Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

Samenvatting

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Samenvatting

De aanwezigheid van ribonucleotides in nucleaire DNA heeft aangetoond dat een bron van instabiliteit van het genoom. De omvang van ribonucleotide opneming kan worden geëvalueerd door de alkalische hydrolyse en gel elektroforese zoals RNA zeer gevoelig voor hydrolyse onder alkalische omstandigheden is. Dit, kan in combinatie met zuidelijke vlekkenanalyse worden gebruikt om te bepalen van de locatie en strand in die het ribonucleotides hebben overgenomen. Echter kan deze procedure is alleen semi-kwantitatieve en niet gevoelig genoeg voor het detecteren van kleine veranderingen in ribonucleotide inhoud, hoewel strand-specifieke zuidelijke vlek indringende de gevoeligheid verbetert. Als een maatregel van een van de meest opvallende biologische gevolgen van ribonucleotides in DNA, kan spontane mutagenese worden geanalyseerd met behulp van een voorwaartse mutatie test. Met behulp van passende reporter genen, kunnen zeldzame mutaties die resulteert in het verlies van functie geselecteerd en algemene en specifieke mutatie kan worden gemeten door het combineren van gegevens uit schommelingen experimenten met het rangschikken van DNA van het gen verslaggever. De fluctuatie-bepaling is van toepassing op een breed scala aan mutagene processen in specifieke genetische achtergrond of groei voorwaarden onderzoeken.

Inleiding

Tijdens de eukaryote nucleair DNA replicatie, zijn ribonucleotides ingelijfd bij het genoom van alle drie belangrijke replicases van DNA, DNA polymerase (Pols) α, ε en δ^1,2. RNase H2-afhankelijke ribonucleotide excisie reparatie (RER³) verwijdert de meerderheid van deze ingesloten ribonucleotides.

Een ribonucleotide in DNA is gevoelig voor hydrolyse, aangezien de hydroxylgroep 2' van de suiker-groep de aangrenzende phosphodiester band, het vrijgeven van één eind met een cyclische fosfaat 2' - 3' en de andere met een 5'-OH⁴kan aantasten. Alkalische omstandigheden kunnen deze reactie aanzienlijk versnellen. Dus, de hydrolyse van ingesloten ribonucleotides tijdens de incubatie in een basisoplossing veroorzaakt fragmentatie van genomic DNA, die kan worden gevisualiseerd door alkalische-agarose de Elektroforese van⁵. Dit DNA kan worden overgebracht naar een membraan en peilden door vlekkenanalyse van de zuidelijke met behulp van strand-specifieke sondes waarmee de inventarisatie van alkali-gevoelige locaties veroorzaakt door ribonucleotides opgenomen in de ontluikende toonaangevende - of achterblijvende-streng DNA, respectievelijk.

In gistcellen ontbreekt RNase H2-activiteit, kan verwijdering van ribonucleotides worden gestart wanneer topoisomerase nicks ik (Top1) DNA op de ingesloten ribonucleotide^6,7. Echter wanneer Top1 cleaves aan de 3'-kant van de ribonucleotide, genereert dit 5'-OH en 2' - 3' cyclische fosfaat DNA einden die vuurvaste aan de regeling. Reparatie, of afwijkende verwerking van deze 'vuile einden' niet kan leiden tot instabiliteit van het genoom. Bovendien, als de incisie binnen een herhaalde DNA-sequentie optreedt, kan het herstelproces leiden tot verwijdering mutaties. Dit is met name problematisch voor tandem herhaalt, waar korte verwijderingen (van tussen twee en vijf basenparen) worden vaak waargenomen bij RNase H2-deficiënte cellen. De schadelijke effecten van de Top1-afhankelijke bij gebrek aan gist RNase H2 activiteit worden verergerd in een polymerase van DNA ε mutant (pol2-M644G) promiscue voor ribonucleotide opneming tijdens ontluikende toonaangevende onderdeel synthese.

