We hebben een eenvoudig en veelzijdig systeem harde teken waardplanten laboratorium konijnen ontwikkeld. Ons niet-moeizame protocol gebruikt gemakkelijk toegankelijke materialen en kan worden aangepast afhankelijk van de vereisten van de verschillende experimentele instellingen. De methode kunt comfortabel toezicht en/of bemonstering van teken tijdens de gehele periode van de voeding.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een veelzijdig Model van harde teek besmetting op laboratorium konijnen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het gebruik van levende dieren in de teek onderzoek is cruciaal voor een verscheidenheid van experimentele doeleinden met inbegrip van het onderhoud van harde teek kolonies in het laboratorium. Alle ontwikkelingsstadia (met uitzondering van ei) zijn cDNA in teken, en het verkrijgen van een bloed-maaltijd wanneer gekoppeld aan hun gewervelde gastheren is essentieel voor de succesvolle voltooiing van hun levenscyclus. Wij tonen hier een eenvoudige methode die gemakkelijk openable capsules gebruikt voor het voederen van harde teken op konijnen. De voordelen van de voorgestelde methode omvatten zijn eenvoud, korte duur en vooral veelzijdige aanpassing aan de behoeften van specifieke experimentele eisen. De methode maakt het gebruik van meerdere kamers (van verschillende maten) mogelijk op hetzelfde dier, waardoor de voeding van meerdere stadia of verschillende experimentele groepen terwijl het verminderen van de algehele dierlijke eis. De gebruikte materialen die niet-irriterend en gemakkelijk toegankelijke minimaliseert ongemak voor de dieren, die kan worden gemakkelijk hersteld van een experiment en voor goedkeuring aangeboden of opnieuw gebruikt wanneer de ethische protocol staat toe het.
Inleiding
De harde teken (Ixodidae) zijn bekend als traag voeding geleedpotigen en kunnen worden aangesloten op een host voor meerdere dagen of weken, afhankelijk van de soort en de ontwikkelings fase1. Deze verplichte cDNA geleedpotigen zijn vectoren van een breed scala van ziekteverwekkers, zoals bacteriën, protozoa, en virussen, en dus het presenteren van een significant risico voor mens en dier1. Wanneer teek biologie studeren of evaluatie van de nieuwe controlemethoden, de oprichting van een effectieve teek voersysteem is van cruciaal belang om effectief de experimenten ontwerpen en verwezenlijken van de goal(s) van de studie. Onlangs, verscheidene kunstmatige teek voedersystemen (het vermijden van het gebruik van levende dieren) geweest ontwikkelde2,3,4 , en ze moeten waar mogelijk worden gebruikt. Echter, deze systemen zijn niet geweest kundig voor volledig vervangen teek voeden met levende dieren, en zij zijn niet geschikt substituten voor veel fysiologische voorwaarden voor wetenschappelijke studies. Daarom in sommige gevallen is het gebruik van experimentele dierlijke gastheren cruciaal voor het garanderen van de relevantie van experimentele resultaten.
Laboratorium Nieuw-Zeeland konijnen hebben aangetoond dat de hosts van het meest geschikte en toegankelijk voor verschillende ixodid teek soorten5,6,7,8,9. Twee gemeenschappelijke strategieën van de teek voeden met konijnen zijn vaak gebruikt: a) voeden met konijn oren bedekt met katoenen doek of sokken6,7, en b) voeding in katoen tassen9, nylon flessen10 of neopreen handschoenen Chambers11 gelijmd aan de rug van het konijn. De voeding op de oren van het konijn is niet een elegante systeem, omdat teken (vooral vroege stadia, larven of nimfen) kunnen kruipen en hechten diep in de gehoorgang, dat is ongemakkelijk voor het dier en maakt de monitoring van de teek voeding en/of het herstel van overvuld teken moeilijk. Dit systeem is ook beperkt tot slechts twee groepen van de teek op de oren volledig gedekt door sokken beschermd door Elizabethaanse kragen, vertegenwoordigen een aanzienlijke hinder voor het dier. Andere systemen9,10,11 zijn zeker meer geavanceerde en geschikt voor harde teek kolonie onderhoud. Ze zijn echter beperkt in het aantal experimentele groepen geplaatst bij konijnen, alsmede in de wijzigbare maten/vormen van de voeding kamers. Deze protocollen vereisen bovendien vaak moeizame de benen van de achterste konijn Voorkom krassen en het gebruik van de Elizabethaanse kragen om te voorkomen dat verzorgen.
