Methodenartikel

Het gebruik van de muis Splenocytes om te beoordelen van de pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon invloed op klok genexpressie

6.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58022

⸱

24 juli 2018

1Department of Biology, University of Hartford

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een techniek met behulp van de muis splenocytes te ontdekken van de pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen die veranderen van moleculaire klok genexpressie.

Samenvatting

Van gedrag naar genexpressie reguleren circadiane ritmen bijna alle aspecten van de fysiologie. Hier presenteren we een methodologie om te vechten muis splenocytes met de pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), ODN1826 en warmte-gedood Listeria monocytogenes en onderzoeken van hun effect op de moleculaire circadiane klok. Eerder, hebben studies gericht op het onderzoeken van de invloed van LPS op de moleculaire klok met behulp van een verscheidenheid van in vivo en ex vivo benaderingen uit een assortiment van modellen (bijvoorbeeld, muis, rat en mens). Dit protocol beschrijft de isolatie en de uitdaging van splenocytes, evenals de methodologie voor de beoordeling van de klok gen expressie na uitdaging via kwantitatieve PCR. Deze benadering kan worden gebruikt om te evalueren van niet alleen de invloed van microbiële onderdelen op de moleculaire klok maar ook andere moleculen die expressie van de klok kan veranderen. Deze aanpak kan worden gebruikt om de plagen uit elkaar het moleculaire mechanisme van hoe PAMP-Toll-like receptor interactie klok expressie beïnvloedt.

Inleiding

De master klok in zoogdieren, die 24u oscillaties voor bijna alle aspecten van de Fysiologie en gedrag regisseert, is gelegen in de kern (SCN) van de suprachiasmatic van de hypothalamus1,2. Naast het reguleren van biologische processen op een organisch niveau, synchroniseert de master klok ook perifere cellulaire klokken in heel het lichaam3,4,5. Terwijl de moleculaire klok machine uit ten minste drie elkaar grijpende transcriptionele-translationeel feedbacklussen bestaat, de kern bestaat uit de periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, en klok genen6,7. Naast het behoud van de precieze timing van de kern moleculaire klok, sommige bijkomende klok genproducten (bijvoorbeeld Rev-erbα en Dbp) regelen ook expressie van genen die niet-klok, dat wil zeggen, klok gecontroleerde genen (CCGs)6 , 7.

Functionele moleculaire klokken zijn beschreven in de diverse immuun weefsels (bijvoorbeeld, milt en lymfklieren)8 en cellen (bijvoorbeeld B cellen, dendritische cellen, macrofagen)8,9. Deze cellen detecteren en inspelen op de pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), geconserveerde microbiële componenten, via receptoren van het aangeboren immuun erkenning zoals Toll-like receptoren (TLRs)10. Tot op heden, zijn 13 functionele TLRs beschreven, die microbiële bestanddelen zoals bacteriële celwand onderdelen, flagellar eiwitten en nucleïnezuren microbiële10herkennen. De PAMP, lipopolysaccharide (LPS), een onderdeel van de celwand van gram-negatieve bacteriën herkend door TLR4, heeft aangetoond dat het circadiane ritmen op zowel organisch en moleculaire niveau wijzigen. Bijvoorbeeld, in vivo uitdaging van LPS geïnduceerde fotische-achtige fase vertragingen zoals gemeten door activiteit in muizen11 en heeft geleid tot verminderde klok genexpressie in de SCN en de lever in situ hybridisatie en kwantitatieve PCR, volgens respectievelijk in ratten12. Na een in vivo uitdaging met LP's bleek de analyse van perifere bloed leukocyten13 en onderhuids vetweefsel14 veranderde expressie van verschillende klok genen zoals gemeten via qPCR. Tot slot, ex vivo LPS uitdagingen van menselijke macrofagen en muis peritoneale macrofagen, ook geleid tot gewijzigd klok expressie zoals gemeten door qPCR14.

