Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58028

⸱

11 december 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Neurobiology, Neuroscience Program, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), L'Hospitalet de Llobregat, 2Department of Pathology and Experimental Therapy, School of Medicine, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 3Institute of Neurosciences, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel in vivo. We beschrijven methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven bij fokken normaal of na blessure.

Samenvatting

Xenopus kikkervisjes bieden een uniek platform voor het onderzoek naar de functie van het zenuwstelsel. Zij bieden meerdere experimentele voordelen, zoals toegankelijkheid van talrijke imaging benaderingen, elektrofysiologische technieken en gedrags testen. Het Xenopus tadpole olfactorische systeem is bijzonder goed geschikt voor onderzoeken van de functie van synapsen gevestigd tijdens normale ontwikkeling of hervormd na blessure. Hier beschrijven we methodologieën voor evaluatie van de verwerking van olfactorische informatie in levende Xenopus larven. We schetsen een combinatie van in vivo metingen van exocytose calcium reacties in de glomeruli van de bulbus olfactorius met olfactorische geleide gedrag testen. Methoden kunnen worden gecombineerd met het transect van bulbus zenuwen te bestuderen de bedrading van synaptic connectiviteit. Experimenten zijn gepresenteerd met behulp van zowel wild-type en genetisch gemodificeerde dieren uiten GFP verslaggevers in cellen van het centrale zenuwstelsel. Toepassing van de methoden beschreven om genetisch gemodificeerde kikkervisjes kan nuttig zijn voor het ontrafelen van de moleculaire grondslagen die gewervelde gedrag definiëren.

Inleiding

Xenopus kikkervisjes vormen een uitstekende diermodel om te bestuderen van de normale functie van het zenuwstelsel. Transparantie, een volledig gesequenceerd genoom1,2, en de toegankelijkheid van chirurgische, elektrofysiologische en imaging technieken zijn unieke eigenschappen van Xenopus larven waarmee onderzoeken neuronale functies in vivo3 . Enkele van de meerdere experimentele mogelijkheden van deze diermodel worden geïllustreerd door de grondige studies uitgevoerd op tadpole sensorische en motorische systemen4,5,6. Een bijzonder geschikt neuronale circuit te bestuderen van vele aspecten van informatie verwerking op het niveau van synapsen is de Xenopus tadpole olfactorische systeem7. In de eerste plaats de synaptische verbinding is goed gedefinieerd: olfactorische receptor neuronen (ORNs) naar de bulbus olfactorius project en synaptische contacten leggen met dendrites van mitralisklep/getuft cellen binnen de glomeruli geur kaarten. Ten tweede, zijn ORNs worden voortdurend gegenereerd door neurogenese gedurende het hele leven te handhaven van de functionaliteit van olfactorische trajecten8. En ten derde omdat de olfactorische systeem een groot regeneratieve vermogen blijkt, Xenopus kikkervisjes kunnen hun bulbus olfactorius na ablatie9volledig te hervormen.

In deze paper beschrijven we benaderingen die beeldvorming van olfactorische glomeruli in levende kikkervisjes met gedrags experimenten combineren te bestuderen van de functionaliteit van olfactorische trajecten. De hier gedetailleerde methoden werden gebruikt om de studie van het functionele herstel van de glomerulaire connectiviteit in de bulbus olfactorius na bulbus zenuw transect10. Gegevens die zijn verkregen in Xenopus kikkervisjes representatief zijn voor gewervelden omdat olfactorische verwerking evolutionaire is bewaard.

De beschreven methoden zijn geïllustreerd met behulp van X. tropicalis , maar ze kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd in X. laevis. Ondanks de grotere omvang van de volwassen X. laeviszijn beide soorten opvallend vergelijkbaar tijdens tadpole stadia. De belangrijkste verschillen bevinden zich op het genomisch niveau. X. laevis geeft arme genetische werkwillig, meestal bepaald door haar allotetraploid genoom en de lange generatietijd (ongeveer 1 jaar). Is daarentegen meer vatbaar voor genetische modificaties vanwege de kortere generatietijd (5 tot 8 maanden) en diploïde genoom X. tropicalis . De representatieve experimenten worden geïllustreerd voor wild-type dieren en drie verschillende transgene lijnen: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) en tubb2:GFP (X. laevis).