Hierin stellen wij voor een eenvoudige, niet-moeizame en zeer effectieve methode om te voeden van meerdere groepen van harde teken in gesloten kamers vastgelijmd aan het konijn weer gedekt door een jas, eliminerend de behoefte aan Elizabethaanse kragen of moeizame tijdens het experiment. Ons systeem gebruikt met name elastische capsules gemaakt van een ethyleen vinyl acetaat (EVA) schuimfolie vallende mug mesh en gelijmd op de geschoren konijn terug met latex lijm niet-irriterend snel stollen (3 min). Deze techniek maakt het mogelijk de gehechtheid van meerdere capsules van gewenste grootte of vorm, en enkele weken na het experiment de konijnen zijn volledig hersteld. Het systeem is geschikt vooral voor de stadia van de nimfen en volwassen harde teek, maar met een beetje wijziging kan het worden gebruikt voor larven voeden ook. De EVA schuim gebaseerde methoden voor harde teek voeding kunnen worden aangepast aan andere soorten gewervelde gastheren, bijvoorbeeld schapen (die wordt aangegeven als een van de alternatieven in dit document).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: In deze studie werden konijnen onderhouden in standaard kooien met voedsel en water aangeboden ad libitum op het Franse Bureau voor voedselveiligheid, milieu en beroepsmatige gezondheidszorg & veiligheid (ANSES) geaccrediteerd dierlijke faciliteiten in Maisons-Alfort, Frankrijk. Dieren werden tweemaal dagelijks gecontroleerd door twee ervaren technici voor abnormale huidreacties, gezondheidsproblemen of complicaties. De laboratoriumruimte werd beveiligd door het interieur van de deuropening met dubbelzijdige tape om te voorkomen dat per ongeluk ontsnappen van teken. De methode werkt het beste als twee mensen als een team werken, maar het is mogelijk om enkele eigenhandig door een ervaren persoon. Hoewel de meeste konijnen volgzaam en kalm zijn, kunnen tekenen van stress optreden tijdens de manipulatie. Om ervoor te zorgen dat een konijn zich niet door worstelen verwonden, handmatige terughoudendheid kan worden bewerkstelligd door voorzichtig van het nekvel van de nek in de ene hand terwijl de andere hand het ondersteunt achterhand. De zes maand oud, Rambouillet vrouwelijke schapen werd gehouden in het Paleis voor biomedisch onderzoek (CRBM) voorzieningen op de nationale veterinaire School van Alfort (ENVA), water en voedsel meegeleverde ad libitum werden, waarbij het werd gecontroleerd tweemaal daags.
Opmerking: Ons laboratorium heeft gekregen toestemming voor het gebruik van de schapen en konijnen Tick voeden door de ethische commissie voor dier experimenten komt Anses/ENVA/UPEC, toestaan nummers 01741.01 en 11/10/16-5B, respectievelijk. Aangezien wij alleen pathogenen vrije teken in onze experimenten gebruikt, werden alle de konijnen gebruikt in deze studie aangeboden voor goedkeuring via de White Rabbit Association, Parijs, Frankrijk.
1. bereiding van de Capsules
- Knip de gewenste grootte van de capsule van het EVA-schuim blad(Figuur 1). Eerste ronde van de buitenste hoeken (Figuur 1B) van de capsule om te minimaliseren van toevallige detachement wanneer het lijmen op de huid van een konijn.
Opmerking: De dikte van het frame van de capsule moet rond 8 mm. gebruik een vel van 5 mm dik schuim voor de larven, nimfen en kleine teek volwassen soorten zoals Ixodes. Een 1 cm dikte schuimfolie is geschikt voor groot formaat volwassen teken zoals Amblyomma sp., Hyalomma sp., etc. die de grootte van de capsule varieert op basis van de experimentele behoeften. Bijvoorbeeld, voor 20 Ixodes volwassen paren, 200 nimfen of larven van de 1.000 gebruiken we een innerlijke capsule grootte van 5 x 5 cm,2, 6 x 7 cm2 of 7 x 9 cm2, respectievelijk. - Knip de 8 mm brede stroken van zelfklevende haak tape (Zie Tabel van materialen) en plak ze aan het bereid EVA schuim frame (Figuur 1C).
- Knip de dezelfde grootte strips van zelfklevende lus tape (Zie Tabel van materialen) en binden aan de zijkanten van de haak aan de EVA-schuim frame (Figuur 1D) gekoppeld.
- De juiste grootte voor de strik fijne mug (maaswijdte van minder dan 50 µm) op de maat van het EVA-schuim frame gesneden en vasthouden aan de zelfklevende lus (figuur 1E en 1F). Snijd de overhangen indien nodig.
Opmerking: Dit soort capsule kan worden gebruikt om te voeden nimfen en volwassenen van harde teek soorten, terwijl een ander afdichting systeem van de capsules is nodig voor het larvale voederen (aanvullende figuur 1) om te voorkomen dat per ongeluk ontsnappen van de larven via de eigendom haak-en-loop kant.