Hier beschrijven we een protocol voor de beoordeling van de invloed van de PAMPs LP's, ODN1826 (synthetische oligonucleotides met unmethylated apr motieven), en warmte-gedood Listeria monocytogenes (HKLM), erkend door TLR4, TLR9 en TLR2, respectievelijk op moleculaire klok genexpressie in muis splenocytes. Het protocol bevat muis splenectomie, splenocyte isolatie en uitdaging, RNA extractie, cDNA synthese en qPCR om te beoordelen van de expressie van genen die verschillende klok. Dit protocol zorgt voor de tijdige verwerving van een groot aantal immuuncellen met zeer weinig dier of cellulaire manipulatie, die vervolgens kan worden uitgedaagd ex vivo met verschillende PAMPs. De moleculaire klok is aangetoond dat het moduleren van de verschillende aspecten van de immuunrespons8,15,16, verstoring van de moleculaire klok zou daarom waarschijnlijk afbreuk doen aan de correcte tijd-afhankelijke variant van de immuunrespons. Bovendien, aangezien onderbrekingen van de circadiane ritmen tot ernstige pathologieën17,18,19,20 leiden kunnen, kan het interessant zijn voor onderzoekers aan te vechten van splenocytes met een breed scala aan moleculen en hun invloed op de klok te beoordelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Tijdens de studie, verzorging van de dieren en behandeling National Institutes of Health beleid nageleefd, waren overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele en door de Universiteit van Hartford institutionele dierlijke dierenverzorgers en gebruik Comité zijn goedgekeurd.

1. entrainment van dieren

Opmerking: Twintig weken oude mannelijke B6129SF2/J muizen worden gebruikt in de studie.

  1. Later muizen tot een lichte 12 h (standaard overhead wit licht) / 12u donker cyclus voor 2 weken voorafgaand aan het experiment.
    Opmerking: Hier zeitgeber tijd (ZT) 0 correspondeert met lampjes op te ZT12 lichten uit, terwijl alle andere omgevingsfactoren (d.w.z., voedsel, water en kamertemperatuur) constante 21.

2. voorbereiding van de instrumenten, kweekmedium en uitdaging Medium

  1. Autoclaaf pincet en ontleden schaar. Wikkel paren voor matte Microscoop slides in aluminiumfolie en autoclaaf.
  2. Voorbereidingen treffen voor RPMI 1640 kweekmedium door foetale runderserum (FBS) toe te voegen aan een eindconcentratie van 10%. Bereiden van 10 mL voor uitdaging medium in 50 mL buizen door toevoeging van de volgende PAMPs aan het kweekmedium (RPMI met 10% FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Listeria monocytogenes warmte-gedood (108 HKLM/mL), of een andere PAMP in de voorgestelde concentratie.
  3. Warme kweekmedium en uitdaging middellange tot 37 ° C in een waterbad, en ongeveer 70 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,2) houden bij kamertemperatuur.
  4. Voeg 10 mL gestolde voedingsbodem met behulp van een pipet 10 mL en Pipetteer hulp aan een tube 50 mL en plaats op ijs.
  5. Ongeveer 30 mL ethanol 70% toevoegen aan een 100 mL bekerglas en plaats de uiteinden van het ontleden van schaar en pincet af in het bekerglas om microbiële besmetting te voorkomen.
  6. Voorbereiden op lysis-buffermengsel RNA isolatie door 10 µL β-Mercaptoethanol (onder een zuurkast) toe te voegen aan elk 1 mL Buffer RLT in een tube van 50 mL. Maakt alleen het bedrag dat nodig (600 µL per monster, die bestaat uit ongeveer 1 x 106 cellen).
    Opmerking: De Buffer RLT is een onderdeel van het RNA extractie kit die ondersteuning biedt voor de binding van RNA aan het membraan van siliciumdioxide.