De methoden die worden beschreven in de lopende werkzaamheden moeten naast de genetische vordert in het veld Xenopus worden beschouwd. De eenvoud en de eenvoudige implementatie van de technieken gepresenteerd maakt ze bijzonder nuttig voor de evaluatie van de reeds beschreven mutanten11, evenals Xenopus regels gegenereerd door CRISPR-Cas9 technologie12. Ook beschrijven we een chirurgische ingreep gewend transect bulbus zenuwen die kunnen worden uitgevoerd in een laboratorium dat die toegang hebben tot Xenopus kikkervisjes. De benaderingen gebruikt voor de evaluatie van de reacties van de presynaptische calcium en olfactorische geleide gedrag vereisen specifieke apparatuur, zij beschikbaar op een matige kosten. Methoden worden gepresenteerd in een eenvoudig formulier ter bevordering van het gebruik ervan in de onderzoeksgroepen en de grondslagen van meer complexe tests kon instellen door het implementeren van verbeteringen of door de associatie met andere technieken, dat wil zeggen, histologische of genetische benaderingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van het dierlijke onderzoek aan Universiteit van Barcelona.

Opmerking: De kikkervisjes van X. tropicalis en X. laevis worden gefokt volgens de standaardmethoden13,14. Tadpole water wordt bereid door commerciële zouten (Zie Tabel van materialen) toe te voegen aan water verkregen door omgekeerde osmose. Geleidbaarheid wordt aangepast aan de ∼700 µS en ∼1, 400 µS voor X. tropicalis en X. laevis kikkervisjes, respectievelijk. Larven kunnen worden verkregen door natuurlijke paring of bevruchting in vitro14. Embryo's zijn dejellied met 2% L-cysteïne bereid in 0.1 x Marc's bewerkt Ringers (BMR). 1 x MMR bevat (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. Larven worden overgedragen na 2-3 dagen (fase 25) naar 2 L tanks met tadpole water. Wanneer de kikkervisjes bereiken fase 40 van de Nieuwkoop-Faber (NF) criteria15, ze zijn geplaatst in 5 L tanks en onderhouden bij een dichtheid van 10 dieren/L. temperatuur constant bij 23-25 ° C en 18-20 ° C wordt gehouden voor X. tropicalis en X. laevis kikkervisjes, respectievelijk. Dieren gevonden in stadia 48-52 van de NF-criteria worden gebruikt voor experimenten.