Verwerking van ribonucleotides in DNA leidt tot spontane mutaties en deze mutagenese kan worden opgespoord met behulp van passende reporter genen en selecteren voor de begeleidende fenotypische verandering. Een schommeling test of Luria en Delbrück experiment is een van de meest gebruikte methoden voor het meten van de spontane mutatie tarieven met selecteerbare reporter genen^8,9. In gist, kunnen de genen URA3 en CAN1 worden gebruikt als verslaggevers in een voorwaartse mutatie assay, die het mogelijk maakt voor de detectie van alle soorten van de mutaties die leiden het verlies van de genfunctie tot. De spontane mutaties wordt geschat als de mediaan van die waargenomen voor meerdere parallelle culturen gestart vanuit één kolonies zonder mutaties in het doel verslaggever gen. Een gist RNase H2-deficiënte stam zoals rnh201Δ heeft een matig verhoogde totale spontane mutatie tarief dat grotendeels door een verhoogde incidentie van 2-5 bp verwijderingen in tandem veroorzaakt wordt herhalen sequenties. Aldus, volledig karakteriseren de mutagene effecten van ribonucleotides in het genoom, specifieke mutatie tarieven moeten worden bepaald. In dit geval de URA3 of CAN1 verslaggever genen kunnen worden versterkt en sequenced om te bepalen van de soorten en locaties van de mutaties en specifieke mutatie tarieven kunnen worden berekend. Opstellen van mutaties geïdentificeerd in meerdere onafhankelijke URA3 of CAN1 mutanten kan vervolgens worden gebruikt voor het genereren van een mutatie spectrum.

Protocol

1. alkalische hydrolyse en Strand-specifieke zuidelijke vlek (Figuur 1)