3. Splenocyte isolatie en uitdaging

  1. Euthanaseren muizen tegelijk een bepaald zeitgeber via versuffing door ze te houden in hun oorspronkelijke kooi en CO2 toe te voegen aan de kooi op een debiet van 3 L/min. doorgaan leveren CO2 voor 1 min na de ademhaling stopt.
  2. Dood via cervicale dislocatie bevestigen door het plaatsen van de duim en wijsvinger aan beide zijden van de hals aan de basis van de schedel. Alternatief, drukt u op een staaf op de onderkant van de schedel terwijl snel trekken (met behulp van de andere kant) de basis van de staart of de achterste ledematen tot scheiding van de nekwervels van de schedel22.
  3. Spray de romp van de muis met 70% ethanol en veeg met een papieren handdoek. Plaats de muis op haar rug en enigszins schuin op de rechterkant. Knippen weg de vacht, met behulp van ontrafeling van schaar, langs de linker kant van de muis, over halverwege tussen de voor- en achterbenen.
  4. Gebruik pincet, grijpen het buikvlies en zorgvuldig een insnijding om niet te beschadigen de milt. Milt verwijderen met pincet en leg in een tube van de steriele 50 mL met ongeveer 10 mL van voedingsbodems op ijs. Herhaal voor de resterende dieren.
    Opmerking: De milt is de kleur van een bonen, en het is langer en platter dan de nier.
  5. Een milt met 2 mL gestolde voedingsbodem overbrengen in een kleine steriele petrischaal.
    1. Meng de milt door het slijpen tussen de berijpte gedeelte van twee steriele berijpte dia's. Indien mogelijk, houden de afgifte en de cellen in het medium tijdens het proces van homogenisering.
    2. Eenmaal grondig gehomogeniseerd, Pipetteer de 2 mL kweekmedium dat de splenocytes door een 40 µm nylon cel zeef in een tube van 50 mL.
    3. Herhaal de bovenstaande stappen voor de resterende milt met behulp van nieuwe paren van Matte dia's, 50 mL tubes met kweekmedium, en zeven van de cel.
  6. Voeg 8 mL koude kweekmedium aan elk van de 50 mL tubes met de splenocytes voor een totaal volume van 10 mL/buis. Bepaal het aantal cellen per milliliter met behulp van een hemocytometer.
  7. Ongeveer 1 x 106 cellen/well aan 6-well cultuur platen toevoegen. Cellen toevoegen aan het aantal putten die overeenkomen met het aantal verschillende PAMPs worden gebruikt voor het experiment en een besturingselement bevatten goed. Voeg 3 mL gestolde voedingsbodem of 3 mL van uitdaging medium aan de respectieve putjes.
  8. Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 3 uur.
  9. Schraap de cellen vanaf de onderkant van de goed het gebruik van een 1.000 µL Pipetteer tip gekoppeld aan een micropipet P1000. Breng het medium met de cellen met de zelfde 1.000 µL Pipetteer tip om een tube van 15 mL.
  10. Pellet de cellen via centrifugeren bij 167 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en wassen van de cel pellet met 5 mL PBS.
  11. Pellet de cellen een tweede keer bij 167 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en 600 µL van lysis buffer aan de cel pellet toevoegen om lyse de cellen. Gaat u verder met RNA isolatie.

4. RNA isolatie en cDNA synthese

  1. Isoleren van RNA van splenocytes met behulp van het RNA extractie kit volgens de instructies van de fabrikant en het uitvoeren van de 'optioneel' op-kolom DNA spijsvertering.
  2. Bepalen voorafgaand aan cDNA synthese, RNA concentratie met behulp van een spectrofotometer microvolume om te controleren of de concentratie binnen het optimale RNA bereik (maximaal 2 µg) van de cDNA synthese kit.
  3. Synthesize cDNA voor elk van de monsters met behulp van de omgekeerde transcriptie kit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik 10 µL van RNA voor elk van de monsters in een volume van 20 µL totale reactie. Bij de voltooiing van de omgekeerde transcriptie (thermocycler uitvoeren) toevoegen 20 μL H2O naar elke reactie.
  4. Construeer de standaard gebogen met behulp van een micropipet P10 of P20 voor het bundelen van mRNA van een paar controlemonsters (bijvoorbeeld 5 µL van 2 monsters voor een totaal van 10 µL) in een 0,5 mL-buis te bereiden cDNA.
    1. Voeg 10 µL 2 x master mix van reverse-transcriptase.
    2. Bij de voltooiing van de omgekeerde transcriptie, voeg toe 10 µL van H2O aan de reactiebuis, die zal fungeren als de beginconcentratie ("1") in de verdunningsreeks voor de standaard curve.
    3. Het uitvoeren van een verdunningsreeks van 10-fold (1 tot en met 10-4) door het toevoegen van 45 µL van water met behulp van een P100 of P200-micropipet in vier 0,5 mL buizen aangewezen 10-1, 10-2, 10-3en 10-4.
      1. Voeg 5 µL van de beginconcentratie "1" in de eerste buis (10-1) met behulp van een micropipettor P20, Meng door omhoog en omlaag pipetteren meerdere malen, vervolgens overdracht 5 µL van de 10-1 buis in de buis aangewezen 10-2 en mix.
      2. Breng 5 µL met behulp van een micropipet P20 uit de 10-2 -buis in de buis 10-3 aangewezen en meng. Breng 5 µL met behulp van een micropipettor P20 uit de buis 10-3 in de buis 10-4 aangewezen en meng.

