We stellen een nieuwe chirurgische techniek voor een in vivo één lever kwab perfusie model in rat als een voorwaarde voor de verdere studie van in vivo gedeeltelijke lever techniek in de toekomst.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Orgel engineering is een nieuwe strategie voor het genereren van lever orgel substituten die potentieel kunnen worden gebruikt in de transplantatie. Onlangs, in vivo lever engineering, met inbegrip van in vivo orgel decellularization gevolgd door herbevolking, heeft ontpopt als een veelbelovende aanpak over ex vivo lever engineering. Postoperatieve voortbestaan werd echter niet bereikt. Het doel van deze studie is te ontwikkelen van een nieuwe chirurgische techniek van in vivo selectieve lever kwab perfusie bij ratten als een voorwaarde voor in vivo lever engineering. We genereren een bypass circuit alleen via de linker laterale kwab. Vervolgens is de linker kwab van laterale geperfundeerd met EDTA zoutoplossing. Het experiment wordt uitgevoerd met 4 groepen (n = 3 ratten per groep) op basis van verschillende perfusie tijden van 20 min, 2 h, 3 h en 4 h. overleven, evenals het macroscopisch zichtbare verandering van kleur en het histologisch vastberaden ontbreken van bloedcellen in het Portal triade en de blokgolven, wordt beschouwd als een indicator voor de oprichting van een succesvolle model. Na selectieve perfusie van de linker laterale kwab zien we dat de linker laterale kwab, inderdaad, van rood naar flauw geel draaide. In een histologisch beoordeling zijn geen bloed cellen zichtbaar in de tak van de portal-ader, de centrale ader en de sinusoïdes. De linker laterale kwab rood na de heropening van de geblokkeerde bloedvaten. 12/12 ratten overleefde de procedure voor meer dan een week. Wij zijn de eerste om te rapporteren een chirurgische model voor in vivo één lever kwab perfusie met een periode van lange overleving van meer dan een week. In tegenstelling tot de eerder gepubliceerde verslag, is het belangrijkste voordeel van de techniek die hier gepresenteerd dat perfusie van 70% van de lever wordt gehandhaafd gedurende de hele procedure. De oprichting van deze techniek biedt een basis voor in vivo gedeeltelijke lever engineering bij ratten, met inbegrip van decellularization en recellularization.
Inleiding
De indicaties voor orgaantransplantatie zijn voortdurend uitbreiden. Daarentegen afneemt orgaan donatie tarieven en de algehele kwaliteit van organen, wat leidt tot een toenemende vraag naar protheses. Het aantal kandidaten die zijn toegevoegd aan de wachtlijst voor levertransplantatie blijven stijgen (bijvoorbeeldin de Verenigde Staten, 11,340 patiënten werden toegevoegd in 2016, vergeleken met 10,636 in 2015)1. Ondanks aanzienlijke inspanningen behoeften het aantal beschikbare organen niet klinische. Als gevolg van de verhoogde incidentie van leverziekte, worden veel patiënten met end--toneel lever ziekten sterven op de wachtlijst voor transplantatie voor een donororgaan beschikbaar. Om te voldoen aan de enorme vraag naar donor lever transplantaten, alternatieve benaderingen met behulp van leverweefsel engineering beginselen actief worden nagestreefd2. Tegenwoordig, kon een nieuw ontwikkelde biologische techniek lever ingenieurswetenschappen potentieel overwinnen dit tekort.
Lever engineering bestaat uit twee stappen: de generatie van een Acellulair steiger, gevolgd door een herbevolking van de steiger. Voor het verkrijgen van een biologische Acellulair lever steiger, is het transplanteren lever geperfundeerd via het vaatstelsel met Ionische of nonionic detergentia die aan het celmateriaal uit de lever verwijderen kunt. In de meeste eerdere studies, werd een biologische Acellulair lever steiger bereikt door perfusie van de lever met een combinatie van natrium dodecyl sulfaat en TritonX100. Dientengevolge, zijn alle cellen verwijderd, overwegende dat de structuur van de extracellulaire matrix werd gehandhaafd. Het orgel steigers werden reseeded met volwassen cellen, hepatocellulaire, evenals endothelial cellijnen en primaire hepatocyten met of zonder de gelijktijdige toepassing van endotheliale cellen of mesenchymale stamcellen (MSC). De meeste onderzoekers focus op ex vivo lever engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Echter in de meeste eerdere studies, waren slechts kleine stukjes van nieuwe steiger kubussen in verschillende heterotopic implantatie sites getransplanteerd. In een paar studies, waren gedeeltelijke nieuwe steigers getransplanteerde als een ondersteunende graft. De maximale gerapporteerde overlevingstijd was echter slechts 72 h8,14. As far as we know, is orthotopic transplantatie van een nieuwe volledige lever transplantatie nog niet uitgevoerd of gepubliceerd over. De lange termijn functie en -transplantatie van gemanipuleerde organen zijn nog in de kinderschoenen. Daarom is een alternatieve aanpak ex vivo lever techniek noodzakelijk.
