van natrium seleniet oplossing tot het verkrijgen van IPCS supplement 3.1 mL combineren. Winkel de oplossing bij-20 ° C.
  5. Bereid een progesteron-oplossing van 0,02 mM.
    1. Los 1 mg van progesteron in 1.6 mL 80% ethanol.
    2. Verdun de oplossing 100-fold in 100% ethanol en opslaan bij-20 ° C.
  6. 100 mL volledige L-15 voedingsbodem voor te bereiden.
    1. Voeg 1.8 mL van D-glucose oplossing (200 mg/mL) toe aan 92 mL pH L-15 om een eindconcentratie van 3,5 mg/mL glucose.
    2. Combineren van 1 mL 100 x penicilline-streptomycine (10.000 U/mL), 2 mL serum van de warmte-geïnactiveerd paard, 3.1 milliliters IPCS mix en 0,1 mL van progesteron oplossing (2 x 10-5 M).
    3. Het medium op een membraan 0,22 µm filteren en op te slaan bij 4 ° C.
  7. 5 mL dichtheid kleurovergang oplossing (eindconcentratie van 5,5%) per experiment voor te bereiden.
    1. 476 µL van het medium voor het verloop van 60% dichtheid commerciële toevoegen aan 4524 µL van L-15 (eventueel zonder rode fenol om het visueel contrast op de interfase; verdunningsverhouding van 1:10. 5).
    2. Opslaan van de oplossing bij 4 ° C voor 2 weken of bevriezen bij-20 ° C.
  8. 10 mL van voedingsbodems bereiden.
    1. Voeg 200 µL van supplement medium aan 9,6 mL neuron cel kweekmedium.
    2. Voeg 200 µL van warmte-geïnactiveerd paard serum (die de neiging heeft om te differentiëren gliale cel precursoren en werken tegen proliferatie) 25 µL van glutamine en 10 µL van 2-mercaptoethanol.
    3. Filtreer de media door een 0,22 µm filter.
    4. Toevoegen van de volgende neurotrophic factoren: Ciliaire neurotrophic factor (CNTF) op een eindconcentratie van 10 ng/mL, en hersenen-afgeleide neurotrophic factor (BDNF) en gliale cel afgeleide neurotrophic factor (GDNF) op de eindconcentraties van 1 ng/mL.
    5. Opslaan van de media bij 4 ° C.
  9. 50 mL dissectie media voor te bereiden.
    1. Voeg 2,25 mL glucose (200 mg/mL) toe aan 47.05 milliliters HBSS. Voeg 700 µL van 1 M HEPES met pH 7.4. Opslaan van de media bij 4 ° C.
  10. Bereid een 4% PFA-oplossing.
    1. Los 20 g PFA in 500 mL PBS.
    2. Onder een chemische kap, Verwarm de oplossing tot 60 ° C en voeg een paar druppels van 1 M NaOH totdat de oplossing duidelijk wordt.
    3. Filtreer de oplossing door middel van een filtreerpapier en breng de pH op 7,2. Bewaar het bij-20 ° C.
      Opmerking: U kunt ook andere commerciële PFA-oplossingen kunnen worden gebruikt en verdund tot 4% in PBS.
  11. De hulpmiddelen van de dissectie met inbegrip van de pincet, schaar en siliconen gerechten met 70% ethanol vóór gebruik, en met zeep schoon en helder water na gebruik.

2. poly-ornithine/Laminin (Po/L) schotel Coating

Opmerking: Volumes zijn aangepast aan de jas een 24-well-plate.

  1. Indien nodig zet een steriele 12 mm dekglaasje aan in de put.
  2. Coat de putjes met 500 µL van 10 µg/mL Poly-L-Ornithine oplossing opgelost in water.
  3. Laat de putjes regelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  4. Verwijder de Poly-L-Ornithine-oplossing en drogen voor 30 min.
  5. Coat de putjes 's nachts bij 37 ° C met 500 µL van 3 µg/mL laminin in bicarbonaat L-15.
    Opmerking: Wells kan worden achtergelaten bij 37 ° C gedurende 7 dagen in de incubator. Voor lange incubations, kan toevoegen van steriele PBS tussen de putten helpen voorkomen middellange verdamping.