5. kwantitatieve Polymerase-kettingreactie (qPCR)

  1. Relatieve kwantificatie van mRNA niveaus bepalen door qPCR. Binnen de experimentele instellen, selecteert u "Quantitation - relatieve standaard Curve" en "TaqMan" chemie. Verandering van het volume van de reactie op 10 µL. voert de relevante gegevens in de indeling van de plaat (b.v., doel-gen, standaard curve, verslaggever, enz.).
  2. De reactie voor te bereiden zodat het bevat 0,5 µL van de primer/probe assay, 5 µL van gen expressie master mix, 2 µL van H2O en 2.5 µL van cDNA (10-100 ng).
    1. Bereiden een master mix door elk van de voorgaande reagentia (behalve de cDNA) te vermenigvuldigen met het aantal reacties, ervoor zorgend om omvatten die uit de standaard curve, negatieve controles, uitvoeren van elke reactie in tweevoud en 2 extra reacties die zal rekening pipetting variatie.
    2. Pipetteer 7.5 µL van het mengsel bereid master in vooraf bepaalde putten in een reactie van de 96-wells-plaat met een micropipet of een meerkanaalspipet. Pipetteer 2.5 µL van cDNA in de passende put voor de onbekenden en normen, en 2,5 µL van H2O in de negatieve controle putten.
    3. Primer/sonde testen voor verschillende moleculaire klok genen omvatten, en ook een bepaling voor een endogene besturingselement (bijvoorbeeld β-actine).
  3. Relatieve expressie waarden bepalen, berekent de gemiddelde relatieve hoeveelheid voor elke repliceren en vervolgens, voor elk monster, verdelen de gemiddelde relatieve hoeveelheid voor het target-gen door de gemiddelde relatieve hoeveelheid voor β-actine.

6. statistische analyse

  1. Met behulp van statistische analysesoftware, gegevens invoeren in het programma onder de optie kolom statistieken. Selecteer een one-way ANOVA met de Dunnett van post hoc test te beoordelen van de verschillen tussen de gemiddelden van de klok genexpressie na PAMP uitdaging ten opzichte van het besturingselement.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Muizen werden geofferd op ZT13 en splenocytes werden geïsoleerd uitgedaagd ex vivo met de PAMPs LP's, ODN1826 of HKLM. Na 3U, RNA werd geïsoleerd, en qPCR werd gebruikt voor de beoordeling van de niveaus van de relatieve uitdrukking van de genen van de moleculaire klok klok, Per2, Dbp, en Rev-erbα in vergelijking tot de onbetwiste controle cellen. Na PAMP uitdaging waren klok expressie niveaus niet beduidend anders dan de expressie in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Binnen dit protocol, kan een spectrofotometer microvolume worden gebruikt om te kwantificeren en beoordelen van de zuiverheid van het RNA wordt gebruikt bij het bepalen van de genexpressie. Nucleïnezuren absorberen UV-licht op 260 nm, eiwitten absorberen meestal licht op 280 nm, terwijl andere potentiële verontreinigingen gebruikt tijdens een RNA extractie procedure (bijv . fenol) aantoonbaar op 230 nm. Dus, door beoordeling van de extinctie (A) verhouding op 260/280 nm (RNA naar eiwitten) en 260/230 nm (RNA voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door onderzoek van de faculteit van de College of Arts and Sciences Dean's kantoor aan de Universiteit van Hartford verleent.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Frosted slidesFisher12-550-343
Cell strainersFisher22363547
Lipopolysaccharide InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 or 74106
RNase-Free DNase SetQiagen79254
6-well cell culture plateDenvilleT1006
50 mL tubesCorning352070
15 mL tubesCorning352097
High Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermoFisher4368814
TaqMan Gene Expression Assays b-actinThermoFisherMm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assays Per2ThermoFisherMm00478113_m1
TaqMan Gene Expression Assays Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
TaqMan Gene Expression Assays Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
TaqMan Gene Expression Assays DbpThermoFisherMm00497539_m1
qPCR machine StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher4369016
MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL)ThermoFisher4346907
Statistical Analysis SoftwarePrism 7.0a

Referenties

  1. Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
  2. Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
  3. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  4. Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  6. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
  7. Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
  8. Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
  9. Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
  10. Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
  11. Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
  12. Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
  13. Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
  14. Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
  15. Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
  16. Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
  17. Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
  18. Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
  19. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
  20. Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
  21. Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
  22. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
  23. Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
  24. Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579(2018).
  25. Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van miltcellenPAMP stimulatiekwantitatieve PCRmuismiltRNA extractiereverse transcriptiecel telling met hemocytometerLPS ODN1826circadiane ritme

Gerelateerde artikelen