In vivo lever engineering kan vertegenwoordigen een alternatief voor het bestuderen van hepatische herbevolking onder fysiologische omstandigheden. De voordelen van in vivo lever engineering in vergelijking met ex vivo lever engineering zijn spruitstuk. De in vivo herbevolkt gedeeltelijke lever steiger is onderworpen aan fysiologische bloedverspreiding met de juiste temperatuur, voldoende zuurstof, voedingsstoffen en groeifactoren in tegenstelling tot ex vivo perfusie met kunstmatige kweekmedium. Daarnaast onderhoudt de resterende gedeeltelijke normale lever de lever functie, voornamelijk waardoor voortbestaan op lange termijn. Aangezien een geïmplanteerde ex vivo ontworpen lever transplantatie nog steeds niet in staat is om het voortbestaan van de proefdieren door de leverfunctie8, wij voorzien dat in vivo gedeeltelijke lever engineeringwould uiteindelijk worden een veelbelovende model de evolutie van gemanipuleerde levers met langere overleving opmerkingen dan ex vivoverder te bestuderen.
Onlangs, een onderzoeksgroep (Pan en collega's) ingediend, voor de eerste keer, een techniek van in vivo lever engineering15. Ze bereikt de geïsoleerde perfusie van het recht inferieur lever kwab bij levende ratten ondanks anatomische en technische uitdagingen. Zij rapporteerde de eerste intraoperatieve resultaten van in vivo herbevolking met behulp van een rat primaire hepatocyte cellijn. Echter het in vivo chirurgische perfusie model van Pan et al. heeft nadelen. Ze bereikt één lever kwab perfusie bij ratten ten koste van de ader van de portal en de vena cava inferior, die ernstige schade aan het dier veroorzaken kunnen volledig te blokkeren. De experimentele ratten werden opgeofferd na slechts 6 uur van intraoperatieve observatietijdstip. Daarom moet de in vivo lever kwab perfusie techniek verder worden verbeterd om postoperatieve overleven.
We ontwikkelden een roman voortbestaan model voor in vivo lever kwab perfusie, gebaseerd op eerdere studies van de hepatische anatomie van rat16, de portal vein cannulation techniek voor de hemodynamische bewaking in muizen17, en lever bioengineering 18 , 19. de belangrijkste stappen voor de procedure worden geïllustreerd in figuur 1A - 1E.
Deze techniek is geschikt voor diegenen die willen deze experimentele in vivo perfusie model voor fundamenteel onderzoek op gedeeltelijke orgel behandeling door infusie met drugs, in vivo decellularization gebruiken als een chemische resectie voor orgel ziekten (bv , leverkanker), in vivo de cultuur van de cel in een decellularized matrix vergelijken ex vivo twee-dimensionale en drie-dimensionale cel cultuur systemen20,21,22,23 , 24 , 25 , 26en in vivo lever engineering door decellularization en herbevolking.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De behuizing en alle procedures uitgevoerd in overeenstemming waren met het welzijn van de Duitse wetgeving. Alle gaas, bekleding kleren en chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerde met autoclaaf en bereid vóór de bewerking. Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
1. voorbereiding van de Rat van de chirurgische ingreep.
- Plaats de rat in een zaal van de inductie en anesthetize van de rat met 4% verdampt Isofluraan en 100% zuurstof op 0.5 L/min gedurende ongeveer 3 minuten, totdat de rat is volledig verdoofd.
- De rat uit de kamer van de inductie en meten van zijn lichaamsgewicht.
- Scheren van de vacht van het chirurgische gebied op de buik.
- Plaats het dier terug in de bedwelmingsruimte Isofluraan voor een extra 2 min te verdiepen van de verdoving.
- Plaats de rat op de operatie tafel in liggende positie.
- De verdoving masker positiebepaling naar de regio van de mond van de rat en houd het dier verdoofd met een continue gasstroom van 2% verdampt Isofluraan en 100% zuurstof bij een debiet van 0.5 L/min.