3. dissectie

  1. Offeren een zwangere muis wanneer de embryo's embryonale stadium E12.5. Reinig de buik met 70% ethanol.
  2. Verwijderen van de baarmoeder door het snijden van de twee oviducts en de vagina en zet het in een petrischaal gevuld met koude PBS (zonder Ca2 + Mg2 +).
  3. Alle de embryo's te verzamelen en deze overbrengen naar vers, koud PBS (zonder Ca2 + Mg2 +) in een petrischaal.
  4. Zet één embryo in een schaal bekleed met siliconen en vol van dissectie media (HBSS 4.5 g/L glucose en 7 mM HEPES pH 7.4).
    Opmerking: Embryo dissectie wordt uitgevoerd onder een microscoop met behulp van schone fijne Tang en schaar. Anderzijds kan een regelmatige petrischaal zonder siliconen voor dissectie worden gebruikt.
  5. Verwijder de kop, staart en ingewanden, met behulp van de verlostang als schaar.
  6. Het handhaven van het embryo met de buik tegen het silicone met een tang.
  7. Met een tweede paar pincet, invoegen een van de tips in het centrale kanaal van het ruggenmerg rostraal.
  8. Sluit de verlostang om te scheuren van de dorsale weefsel een paar millimeter.
  9. Herhaal deze bewerking naar de caudal kant totdat het gehele ruggenmerg geopend is (figuur 1B).
  10. Loskoppelen van de rostraal deel van het ruggenmerg ("cerebral trunk") uit het lichaam.
  11. Draai het embryo te handhaven het open ruggenmerg tegen de siliconen.
  12. Knijp de rostraal deel van het ruggenmerg en het embryo te trekken door het hoofd te halen van het ruggenmerg.
    Opmerking: Hersenvliezen en achterwortelganglia, bevatten (DRG) moeten blijven vasthouden aan het embryo. Anders Trek voorzichtig weg alle resterende hersenvliezen en DRG nog steeds verbonden met het ruggenmerg. Bij deze stap de DRG ook voor gevoelige neuron cultuur kunnen worden ingezameld (zie discussie).
  13. Het ruggenmerg op het silicone afvlakken en verwijder de dorsale helft van het snoer door te snijden langs het midden van iedere kant met behulp van een scalpel. Snijd het middendeel in 10 stukken met behulp van een scalpel, en overdracht van de stukken aan een nieuwe buis.

4. ruggenmerg celsuspensie

  1. Herhaal deze procedure dissectie voor 6 tot en met 8 spinal koorden.
  2. Laat het ruggenmerg stukken verzamelen aan de onderkant van de buis en de HBSS vervangen door 1 mL van Ham-F10 medium.
  3. Voeg 10 µL van trypsine (2,5% w/v; eindconcentratie 0,025%). Incubeer de buis gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
  4. Om te stoppen met de enzymatische spijsvertering, door de fragmenten te overbrengen in een nieuwe tube van 15 mL met 800 µL van volledige L-15 medium, 100 µL van 4% (m/v) BSA, en 100 µL van DNase (1 mg/mL in L-15 medium).
  5. Triturate tweemaal door zuigen 1 mL met behulp van een precisiepipet P1000. Laat die de fragmenten regelen voor 2 min. verzamelen de bovendrijvende substantie in een vers 15 mL-buis.
  6. Voeg het gehakt, 900 µL van volledige L-15 medium, 100 µL van 4% (m/v) BSA en 100 µL van DNase (1 mg/mL in L-15 medium).
  7. Triturate 6 keer door zuigen 1 mL met behulp van een precisiepipet P1000. Laat de fragmenten die genoegen nemen met 2 min. toevoegen het supernatant op de tube van 15 mL in stap 4.5 verkregen.
  8. Voeg het gehakt, 900 µL van volledige L-15 medium, 100 µL van 4% (m/v) BSA en 100 µL van DNase (1 mg/mL in L-15 medium).
  9. Triturate 10 keer door zuigen 1 mL met behulp van een precisiepipet P1000. Laat de fragmenten die genoegen nemen met 2 min. toevoegen het supernatant op de tube van 15 mL in stap 4.5 verkregen. Ga verder met het supernatant.
  10. Plaats een kussen van 2 mL BSA 4% (m/v) met een P1000 pipet zachtjes onderin supernatant buis. Centrifugeer bij 470 x g gedurende 5 min.
  11. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 2 mL van volledige L-15 medium.