1. transect van bulbus zenuwen

  1. Bereid een anesthetizing oplossing van 0,02% MS-222 in 50 mL tadpole water op kamertemperatuur.
  2. Voorbereiden van een kleine tank (1-2-L) met tadpole water dat herstel van de dieren na de operatie.
  3. Knip rechthoekige stukken van cellulose kwalitatief filtreerpapier (4 cm x 3 cm, Zie Tabel van materialen).
  4. 2 stuks van cellulose kwalitatief filtreerpapier in 0.02% MS-222 oplossing NAT en plaats ze onder de ontleden.
  5. Kies een tadpole uit de tank en het onderdompelen in de anesthetizing oplossing. Het dier stopt met zwemmen binnen 2-4 min en reageert niet op mechanische stimuli toegepast op het niveau van de staart met pincet.
  6. Plaats de narcose tadpole op de rechthoekige stukken filtreerpapier. Plaats het dier met de dorsale zijde naar boven gericht, zodat de breinstructuur kunnen worden gevisualiseerd.
    1. Met behulp van vannas-schaar (Zie Tabel van materialen) snijden één of beide bulbus zenuwen (afhankelijk van het type test uit te voeren). Transect een enkele zenuw voor experimenten die een interne controle van zenuw schade vereisen.
    2. Transect voor gedrags experimenten, beide zenuwen te onderdrukken van alleinformatie odorant aankomst naar de bulbus olfactorius. De efficiëntie van het segmenteren van bulbus zenuwen kan gemakkelijk worden waargenomen onder de ontleden; pigmentatie of dier positie kan echter factoren beperken.
      Opmerking: (Optioneel) De beste manier om te certificeren van de geldigheid van de procedure is het gebruik van transgene kikkervisjes die uitdrukking geven aan fluorescerende verslaggevers op hun zenuwstelsel (Zie representatieve resultaten). Voor dit doel moet het gebruik van een scope van de dissectie uitgerust met fluorescentie (Figuur 1). Als alleen wild-type dieren beschikbaar zijn, kan traceren met CM-diI worden toegepast. Volg protocol 2 (zie hieronder) om te injecteren een 0,5 mg/mL oplossing van CM-diI bereid in 0,3 M sacharose in de nasale capsule. Zie 16 voor details over de voorbereiding en de opslag van CM-diI. Lekkage van kleurstof uit de belangrijkste Holte moeten worden minimaliseren. Voor dit doel is het noodzakelijk om de druk van de injectie en de opening van micropipetten te wijzigen. Fluorescentie op het niveau van de glomerulaire laag van de bulbus olfactorius wordt duidelijk 24u na toepassing van CM-diI. Het huidige werk maakt gebruik van labelen met CM-diI gewoon te certificeren van de transect procedure; Deze methode kan echter ook morfologische informatie verkrijgen van olfactorische glomeruli met behulp van conventionele histologische procedures worden gebruikt.
  7. Dieren overbrengen in de herstel-tank. Kikkervisjes moeten herstellen normale zwemmen binnen ~ 10 min. een zorgvuldige inspectie op de aanwezigheid van bloeduitstortingen, die worden verwacht in ~ 1% van de dieren aan operatie onderworpen uitvoeren.
  8. Euthanaseren gewonde dieren in een oplossing van 0,2% MS-222.

2. etikettering van olfactorische Receptor neuronen met fluorescerende Calcium indicatoren

  1. Bereid een oplossing met 12% Calcium Green-1-dextran (Zie Tabel of Materials), 0,1% Triton X-100 en 1 mM NaCl17. De oplossing bij-20 ° C of bij-80 ° C worden opgeslagen als het is niet te worden gebruikt binnen een maand.
  2. Glas pipetten met tip openingen ~ 1 – 2 µm (soortgelijke diameter aan microelectrodes gebruikt voor patch-clamp experimenten) voorbereiden microinjection met behulp van een trekker van de micropipet (Zie Tabel van materialen).
  3. Kalibreren van het volume van microinjections. Met gedestilleerd water, druk en injectie tijd aanpassen met het oog op de injectie hoeveelheid 0,15 – 0,3 µL.
    Opmerking: Een eenvoudige procedure bestaat in het tellen van het aantal pulsen vereist voor het leegmaken van een pipet gevuld met 1 µL van water. Typische parameters zijn een tijdsdruk 30 psi en 50 ms injectie.
  4. Plaats een pipet in de microinjector en laad het met ~ 2 µL van calcium groen-1 dextran oplossing.
  5. Bereiden een tadpole 1.1 tot 1.6 als volgt.
  6. Het uiteinde van de pipet verplaatsen naar de belangrijkste holte van de nasale capsule.
    Opmerking: Zie Figuur 2A met een beschrijving van de locatie van olfactorische trajecten in een Xenopus tadpole.
  7. Met instellingen die zijn verkregen in punt 2.3, leveren een aantal soezen. Aanwezigheid van de kleurstof beperken tot de nasale capsule.
  8. Laat de tadpole rusten voor 2 – 3 min. met behulp van een pipet van Pasteur, pour druppels van 0.02% MS-222-oplossing op de meer caudal delen van het dier tot het vermijden van drogen.
  9. Het dier overbrengen in de herstel-tank.
    Opmerking: Het normale zwemmen moet herstellen binnen ~ 10 min. manipulatie van dieren verwondingen kan veroorzaken.
  10. Euthanaseren kikkervisjes die normale zwemmen gedrag 15 min na het inspuiten met een oplossing van 0,2% MS-222 niet herstellen.
  11. Observeren fluorescentie op het niveau van de glomerulaire laag van de bulbus olfactorius op de dag na de injectie.