- Het herstellen van de ledematen met stukken van tape.
- Dierenarts zalf toepassen op beide ogen om te voorkomen dat droogte.
- Beheren van buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan, om pijn te verlichten tijdens de operatie.
- Desinfecteer het chirurgische gebied van de buik met 3 rondes van jodium tinctuur gevolgd door 2 rondes van 70% alcohol.
- Plaats gesteriliseerd gaas rond het gebied waar de incisie wordt gemaakt alleen verlaten het gebied van de werking van de buik blootgesteld.
- Ga verder met het uitvoeren van de bewerking wanneer de reflex teen-snuifje terugtrekking van de rat afwezig is.
2. laparotomie van de Rat
- Het maken van een transversale buik huid en spier incisie met schaar en een elektrische coagulator.
- Los en trek de xiphoid process richting het hoofd met behulp van een 4-0 polypropyleen hechtdraad.
Opmerking: Let op til de xiphoid proces verticaal beter bloot de lever, maar behoedzaam om ernstige respiratoire beperking en verstikking te voorkomen. - Open de peritoneale holte door beide zijden van de buik muren naar het hoofd met twee subcostal haken bloot van de lever te trekken.
- Dekking van de twaalfvingerige darm en dunne darm in de buikholte met een bevochtigde gaas om te voorkomen dat het drogen.
- Links en rechts mediaan lobben verheffen met behulp van een bevochtigde gaas en houd ze tegen de thorax naar betere bloot de Hilus van de lever.
- Plaats de rat onder een stereomicroscoop (8 X vergroting).
- Drop enkele warme zoutoplossing in de buik en op het oppervlak van de lever en de darmen elke enkele minuten, om te voorkomen dat het drogen tijdens de hele procedure.
3. oprichting van een Bypass Passage binnen de linker laterale kwab
- De linker portal vein ontleden en het afbinden met een 6-0 zijde Sutuur (geologie) op het honk (figuur 2A).
- Blokkeren de linker hepatische slagader, de linker gal duct samen met de linker mediaan portal ader, de linker mediaan hepatische slagader en de linker mediaan gal koker met micro klemmen om te voorkomen dat een stroom van het perfusaat de linker mediaan kwab (figuur 2B).
- Scheid de linker laterale kwab door het afsnijden van de omringende ligamenten van de kwab met micro schaar.
- Blokkeren de linker laterale hepatische ader door klemmen aan de voet van de linker laterale kwab met micro klemmen (figuur 2C).
Opmerking: Zorg ervoor dat u niet per ongeluk de linker portal vein evenals klem. - Gebruik mug klemmen te houden van de ligatuur van de linker portal-ader en houd de ader met de juiste spanning voor de latere cannulation.
- Zorgvuldig maken een insnijding in de voorgevel van de linker portal ader door het prikken met een 24-G naald-woning katheter ( figuur 3A).
Opmerking: Als u wilt maken een bypass, vasculaire toegangspunten op de linker portal-ader en de linker hepatische ader nodig zijn. Voor deze stap, bij voorkeur wordt maken de vasculaire toegang door de schepen prikken met een naald eerder dan het maken van een grotere snede met behulp van schaar. Dit vermindert het risico van bloeden en later stenose. - Trekken van de katheter en neem de naald uit de katheter te verkrijgen van een naald-vrij 24-G-katheter.
- De katheter te verbinden door een buis perfusie, van die het andere eindpunt verbinding maakt met een 20-mL injectiespuit met 15 mL 40 U/mL EDTA zoutoplossing op een pomp perfusie.
- De pomp voor de buis om lucht uit uit de buis en de naald-vrije katheter zoogdierlevercellen inschakelen.
- Uitschakelen van de perfusie-pomp.
- Nogmaals, invoegen de naald-vrije katheter de linker portal vein via de geperforeerde incisie op de ader (figuur 3B).
Opmerking: Als gevolg van het feit is er zeer beperkte ruimte voor de vaststelling van de katheter, het is op dit punt niet vast. Daarom, de chirurg zorg moet gebruiken om te voorkomen dat de verplaatsing van de gecanuleerde katheter. - Zorgvuldig maken nog een insnijding in de marge van het blootgestelde gebied van de linker laterale hepatische ader door het prikken met een 22 - of 24-G naald-woning katheter (Figuur 3 c).