2. voorbereiding van het konijn voordat de teek besmetting
- Het scheren van het gebied van de konijn achterkant en zijkanten met clippers(Figuur 2)worden gebruikt.
- Niet-irriterend latex lijm van toepassing op het gehele oppervlak van de bereid capsule en wacht 1 min (Figuur 2B).
- Lijm de capsule door te drukken op de huid (vooral bij de hoeken) met de vingers voor ongeveer 3 minuten (figuur 2C en 2D).
Opmerking: Wanneer meer dan één capsule lijmen, zorg ervoor om te houden van ten minste 5 mm ruimte tussen hen (figuur 2E en 2F). We meestal vermijden de regio van de wervelkolom, maar het kan worden gebruikt indien nodig. - Iets til de capsules als u wilt visueel controleren hun gehechtheid aan de huid. Als niet-ingeschrevenen regio's worden aangetroffen, gelden de lijm met behulp van een spatel en druk op voor een andere 3 minuten.
- Beschermingstape van toepassing op de achterste poten van het konijn ter voorkoming van beschadiging van de jas (Figuur 2G).
Opmerking: Deze stap is optioneel en is vooral om te voorkomen dat jas schade, geen schade aan de capsule van de teek. - De konijn jas gezet door het plaatsen van de voorpoten door de openingen en aanscherping van de nek, waardoor zeker konijn ademhaling blijft comfortabel. Plaats van de achterste poten door de elastische bijlagen bij deze stap niet en laat de rits open (Figuur 2H).
3. de teek besmetting
- Plaats het teken in een plastic injectiespuit (1 of 5 mL, afhankelijk van het aantal personen) met de naald-end knippen en aangesloten met katoen (Figuur 1G). Als een kleine hoeveelheid van de teken besmet zijn, gebruik pincet.
Opmerking: Voor teek kolonie onderhoud toestaan de overvuld teek female(s) om eieren te leggen met de latere broedeieren binnen de spuit (5 of 10 mL) vallen door de mazen van de mug verpakt door een rubberen band12 te vermijden moeizame manipulatie van de larven op het moment ze zijn toegepast op de host (Figuur 1H). Ook volledig overvuld larven mogen molt in de spuit (aanvullende figuur 1I; 5 of 10 mL) voor directe besmetting van het konijn met nimfen. - Plaats de injectiespuit diep in de capsule via de open hoek en enten van het teken door de plunjer van de injectiespuit te duwen. Langzaam draai de plunjer naar de huid van het konijn als u wilt verwijderen van de resterende teken gekoppeld aan de zuiger en tegelijkertijd het uitlichten van de capsule (Figuur 2ik).
Opmerking: Als sommige van de individuen uit de capsule kruipen, terugsturen met pincet. - Sluit de capsule door het refastening van de haak en lus tape.
- Plaats de achterpoten van het konijn in de elastische bijlagen van de jas en zip gesloten achterkant.
Opmerking: Zorg dat er een wijsvinger tussen de nek van de jas en het konijn passen kunnen om comfort te verzekeren, en ook om te voorkomen dat het kauwen op de jas. - Het konijn terugkomen in de kooi (Figuur 2J).
Opmerking: De tijd tussen de besmetting collectie van vol teken verschillen tussen verschillende teek soorten en de ontwikkelingsstadia. Bijvoorbeeld voor Ixodes scapularis en Ixodes ricinuszijn de totale duur van de voeding voor volwassenen, nimfen en larven 6-9, 3 – 4: 2-3 dagen, respectievelijk en. Een lijst met referenties voor 29 verschillende harde teek levenscycli onder laboratoriumomstandigheden kan worden gevonden in Levin en Shumacher (2016)9.
4. verzameling en controle van teken
- Neem het konijn van de kooi naar de Bank en pak de jas.
- Zachtjes beperken het konijn met je handen. Open de capsule door het unfastening van de haak en lus tape (Figuur 2 K en 2 L) en de teken verzamelen door borstelen de overvuld larven (aanvullende figuur 1) of de nimfen aan een kunststof schotel of het gebruik van pincet voor volwassenen (Figuur 2L ). Als gedeeltelijk gevoed (niet vol) teken zijn vereist, een tick twister of pincet gebruiken om ze los te maken.
Opmerking: Als de teek kolonies Zie de opmerking in stap 3.1. Handhaven de overvuld teken in passende vochtig en temperatuursomstandigheden volgens de bijzondere teek soorten. - Indien nodig, refasten de haak en lus tape om te sluiten van de capsule.
5. herstel van het konijn
- Volledig verwijderen van de mug Maas uit de capsule en laat het jasje op het konijn (Figuur 2M).
- 3-4 weken wachten en probeert te verwijderen van de capsule door zachtjes het trimmen van een van de hoeken (Figuur 2N). Herhaal deze stap als de capsule nog stevig is aangesloten, een week later.