1. Celgroei en genomic DNA isolatie
   1. Isoleer genomic DNA gist met behulp van een gist DNA zuivering kit na instructies van de fabrikant. Gebruik de culturen die in de exponentiële fase van groei tussen (optische dichtheid van 0,5) en 1. Resuspendeer de laatste DNA-pellet in 35 mL 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)).
   2. 1 mL van 5 mg/mL RNase A toevoegen aan het DNA en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
   3. Neerslaan van het DNA 0.1 volumes van 3 M Natriumacetaat (pH 5.2) gebruiken en 2.5 volumes van 100% ethanol voor 20 min op ijs.
   4. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet.
   5. Wassen van de pellet tweemaal met 500 mL 70% ethanol. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet.
   6. Droog de pellet op bankje en resuspendeer in 35 ml 1 x TE buffer.
   7. Kwantificeren van de DNA een fluorimeter (Tabel of Materials) met de dsDNA BR Assay kit.
   8. Neerslag van 5 mg van DNA van elk monster met behulp van 0.1 volumes van 3 M Natriumacetaat, pH 5.2 en 2.5 volumes van 100% EtOH voor een totaal volume van 200 mL (Voeg H₂O indien nodig, extra 5 mg van DNA is nodig als de neutrale gel controle nodig is). Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
   9. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet.
   10. Droog de pellet op Bank. Resuspendeer de DNA in 14 mL H₂O.
2. Alkalische hydrolyse en gel elektroforese
   1. Voeg 6 mL 1 M KOH en Incubeer bij 55 ° C gedurende 2 uur.
   2. Incubeer de monsters op ijs gedurende 5 minuten.
   3. Voeg 4 mL 6 x alkaline DNA laden buffer: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0 18% polysucrose (Tabel of Materials), 0,15% broomkresolpurper groen, en 0,25% xyleen cyanol FF.
   4. Een alkalisch gel die uit 1% agarose, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0 bestaat gegoten. Gebruik een kam dat voorziet in 24 mL van DNA-monster worden geladen per rijstrook.
   5. De gel worden uitgevoerd bij kamertemperatuur in 1 x de Elektroforese van de alkalische buffer: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Omvatten een passende DNA grootte markering.
   6. Spin down de buizen kort en laadt de gehele 24 mL monster in de alkalische agarose gel. Electrophorese gedurende 30 minuten bij 30 V, gevolgd door 18-20 h op 10 V.
   7. Neutraliseer de gel voor 2 incubations van 45 min bij kamertemperatuur met zachte agitatie in neutralisatie Buffer I: 1 M Tris-HCl, NaCl van 1,5 M.
   8. Vlek het DNA door inweken de geneutraliseerde gel in 200 mL water met een verdunning van 1/10.000 van de SYBR gouden vlek gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
   9. Visualiseer het DNA met behulp van een UV-transilluminator. Verhoogde alkali-gevoeligheid zorgt ervoor dat het uiterlijk van kleinere DNA-fragmenten, die een hogere dichtheid van herstelde ribonucleotides in DNA⁵aangeeft.
3. Zuidelijke overdracht
   1. Het DNA van de alkalische gel overbrengen naar de positief geladen nylon membraan door capillaire actie¹⁰. Een voorbeeld van hoe deze overdracht kan worden ingesteld is beschikbaar in Sambrook en Russells handmatige¹⁰.
   2. Geniet van de alkalische gel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in alkalische Buffer voor Transfer: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.
   3. De nylon membraan (ontneemt aan de grootte van de gel) kort nat met water, en vervolgens geniet gedurende 5 min. in alkalische Transfer Buffer.
   4. De overdracht-platform door het omkeren van 3 glazen bekers (100 mL) opgericht in een glazen bakken schotel. Dit gerecht moet iets groter dan de grootte van het agarose gel. Stel een glasplaat over bovenkant van hen.
   5. 2 grote stukken van 3 MM CHR chromatografie papier (ontneemt aan de grootte van de breedte van de gel plus langer zijden die over de randen in de buffer reservoir draperen kunnen) draperen over de glasplaat.
   6. Alkaline Transfer Buffer giet de chromatografie papier en de helft vullen de glazen schotel. De bubbels met behulp van een precisiepipet 5 mL glas glad.
   7. Plaats de agarose gel op bovenkant, weer gladstrijken van de bubbels. Alle randen van de gel met parafilm omringen. Giet een kleine hoeveelheid van de alkalische Transfer Buffer op de gel.
   8. Plaats het vooraf doorweekt nylon membraan op de top van de gel. De bubbels glad.
   9. Natte 2 stukjes papier knippen en naar de grootte van het agarose gel. Plaats ze op de top van het membraan, en bubbels gladstrijken.
   10. Plaats een grote stapel papieren handdoeken (knippen tot een formaat iets groter dan de agarose gel) op de top van de overdracht sandwich. Zorgvuldig plaatst een glasplaat bovenop het keukenpapier. Een gewogen object toevoegen aan de bovenkant (een boek met een massa van 400 g werkt goed).
   11. Laat de overdracht gaan 's nachts bij kamertemperatuur.
   12. Zorgvuldig de transfer-stack uit elkaar te halen en geniet van het membraan gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in neutralisatie Buffer II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.
   13. Dwarslijn het DNA aan de geladen nylon membraan met behulp van een UV-crosslinker. Plaats het membraan in de cross-linker en de autocrosslink instelling gebruiken.
4. Zuidelijke sonde voorbereiding