3. bereiding van kikkervisjes Live beeldvorming van exocytose reacties

  1. 24-48 h vóór het uitvoeren van het experiment, jas 4 – 6 petrischalen met diameter van 35 mm met silicone-elastomeer (bijvoorbeeld Sylgard). Zodra de elastomeer is polymeervorm, fabriceren een rechthoekige goed aanpassen aan de tadpole.
    Opmerking: Typische afmetingen voor X. tropicalis kikkervisjes gevonden in NF stadia 48-52 zijn 10 x 4 mm.
  2. Bereiden van 100 mL een 160 µM tot 1 mM aminozuur oplossing fungeert als een odorant stimulans voor kikkervisjes. De oplossing kan bestaan uit een mix van verschillende aminozuren: methionine, leucine, histidine, arginine en lysine. Verdun aminozuren in oplossing van Xenopus Ringer's, samengesteld uit (in mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glucose, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Zorgen ervoor dat pH is gehouden op 7,8.
  3. Vul een verhoogde reservoir met 20 mL van de oplossing van het aminozuur. Sluit het reservoir met polyethyleen buis tot een capillaire buis 28 G (Zie Tabel van materialen) geplaatst boven de nasale capsule.
    Opmerking: Het capillair is gemonteerd op een micromanipulator (Zie Tabel van materialen). Luchtbellen moet afwezig uit de perfusie-systeem.
  4. Bereiken temporele precisie bij de toepassing van het aminozuur oplossing met behulp van de transistor-transistor-logic (TTL) controle van snuifje magneetafsluiters (Zie Tabel van materialen). Een stimulator wordt gebruikt voor het genereren van TTL pulsen (Zie Tabel van materialen). Controleer de temporele precisie de odorant om oplossing te komen door het veranderen van de duur van de TTL pulsen, dwz., 0.1 tot 1 s.
  5. Een ander verhoogde reservoir vullen met 100 mL Xenopus Ringer's oplossing.
  6. Een tadpole anesthetize en plaats deze onder de ontleden (stappen 1.1 tot 1.6).
  7. Een tadpole voorbereiden op imaging. Als albino kikkervisjes beschikbaar zijn gaat u verder met stap 3.9, anders Verwijder de huid boven de bulbus olfactorius omdat het bevat melanocyten die afbreuk doen aan de beeldvorming (stap 3.8).
    Opmerking: Er zijn twee manieren voor het uitvoeren van het experiment is afhankelijk van de pigmentatie van het dier. Het is beter dan gebruik maken van albino dieren. Albino stammen zijn beschikbaar voor X. laevis en albino X. tropicalis lijnen onlangs zijn gegenereerd door CRISPR-Cas9 12 of TALENs18.
  8. Met behulp van vannas maken schaar, een laterale insnijding op de tadpole huid aan de rand van het centrale zenuwstelsel. Maak de snede moet plaatsvinden op het niveau van de bulbus olfactorius en nooit het bereiken van de positie van tectum, die gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door de locatie van de oogzenuw.
  9. Knijp de gesneden huid met behulp van pincet en trekken over het zenuwstelsel. Controleer of u succesvol verwijderen door het ontbreken van melanocyten boven de bulbus olfactorius. Houd het dier vochtige door gieten druppels van 0.02% MS-222-oplossing met behulp van een precisiepipet Pasteur.
  10. De tadpole in de put van de gecoate schotel plaatsen (Zie Tabel van materialen). Zet een glas dekglaasje aan bekleed met hoog vacuüm vet boven het dier. Plaats het dekglaasje aan ter dekking van de bovenkant van de tectum aan het einde van de staart.
  11. Zorg ervoor dat de bulbus olfactorius en placodes blootgesteld aan het extracellulaire medium blijven. Houd de tadpole immobiel tijdens imaging. Vul de petrischaal met Xenopus Ringer's solutioncontaining 100 µM tubocurarine (Zie Tabel van materialen) om te voorkomen dat spiersamentrekkingen.
    Opmerking: Tubocurarine wordt opgeslagen in aliquots bij-80 ° C niet langer dan 6 maanden.
  12. Zet de schotel de tadpole onder een Microscoop rechtop te houden. Sluit het reservoir met Xenopus Ringer's oplossing met de schotel met behulp van polyethyleen buizen (Zie Tabel of Materials) voor continue perfusie van Xenopus Ringer's oplossing het dier om levend te houden voor > 1 h.
    Opmerking: Mini magnetische klemmen (Zie Tabel van materialen) zijn zeer nuttig stabiel buizen verbinden met de schotel. Perfusie en zuig buizen moeten zich bevinden in ~ 180° hoek.
  13. Start zoogdierlevercellen Xenopus Ringer's oplossing. Het beschermingsniveau van de oplossing in de schotel constante gedurende het gehele experiment. Doorlopende evaluatie tadpole levensvatbaarheid door het observeren van de omloop van het bloed door de vaten.