- Verwijder de jas en laat die het konijn in de kooi herstellen.
Opmerking: Als de capsule uitgeschakeld is, controleert u de huid van het konijn voor abnormale reacties. Hoewel normaliter geen behandeling nodig is, kan een verzachtend lotion worden gebruikt in geval van irritatie. - Als het protocol en de experimenten toestaat, kan het herstelde konijn (Figuur 2O) worden hergebruikt of aangeboden voor goedkeuring.
Opmerking: Konijnen is aangetoond dat het verwerven van de teek weerstand eenmaal blootgesteld aan herhaalde teek parasitaire13; reinfestations worden daarom niet aanbevolen tenzij het experiment vereist.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier stellen wij voor de eerste keer een gedetailleerde stap-by stap methode van harde teek voeding in EVA-schuim capsules toegepast op een geschoren konijn rug, gedekt door een jas (Figuur 1 en Figuur 2). Dit protocol is geschikt voor verschillende soorten experimenten wanneer verschillende teek groepen op dezelfde host vereist zijn en kunnen ook worden gebruikt voor het opfokken van de massa van harde teken. De...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De belangrijkste stap in dit hele protocol is om de capsule stevig aan de geschoren huid lijm. Om deze reden is constante druk gedurende ten minste 3 minuten kritisch, met name op de hoeken. Bij het enten van de teken in de capsule, is het belangrijk om ze te passen diep in de tegenoverliggende hoek van het open om te voorkomen dat de teek ontsnappen tijdens de verzegeling. Bij de planning van de experimenten, zorg ervoor dat alle de capsules onder de jas om schade te voorkomen vallen door kauwen of krassen. Zorg ervoor ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij erkennen de technische bijstand van Evelyne Le Naour, Frans Nationaal Instituut van agrarisch onderzoek (INRA), Alain Bernier (INRA) en Océane Le Bidel (ANSES). Consuelo Almazán werd gesteund door een beurs van het laboratorium of Excellence, integratieve biologie van opkomende infectieziekten (LabEx IBEID), Pasteur Instituut. De konijnen en de schapen werden gekocht door ANSES. Onderdeel van dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health toekenning RO1AI090062 aan Y. Park. Dr. Jeffrey L. Blair is erkend voor de herziening van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) | Charles River | Strain Code 571 | |
| Rambouillet sheep | Local provider-tick free farm | Female 6 months old | |
| EVA foam 5 mm thick | Cosplay Shop | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm PE45 kg schuim van de Cosplay Shop kan worden gebruikt voor de grote volwassen tekensoorten |
| Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-EVA schuim kan worden besteld via Amazon als alternatief voor het schuim van Cosplay Shop |
| Full length rabbit jackets | Harvard Apparatus, Inc. | 620077- medium, 6270078 - large | |
| Non-toxic latex glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | |
| Tubular cotton orthopedic stockinette | BSN Medical | 9076 (12-15 cm wide) | |
| Mosquito mesh | Loisirs Creatifs | Very fine filter nylon mesh fabric | Om het gaas te maken is elk mozaïek gaas of gordijn materiaal met de gaasgrootte minder dan 50 μm geschikt. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Adhesive hook-and-loop tape | AIEX store | AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour | Fullfiled by Amazon |
| Fast drying glue | Fixtout | Superglue |
Referenties
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Ticks, People and Animals. Biology of Ticks, Vol I. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., Jouglin, M., Malandrin, L., Becker, C., Agoulon, A., L'hostis, M., Chauvin, A. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus.ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Khols, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain Wood Tick, Dermacentor andersoni Stiles. Culture methods for invertebrate animals. , Dover Pubs. New York. (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae) [Coelhos (Oryctolagus cuniculus) como hospedeiros experimentais de Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. , Science Publishers Inc. Enfield. (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Bouchard, K. R., et al. Maintenance and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. , Elsevier. San Diego. (2005).
- Jones, L. D., Davies, C. R., Steele, G. M., Nutall, P. A. The rearing and maintenance of ixodid and argasid ticks in the laboratory. Animal Technology. 39, 99-106 (1988).
- Slovák, M., Labuda, M., Marley, S. E. Mass laboratory rearing of Dermacentor reticulatus ticks (Acarina, Ixodidae). Biologia, Bratislava. 57 (2), 261-266 (2002).
- Rechav, Y., Dauth, J. Development of resistance in rabbits to immature stages of the Ixodid tick Rhipicephalus appendiculatus. Medical and Veterinary Entomology. 1, 177-183 (1987).
- Zacarias do Amaral, M. A., Azevedo Prata, M. C., Daemon, E., Furlong, J. Biological parameters of cattle ticks fed on rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 21 (1), 22-27 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