   Opmerking: De hier beschreven voor het detecteren van alkali-gevoelige sites in de ontluikende toonaangevende-versus achterblijvende-onderdeel van de bundel van DNA is gebaseerd op een protocol aanpak publiceerde eerder¹¹. Voor onze experiment, wordt indringende uitgevoerd met het URA3 verslaggever gen die is ingevoegd in een van de twee oriëntaties (OR1 of en2) grenzend aan de oorsprong van de replicatie ARS306 op chromosoom III (figuur 3A). De aanwezigheid van alkali-gevoelige locaties in genomic DNA van gist is een indicator van ribonucleotide opneming, waardoor het gebruik van ribonucleotides als de biomarkers van DNA-polymerase activiteit^12,13,14. Deze aanpak, met behulp van een streefcijfer DNA-sequentie grenzend aan de efficiënte ARS306 oorsprong van replicatie, moet vatbaar voor andere genomic locaties en organisatieonderdelen doelgenen.
   1. PCR-versterken een 520-base paar segment van de URA3 verslaggever gen met behulp van de volgende paar van de primer: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) en URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
   2. Uitvoeren van de PCR-reactie met behulp van 10-20 ng van de genomic DNA van de gist als een sjabloon, 4 μL van elke primer (10 μM stock), 10 μL van 10 x Ex Taq Buffer (Mg^{2 +} plus), 8 μL van dNTP mengsel (elke 2.5 mM), 0,5 μL van Ex Taq Polymerase van DNA (5 U/μl) , en het uiteindelijke volume aan 100 μl met H₂O.
   3. Voer het volgende programma van PCR: 95 ° C gedurende 5 minuten; 30 cycli van 95 ° C gedurende 1 min., 55 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 2 minuten; 72 ° C gedurende 10 minuten en houd bij 4 ° C.
   4. Zuiveren van het PCR-product met behulp van een PCR zuivering kit en elueer de DNA met behulp van 50 mL H₂O. Dit kan nu worden gebruikt als de sjabloon in de radiolabeling reactie.
   5. Gebruik de volgende inleidingen voor strand-specifieke radiolabeling: gebruik URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) voor het visualiseren van DNA die anneals sonde A. Dit komt overeen met het ontluikende toonaangevende streng DNA wanneer URA3 in en2 en de lagging strand DNA is als URA3 in OR1 tnascent. URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) gebruiken voor het visualiseren van ontluikende DNA die anneals sonde B. Dit komt overeen met het ontluikende toonaangevende streng DNA wanneer URA3 is OR1 en ontluikende lagging strand DNA wanneer URA3 in en2 is (Figuur 3).
      1. Uitvoeren van de radiolabeling reactie met behulp van 10-20 ng versterkt URA3 fragment als sjabloon DNA, 2 μL van de primer (10 μM stock), 5 μl van 10 x Ex Taq Buffer (Mg^{2 +} plus), 4 μL van 2.5 mM dNTPs (min dCTP), 5 μl (50 aanbevolen) voor een -³²P-dCTP , 0,5 μL van de Polymerase van het DNA van de ExTaq (5 U/μl) en het uiteindelijke volume naar 50 μl met H₂O. Run het volgende programma voor radiolabeling: 94 ° C gedurende 5 minuten; 25 cycli van 94 ° C voor 1 min, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 5 minuten en houd bij 4 ° C.
   6. Gebruik een G-25 spin kolom te verwijderen designated radioactieve label. Centrifugeer voorafgaand aan toe te voegen het radiolabeled monster, de kolom voor 1 min op 720 x g en removethe buffer door pipetteren. De radiolabeled reactieproduct en Centrifugeer gedurende 2 min op 720 x g tot elueer de gelabelde sonde laden.
   7. Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min te denatureren van de sonde onmiddellijk voorafgaand aan de hybridisatie. Cool kort op ijs.
5. Zuidelijke hybridisatie
   1. Het wordt bevochtigd membraan rollen in een kruising buis en voeg 25 mL vers bereide hybridisatie buffer: 0,5 M natriumhydroxide fosfaatbuffer, pH 7,2, 7% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 1% bovien serumalbumine (BSA). Incubeer bij 65 ° C gedurende 1-2 h met rotatie in een oven van hybridisatie.
   2. Zorgvuldig giet af de oplossing en voeg 25 mL hybridisatie buffer plus de hoeveelheid radioactief gemerkte sonde. Incubeer bij 65 ° C gedurende 16-18 h met rotatie.
   3. Giet af de oplossing in een radioactieve afval container. Uitvoeren van 5 wasbeurten van 5 minuten bij kamertemperatuur met fosfaat-SDS wassen oplossing I: 40 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, pH 8,0.
   4. Uitvoeren van 2 wasbeurten van 15 min bij 65 ° C met fosfaat-SDS wassen oplossing II: 40 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.
   5. Verwijder het membraan van de buis van de kruising met pincet en plaats in een geopende plastic hoes beschermer. Cover en bloot te stellen aan een imaging plaat. Probeer een aantal verschillende blootstellingstijden variërend van 4 h tot en met 4 d.
   6. Indien nodig, strippen en opnieuw sonde de vlek met een verschillende sonde ongeveer 3 - 4 keer. Incubeer het membraan gedurende 2 uur bij 65 ° C in 25 mL van een 50% formamide, 2 x SSPE oplossing om te strippen.
      Opmerking: 20 x SSPE stockoplossing: 3 M NaCl, 0,2 M NaH₂PO₄, 0,02 M EDTA, pH 7.4.
   7. Giet af de oplossing in een radioactieve afval container. 2 wasbeurten van 15 min bij 65 ° C in fosfaat-SDS wassen oplossing II uitvoeren.
   8. Controleer het membraan met een geigerteller en herhaal het strippen protocol als signaal blijft.
   9. Pre kruising en kruising uitvoeren zoals hierboven beschreven.