5. MN verrijking door kleurovergang dichtheid

  1. De celsuspensie gesplitst in twee 15 mL buizen (van elk 1 mL). Dan, voeg 2 mL van volledige L-15 medium. Als beginnend met 6 embryo's, gebruikt u het equivalent van 3 embryo's per buis in 3 mL medium.
  2. Voeg 2 mL dichtheid kleurovergang oplossing door langzaam de oplossing aan de onderkant van elke buis te verkrijgen van een sterke interface toe te voegen.
  3. Centrifugeer bij 830 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na deze stap, is de kleine cellen aan de onderkant van de buis, moet dat grote cellen zoals MNs op het raakvlak van de kleurovergang oplossing/medium dichtheid worden moeten.
  4. Verzamelen van de cellen op het raakvlak door zuigen 1 of 2 mL en deze overbrengen naar een vers 15 mL-buis. Stel het volume op 10 mL met L-15 pH medium.
  5. Voeg 2 mL van de 4% BSA kussen aan de onderkant van de buis en centrifuge op 470 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 mL van volledige L-15 medium.
  7. Herhaal stap 5.5.
  8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver volledige kweekmedium. Tellen de celaantal en levensvatbaarheid onder een fasecontrastmicroscoop met een hemocytometer.
    Opmerking: Voor 6 spinal netsnoeren, het celaantal naar verwachting ongeveer 1 x 105 MNs.

6. MN cultuur

  1. Verdun de MNs naar de juiste dichtheid, meestal 5.000 tot 10.000 cellen in 500 µL cultuurmedium per putje in een 24-well-plate.
    Opmerking: Zaaien dichtheid is ongeveer 30.000 en 1.500 cellen voor 6 - en 96-wells-platen, respectievelijk.
  2. Verwijder de laminin oplossing met een P1000.
  3. Onmiddellijk overdracht de MNs verdund in een kweekvloeistof in de coating platen Voorkom drogen.
  4. Incubeer de cultuur gedurende 2 dagen bij 37 ° C.

7. Magnetofection van MNs

Opmerking: In de volgende stappen, de gebruikte hoeveelheden zijn bedoeld voor de transfectie van één putje van de plaat van een 24-well. Raadpleeg de fabrikant protocol voor een andere indeling.

  1. Voor de bereiding van DNA, resuspendeer 1 µg van DNA in 50 µL van neuronale kweekmedium en vortex voor 5 s.
  2. Voorbereiding kraal buis, resuspendeer 1.5 µL van parels in 50 µL van neuronale kweekmedium.
  3. De 50 µL kraal oplossing toevoegen aan de 50 µL DNA oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (total volume = 100 µL).
  4. Tijdens deze incubatie, 100 µL cultuurmedium te trekken uit de put die zal zijn transfected.
    Opmerking: Zet de magnetische plaat in de incubator het opwarmen tot 37 ° C.
  5. Breng 100 µL van de DNA/kraal mix naar de waterput en Incubeer de plaat 20 – 30 min op de magnetische plaat bij 37 ° C.
  6. Wacht ten minste 24 uur voordat de detectie van cDNA expressie.