4. levende Imaging presynaptische Ca2 + mutatieoverzicht olfactorische Glomeruli

Opmerking: De imaging procedure is beschreven voor het breed-gebied microscopie, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan een confocal microscoop door de overname-instellingen aan te passen. Imaging moet worden uitgevoerd in een rechtop Microscoop gemonteerd op een anti-trillingen-tabel.

  1. Visualiseren van de tadpole met een lage vergroting doelstelling, bijvoorbeeld 5 x.
  2. Verplaats de micromanipulator assen te plaatsen van het capillair leveren de odorant oplossing op de top van een nasale capsule vormen een hoek van 90 ° met de bulbus zenuw. De stroom van odorant oplossing boven de bulbus olfactorius moet worden vermeden omdat het turbulenties die imaging verstoren kan veroorzaken.
  3. Zoeken de bulbus olfactorius ipsilaterally gelegen aan de nasale capsule (afhankelijk van stimulatie) met behulp van een hoge vergroting, lange afstand, water onderdompeling doelstelling: 60Xx, 0.9 N.A.
  4. Controleer de fluorescentie-emissie door oog. Glomerulaire structuren moet duidelijk (Figuur 2B).
  5. Live overname met een camera geschikt voor calcium imaging uitvoeren. Definieer een doos met de volledige bulbus olfactorius, typisch van 256 x 256 of 512 x 512 pixels. Set de overname frame rate verwerving tot 20-40 Hz. de winst, zodanig aanpassen dat de waarden van basale fluorescentie zijn ~ 20% van verzadiging. Verwerven van een 5 s-video.
  6. Visualiseren van de film. Controleer beeld focus, de afwezigheid van bewegingsartefacten en regio's met verzadigde pixels. Typische fluorescentie waarden van glomerulaire regio's moeten van 5.000-20.000 a.u. als een 16-bits-camera gebruikt. Ga verder met de volgende stap als imaging voorwaarden optimaal zijn. Herhaal stap 4.6 als die nodig zijn om de beeldkwaliteit te verbeteren of aanpassen van de winst.
  7. Start een time-lapse overname als u wilt opnemen van reacties opgeroepen door olfactorische prikkels.
    Opmerking: Precieze toepassing van de odorant oplossing wordt beheerd door TTL prikkels. Een typisch experiment bevat een basislijn periode van 4 s, gevolgd door stimulatie tijden variërend van 0,1 tot 0,5 s en een herstelperiode van 6-10 s.
  8. Uitvoeren van repetitieve stimulaties van odorant voor tijdsintervallen > 2 min. ingesteld het debiet op 1 – 1,5 mL·min-1. Aangezien de globale perfusie tijdens alle experimenten op, zijn lokaal toegepaste aminozuren weggespoeld.
    Opmerking: Het volume van de oplossing in de schotel is ~ 3 mL.
  9. Beeldanalyse
    1. Detectie van reacties
      1. Films exporteren naar ImageJ.
        Opmerking: Het doel is het opsporen van de aanwezigheid van glomerulaire regio's reageren op prikkels.
      2. De ruwe reeks van fluorescentie beelden aan een ΔF/F0 film transformeren. Het meten van relatieve wijzigingen in basale fluorescentie volgens de volgende relatie: (F-F0) / f0, waar F0 geeft aan basislijn fluorescentie niveaus dat.
      3. Regio's van belang (ROI) tekenen rond gebieden met verhogingen van de vermeende fluorescentie tijdens stimulatie en opnemen van hun positie in de ROI-manager(Figuur 2). Teken een ROI te sporen achtergrondniveaus fluorescentie in een gebied verstoken glomerulaire structuren.
    2. Kwantificering van reacties.
      1. Plaats de gedefinieerde ROIs in de ruwe opeenvolging van fluorescentie beelden. De gemiddelde grijze waarde van geselecteerde ROIs voor elk frame verkrijgen. Overdracht van de volgorde van de waarden die zijn verkregen aan een analyseprogramma (bijvoorbeeld., Igor Pro).
      2. Achtergrond fluorescentie aftrekken en vervolgens ΔF/F0 wijzigingen te berekenen voor elke ROI (figuur 2F). Plot de stijgingen van de ΔF/F0 voor elk van de ROIs geselecteerd. Bereken de standaarddeviatie van basale ΔF/F0 (vóór stimulatie).
        Opmerking: Een positieve reactie wordt beschouwd als de stijgingen van de ΔF/F0 verkregen tijdens stimulatie groter zijn dan 2 standaardafwijkingen van basale waarden.