2. meten van mutaties en specificiteit bij S. cerevisiae stammen

1. Voorbereiden van de cultuur van de cel
   1. Inoculeer een één kolonie (gezonde gist cellen neemt 2-3 dagen bij 30 ° C tot vorm juiste formaat kolonies) geteeld op YPD agar aangevuld met 100 mg/mL adenine in 5 mL van YPDA Bouillon aangevuld met 250 mg/mL adenine (de suppletie van adenine is alleen nodig als de stam is een adenine-auxotroph). Groeien in een shaker incubator of op een rotator bij 30 ° C tot de cultuur verzadiging (36-48 h voor een stam zonder een ernstige groei defect bereikt).
   2. Spin down de cellen bij ~ 2000 x g gedurende 5 min.
   3. Verwijder het supernatant en wassen van de cellen met 5 mL steriel water.
   4. Resuspendeer de cellen in 500 mL steriel water.
2. Verdunning van de celcultuur en beplating
   1. Verdun de cellen in een 96-wells-plaat met een factor van 1.600.000 en plaat 100 mL elke cultuur op een volledige (COM)-bord voor niet-selectie besturingselementen.
   2. Schakel voor ura3 mutanten, plaat 100 mL onverdund cellen op een bord van 5-FOA voor een spanning van wild-type (WT). Verdun de cellen dienovereenkomstig als de mutatie van de stam van belang naar verwachting hoger zijn dan bij een WT-stam.
   3. Schakel voor can1 mutanten, Verdun de cellen 5-voudig en plaat 100 mL op een plaat canavanine-bevattende (CAN) voor een WT-stam. De verdunningsfactor is 0,5.
   4. Incubeer de platen bij 30 ° C tot gist kolonies vormen. Voor stammen zonder een groei defect, 2-3 dagen is meestal voldoende voor COM en kan platen en 3-5 dagen voor 5-FOA platen. Om te vergelijken de mutatie tarieven tussen verschillende stammen, is het het beste om te kiezen van dezelfde dag van groei te tellen kolonies. Bewaar de platen klaar om te worden geteld in de koude kamer (~ 4 ° C).
3. Berekening van spontane mutaties
   1. Zichtbare kolonies op elke plaat tellen en neem daar nota van kolonie getallen
   2. Bereken het percentage van de mutatie met behulp van Drake's formule: μ = f ÷ ln (μNt). f is de mutatiefrequentie berekend door het aantal mutanten gedeeld door het aantal cellen in de laatste cultuur. NT is het aantal cellen in de laatste cultuur en μ is de mutaties. Deze vergelijking kan worden opgelost door een iteratieve methode zoals de Newton-Raphson methode. Er zijn andere methoden van de schatter, inclusief de Lea en Coulson test, voor de berekening van de mutatie tarief¹⁵.
   3. Bereken de betrouwbaarheidsinterval uitgaande logboek normaalverdeling van de utation tarieven van individuele isolaten. De 95%-betrouwbaarheidsinterval wordt meestal gebruikt.
4. Analyse van mutatie spectrum
   1. Kies een één kolonie van elke 5-FOA of kunt plaat en vernieuw op een plaat van YPDA.
   2. Uitvoeren van PCR te versterken van de URA3 of CAN1 gen en de volgorde om op te sporen met behulp van de volgende inleidingen mutaties van de kolonie: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') en URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') voor beide PCR versterking en rangschikking van de 800 bp URA3 gen; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') en CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') voor versterking en CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') en CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') voor het rangschikken van de 1800 bp CAN1 verslaggever gen.
   3. Voor het uitvoeren van PCR van de kolonie, resuspendeer een één kolonie in 5 μL van H₂O en 1 μL gebruiken als sjabloon. Voeg 1 μl van elk van de inleidingen (5 μM stock), 2 μL van 5 x KAPA2G Buffer (Mg^{2 +} plus), 0,5 μL van dNTP (2,5 mM), 0,5 μL van KAPA2G snel Polymerase van DNA, 12 μL van H₂O.
   4. Voor de versterking van URA3 gen, voer het volgende programma van de PCR: 95 ° C gedurende 5 minuten; 5 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 30 s; 35 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 30 s; 72 ° C gedurende 2 min en houd bij 4 ° C. Voor de versterking van CAN1 gen, voer het volgende programma van de PCR: 95 ° C gedurende 5 minuten; 5 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 45 s; 35 cycli van 95 ° C voor 10 s, 61 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 45 s; 72 ° C gedurende 2 min en houd bij 4 ° C.
   5. Hiermee lijnt u de reeksnummers resultaten in een referentie-reeks met een programma zoals DNASTAR Seqman Pro of Sequencher te identificeren van mutaties.
   6. Het compileren van de gegevens van de mutaties door mutatie type (Figuur 4) of mutatie locatie (Figuur 5). Bereken de specifieke mutatie tarieven door de frequentie van een mutatie (het aantal gebeurtenissen waargenomen gedeeld door aantal mutanten sequenced) vermenigvuldigd met de algehele mutaties.