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat de katheter iets kleiner is dan het schip. - Trekken van de katheter en neem de naald uit de katheter te verkrijgen van een naald-vrij 22-G-katheter.
- Zet de perfusie pomp perfuse EDTA zoutoplossing in de linker laterale kwab via de 24-G gecanuleerde naald-vrije katheter van de linker ader van het portaal op een debiet van 0,5 mL/min.
- Gebruik droog gaas om te absorberen uit vloeiende afval vloeistof rond het gebied van de insnijding van de linker laterale hepatische ader.
- Cannulate de linker laterale hepatische ader via de geperforeerde insnijding van de ader met de 22-G naald-vrije katheter, voor het genereren van een vloeistof stopcontact om het minimaliseren van intra-abdominale besmetting (figuur 3D).
Opmerking: Het is technisch moeilijk op te lossen de gecanuleerde katheter naar de lever kwab. Daarom moet de chirurg aandacht om te voorkomen dat de verplaatsing van de katheter. Als alternatief, zonder cannulation van de linker laterale hepatische ader met een katheter, afval vloeistof kan ook worden opgevangen in de regio van de insnijding van de ader alleen met een droog gaas. - Houd de linker laterale kwab met EDTA saline voor ongeveer 20 min (groep 1) zoogdierlevercellen en dan alleen met zoutoplossing voor 2 h, 3 h of 4 h (groep 2, groep 3 en groep 4, respectievelijk).
- Uitschakelen van de pomp om te stoppen met de perfusie.
4. fysiologische reperfusie van de linker laterale kwab
- Beide katheters vanuit de linker portal-ader en de linker laterale hepatische ader opstijgen.
- Sluit de insnijding van de linker portal ader met een 11-0 polyamide hechtdraad.
- Sluit de insnijding van de linker laterale hepatische ader met een 11-0 polyamide hechtdraad ook.
- Unclamp de linker laterale hepatische ader.
- Unclamp de linker mediaan portal vein, linker gal duct en linker hepatische slagader.
- De ligatuur die op de linker portal ader te heropenen van de ader afgesneden.
5. sluiting van de buikwand
- Sluit de laag van de spieren van de buikwand door onderbroken wordt met een 4-0 absorbeerbare polyglactin 910 hechtdraad.
- Sluit de huidlaag van de buikwand door onderbroken wordt met een 4-0 absorbeerbare polydioxanone hechtdraad.
- Na het sluiten van de buik, Desinfecteer de huid incisie met 70% alcohol.
6. postoperatieve behandeling van de Rat
- Plaats het dier op een opwarming pad voor reanimatie voor ongeveer 10 minuten en zet het dan in een nieuwe kooi.
- Beheren van buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan 2 x per dag voor een opeenvolgende 3 d postoperatief pijn vrij te laten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Twaalf man (leeftijd 12 - 13 weken) Lewis ratten werden gebruikt voor het beoordelen van het effect van selectieve lever kwab perfusie. Het experiment werd uitgevoerd in vier groepen (n = 3 ratten per groep). Met behulp van verschillende perfusie periodes van 20 minuten, bereikt 2 uur, 3 uur en 4 uur, na de stappen die hierboven beschreven, we met succes in vivo één kwab perfusie.
In Vivo
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Door blokkeren en cannulating de linker portal ader met een katheter als een vloeistof inlaat en de linker laterale hepatische ader met een katheter als een vloeistof outlet, we met succes hebben gemeld een in vivo vloeistof bypass binnen de linker laterale kwab, waaruit blijkt dat Hoewel de techniek zeer uitdagend vanwege de geringe omvang van de schepen voor cannulation en een hoog risico is veroorzaken bloedingen, is het haalbaar. Zelfs de ratten in een periode van lange perfusie van 4 uur overleefde ten mins...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank Jens Geiling van de Instituut van Anatomie I, Jena universitair ziekenhuis, voor de productie van de schematische tekeningen van rat lever anatomie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Perfusiepomp | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro chirurgisch instrument | |||
| micro schaar | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro klemmen | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro klemmen applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Rechte micro pincet | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Gebogene micro pincet | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro naaldhouder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| algemene chirurgische instrumenten | |||
| standaard schaar | F·S·L | ||
| mosquito klem | F·S·L | ||
| gekartelde pincet | F·S·L | ||
| getande pincet | F·S·L | ||
| naaldhouder | F·S·L | ||
| naadmateriaal | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 zijde | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon |
Referenties
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955(2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003(2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474(2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