5. olfactorische geleide gedrag Assay

Opmerking: Een schema van de installatie voor het uitvoeren van de bepaling is afgebeeld in Figuur 3.

  1. Maak kleine gaatjes te passen 1.57 mm od x 1.14 mm I.D. buis in het bovenste deel van elk putje van een schotel 6-well. Plaats de buis en verzegelen met een epoxy lijm (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: De gewijzigde schotel kan hergebruikt worden vele malen na grondig wassen met gedestilleerd water.
  2. Bereiden van 50 mL van de oplossing van een aminozuur met methionine, leucine, histidine, arginine en lysine (zie stap 3.2 voor details). De concentraties kunnen variëren van 160 µM tot 1 mM. Plaats 20 mL van de oplossing in een verhoogde reservoir.
  3. Don't feed kikkervisjes voor ten minste 12 uur vóór de bepaling. Neem 6 kikkervisjes uit hun huisvesting tank en plaats hen in 2 L van schone tadpole water om te minimaliseren van de blootstelling aan odorant.
  4. Plaats de gemodificeerde 6 wells schotel op een witte LED-transilluminator (Figuur 3).
  5. Koppel de perfusie inhammen naar het reservoir met de oplossing van de aminozuur met behulp van een variëteit (Zie Tabel van materialen). De perfusie-systeem controleren en elimineren van luchtbellen. Vul de 6 putten gelijktijdig. Aanpassen van de hoogte van het reservoir om de levering van ≥5 van odorant binnen ~ 30 mL s.
    Opmerking: Elk goed 4 keer met dubbel gedestilleerd water na blootstelling aan de oplossing van odorant wassen.
  6. Vul elk goed met 10 mL tadpole water. Plaats 1 tadpole per putje. Verlof om uit te rusten voor > 3 min.
  7. Beeldacquisitie instellen. Het gebruik van een conventionele CCD-camera, die beelden op ≥5 Hz. Sluit de camera op een computer kan verwerven. Hier, het gebruik van een Zeiss MRC5 camera gecontroleerd door Zen software maar andere gelijkwaardige configuraties kunnen worden gebruikt. Als het nodig is te verhogen van de framesnelheid, toepassing pixel weggooien. Afbeeldingen moeten laten zien dat de hele 6-well schotel.
  8. Start Beeldacquisitie zodanig dat sommige films bevatten basale (30 s), stimulus (25 – 35 s) en terugwinning (30 – 60 s) perioden.
  9. Terug dieren uit de schotel 6 putten naar tanks na imaging.
  10. Analyseren van films in ImageJ met behulp van plugins zoals wrMTrck19,20 , waarmee meerdere parameters die zijn gekoppeld aan beweeglijkheid.
  11. Als u wilt afbeeldingen voorbereiden voor analyse, selecteert u eerst een goed door te tekenen op een rechthoekig ROI van 35 x 35 mm (Figuur 4A). Een achtergrondafbeelding ophalen door het berekenen van de maximale projectie van de gehele reeks. Het moet een beeld van de put zonder de tadpole.
  12. Aftrekken van de maximale projectie van de rauwe film. Drempelmethode uitvoeren op de gegenereerde 32-bits-film en de wrMTrck plugin toe te passen. Aanpassen WrMTrck parameters voor het op betrouwbare wijze bijhouden van verplaatsingen van dieren. Overdracht van de verkregen X, Y-coördinaten in een analyseprogramma.
  13. Met behulp van X-en Y-coördinaten, berekenen de Euclidische afstand tot de bron van odorant (perfusie inlaat in de put), door toepassing van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1