Resultaten

Behandeling van genomic DNA met alkali gevolgd door alkalische gelelektroforese zorgt voor semi-kwantitatieve opsporing van de fragmentatie van DNA wegens de overvloed van stabiel opgenomen ribonucleotides. Figuur 2 toont de beelden van de gel van gist genomic DNA behandeld met of zonder KOH⁵. De M644L variant van de Pol2, de katalytische subeenheid van Polε, heeft de mogelijkheid om op te nemen ribonucleotides terwijl de mutant M644G ...

Discussie

Hier beschrijven we de protocollen voor twee sets van experimenten die vaak gebruikt worden voor het analyseren van semi-kwantitatief ribonucleotides tijdens de replicatie van DNA en de mutagene effecten van herstelde ribonucleotides opgenomen. Hoewel deze benaderingen de eukaryote model S. cerevisiae betrekken, kunnen deze technieken gemakkelijk worden aangepast aan andere microben en zelfs hogere eukaryoten.

Indringende voor herstelde ribonucleotides in DNA met behulp van alkalische...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
YPD media			20 g dextrose, 20 g peptone, 10g gistextract, in gedeïoniseerd H2O tot 1 L, voeg 20 g Bacto agar toe voor vaste media, autoclaveer.
COM platen			1,3 g SC dropout mix, 1,7 g giststikstofbasis zonder aminozuren of (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar gedeïoniseerd H2O tot 1 L. Pas pH aan tot 5,8. Autoclaveer en 30 – 35 ml per plaat.
CAN platen			1,3 g SC-Ura dropout poeder, 1,7 g giststikstofbasis zonder aminozuren of (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil en H2O tot 1 L. Autoclaveer gedurende 15 minuten bij 121 °C en laat afkoelen tot 56 °C. Voeg 6 mL van filter-gesteriliseerd 1% canavanine sulfaat oplossing toe.
5-FOA platen			1,3 g SC-Ura dropout poeder, 1,7 g giststikstofbasis zonder aminozuren of (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil en H2O tot 800 mL. Autoclaveer gedurende 15 minuten bij 121 °C en laat afkoelen tot 60 °C. Voeg 200 mL van filter-gesteriliseerd 0,5% 5-FOA oplossing toe.
L-Canavanine sulfaat	US Biological	C1050
5-FOA	US Biological	F5050
20 mL glazen kweekbuis			Elk merk
Cultuurrotator in 30 °C incubator			Schudkubator kan in plaats daarvan worden gebruikt
96 wel ronde bodemplaten			Steriele, elk merk
3 mm glazen kralen	Fisher Scientific	11-312A	Autoclaveer voor gebruik
12-kanaals pipetten			Elk merk
Ex Taq DNA Polymerase	TaKaRa	RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit	Epicenter	MPY80200
3 M natriumacetaat	Sigma-Aldrich	S7899
100% ethanol
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866	Nieuwere model beschikbaar
dsDNA BR Assay kit	Invitrogen	Q32850
KOH	Sigma-Aldrich	221473
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Ficoll 400	Dot Scientific Inc.	DSF10400
Bromocresol groen	Eastman	6356
Xyleen cyanine FF	International Technologies Inc.	72120
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
1 M Tris-HCl (pH 8,0)	Teknova	T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494
UV transilluminator
Amersham Nylon membraan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B
3 MM CHR chromatografiepapier	Whatman	3030-392
NaCl	Caledon	7560-1
Stratalinker 1800	Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
G-25 spinkolom	GE Healthcare	27-5325-01
1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2)	Sigma-Aldrich	NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)
SDS	Sigma-Aldrich	L4522
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
Geigerteller