8. fixatie en kleuring

  1. Wassen van de cultuur 2 keer met PBS.
  2. Incubeer de cultuur gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA/PBS.
  3. Wassen van de cultuur 2 keer met PBS.
  4. De cultuur in 500 µL van blokkeerbuffer (PBS, 4% BSA, 2% normale serum, 0.3% Triton X-100, 0,1 M glycine) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
    Opmerking: Normale serum moet worden afgeleid van dezelfde soort als het secundaire antilichaam (bijvoorbeeld normaal geit Serum).
  5. Incubeer de cultuur 's nachts bij 4 ° C met primair antilichaam verdund in 250 µL van buffer met blokkerend.
    Opmerking: bijvoorbeeld TUJ1 wordt gebruikt bij 1/1000, SMI32 wordt gebruikt bij 1/1.000, en Lc3b wordt gebruikt bij 1/200.
  6. Wassen van de cultuur 3 keer met PBS.
  7. Incubeer de cultuur met fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in 250 µL van buffer met blokkerend gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  8. Wassen van de cultuur 3 keer met PBS.
  9. Monteren op glas dia's met behulp van montage medium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na 24 uur in de cultuur moeten worden motoneurons (MNs) al aanzienlijke axonale groei (ten minste 6 keer langer dan de grootte van het soma) weergegeven. In de volgende dagen, moeten axonen blijven groeien en weergeven van vertakkende (Figuur 2). Er zullen verschillende morphologies als gevolg van subtype specifieke kenmerken. Mediane kolom MNs die axiale spieren innervate hebben bijvoorbeeld korter en meer vertakt axonen dan laterale motor kolom MNs die lede...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Eén van de kritieke punten in dit protocol is dat de muis embryo's worden ontleed bij het venster van een precieze tijd tijdens de ontwikkeling (E12.5) voor het optimaliseren van de hoeveelheid MNs bekomen op het einde. Bovendien, voor optimale opbrengst, moet de dissectie worden uitgevoerd in de ochtend of vroeg in de middag. Voor E12.5 (bijvoorbeeld op E11.5) is dissectie moeilijk, vooral met betrekking tot de afschaffing van de hersenvliezen. Na E12.5 daalt het aantal verkregen MNs aanzienlijk. Om te controle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zouden graag bedanken de "Association pour le développement de la neurogénétique" voor Dr. Jacquier de fellowship en AFM-Telethon voor zijn steun via MyoNeurAlp strategisch plan. Wij zouden ook willen bedanken Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul en Dr. Georg Haase, die deelgenomen aan de ontwikkeling en verbetering van de techniek en de verspreiding van hun kennis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
Silicone dissectieschaalLiving systems instrumentationDD-90-S-BLK-3PKSylgard
ronde dekglasNeuVitro, Knittel glasGG-12-Pre12 mm
Slide a Lyzer cassettesThermoFisher Scientific6603020.000 MWCO ; 30 mL
Filter unitMilliporeSCGVU02RE
GP steriele spuitfiltersMilliporeSLGP033RS
4 wel plateThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta behandelde plate
forcepsFST by Dumont11252-20#5 forceps
schaarFST by Dumont14060-10fijne schaar
scalpelFST by Dumont10035-20gebogen mes
scalpelFST by Dumont10316-14micro-mes scalpel
Petri-schaalGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropyleenbuisFalcon352096
filterpapierWatman1001125cirkel, 125 mm diameter
glas kamer glijbaanLab-Tek1545264 kamers
Plasmid pCAGENAddgene#11160
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Oplossingen en media
Bovine serum albumineSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, geen rood fenolThermoFisher Scientific21083027
InsulineSigma-AldrichI6634
PutrescineSigma-AldrichP5780
ConalbumineSigma-AldrichC7786
NatriumselenietSigma-AldrichS5261
ProgesteronSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LaminineSigma-AldrichL2020
trypsine 2,5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS zonder Ca MgThermoFisher Scientific14190144zonder Mg2+ Ca2+
natriumbicarbonaatThermoFisher Scientific25080094
Neuron celkweekmediumThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus medium
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES buffer 1 MThermoFisher Scientific15630056
Densiteitsgradiënt mediumSigma-AldrichD1556Optiprep
supplement mediumThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Paarden serum warmte geïnactiveerdThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-mercaptoethanolThermoFisher Scientific31350010
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific1514012210.000 U/mL
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Immunoflurescentie
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515zonder Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
normaal geitenserumSigma-AldrichG6767
glycineSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H niet gefosforyleerd (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF bij 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield montagemediumVector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF bij 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF bij 1/200

Referenties

  1. Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
  2. Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
  3. Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
  4. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  5. Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  6. Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
  7. Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
  8. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
  9. Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
  10. Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
  11. Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
  12. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  13. Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
  14. Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  17. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
  19. Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
  20. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
  23. Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Motorneuronkweekdissectie van het ruggenmergdichtheidsgradi ntcentrifugatiemagnetofectie transfectieverrijking van primaire motoneuronenneurofilament immunokleuringconfocale microscopie analysemodellering van ziekte van Charcot Marie Toothbeoordeling van axonale transportprocessenmechanismen van neurodegeneratie
Modelleren ziekte van Charcot-Marie-Tooth In Vitro door muis primaire Motoneurons Transfecting
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.