    waar os geeft de positie van de bron van de geur en tad geeft de tadpole positie op een bepaald moment. Zie Figuur 4A voor meer informatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze paper presenteren we een combinatie van twee complementaire benaderingen voor het uitvoeren van in-vivo -onderzoek van de functionaliteit van de Xenopus tadpole olfactorische systeem: ik) een methode voor imaging presynaptische Ca2 + veranderingen in de glomeruli van leven kikkervisjes met behulp van een fluorescerende calcium indicator, en ii) begeleide een geur gedrags test die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de reactie op specifieke wat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit witboek beschrijft technieken die nuttig zijn voor het onderzoeken van de functionaliteit van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes. Het huidige protocol is vooral handig voor laboratoria die werken, of toegang hebben tot Xenopus; het is echter ook interessant voor deze onderzoekers bestuderen de cellulaire en moleculaire grondslagen van neuronale regeneratie en reparatie. Resultaten van Xenopus kunnen worden gecombineerd met gegevens die zijn verzameld in andere gewerveld...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door subsidies van El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (EFRO), gefinancierd door concurrentieonderzoek awards van de M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, de Stephen W. Kuffeler Fellowship Fonds, Laura en Arthur Colwin begiftigd zomer Fellowship onderzoeksfonds , de Fischbach Fellowship, en het grote fonds van de generatie van de mariene biologische laboratorium en de nationale Xenopus Resource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) waar een deel van dit werk werd uitgevoerd. Wij danken ook CERCA programma / Generalitat de Catalunya voor institutionele ondersteuning. A.L. is een fellow van de Serra Húnter.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Zout voor aquariums (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat)Sigma-AldrichE10521
Pincet #5 (tip 0,025 x 0,005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Schaar (tip 0,015 x 0,015)World Precision Instruments501778
Whatman kwalitatief filterpapierFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropean Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcium Green dextran, Kaliumzout, 10.000 MW, AnionischThermoFisher ScientificC-3713
Borosilicaat capillaire voor micro-injectieSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1,0 mm., I.D.=0,75 mm.
PullerSutter InstrumentP-97
Micro-injectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Microfil micropipettenWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Staande microscoopZeissAxioImager-A1
Master-8 stimulatorA.M.P.I.
CCD-cameraHamamatsuImage EM
Solenoïde kleppenWarner InstrumentsVC-6 Six Channel systeem
Dow Corning High Vacuum GreaseVWR Scientific636082B
Tubocurarine hydrochlorideSigma-AldrichT2379
CCD-cameraZeissMRC-5 CameraGestuurd door Zen software
cameralensThorlabsMVL8ML3Er zijn meerdere mogelijkheden die moeten worden aangepast aan het gebruikte cameramodel
Epoxy harsRS Components
ManifoldWarner InstrumentsMP-6 perfusie manifold
Micromanipulator voor lokale levering van oplossingenNarishigeMN-153
Mini magnetische klemmenWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Polyethyleen buisWarner Instruments64-0755O.D.=1,57 mm., I.D.=1,14 mm.

Referenties

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14(2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

In vivo beeldvormingreukbolcalcium-imaginggedragstestszenustranssectieGFP-reporterssynaptische herbedradingaminozuurstimuli
Functionele evaluatie van olfactorische trajecten in levende Xenopus kikkervisjes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.