Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Summary

Flow cytometrische analyse heeft waardevol voor het onderzoeken van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek bewezen. Wij presenteren drie uitgebreide werkstromen, van monsterneming tot data-analyse, voor zuivere culturen en complexe gemeenschappen in duidelijke medium zoals in uitdagende matrices, respectievelijk.

Abstract

Het onderzoek van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek is essentieel om te begrijpen en beheersen van natuurlijke ecosystemen en technische toepassingen aangedreven door micro-organismen. Volgende generatie sequencing methoden worden algemeen gebruikt voor het oplossen van microbiomes, maar ze zijn over het algemeen resource en tijd intensief en vooral kwalitatieve informatie leveren. Flow cytometrische microbiome analyse geen last van die nadelen en kan subcommunity van de relatieve abundanties en absolute cel nummers op-lijn. Hoewel het niet direct fylogenetische informatie leveren, kan het verbeteren van de diepte van de analyse en de resolutie van sequencing benaderingen. In schril contrast met medische toepassingen in zowel onderzoek als standaardsettings, wordt stroom cytometry nog steeds niet op grote schaal gebruikt voor microbiome analyse. Ontbrekende informatie op monster voorbereiding en data analyse pipelines kan leiden een toetredingsdrempel voor de onderzoekers uitdagingen microbiome analyse dat zou vaak leerboek stroom cytometry toepassingen. Hier presenteren we drie uitgebreide werkstromen voor zuivere culturen, complexe gemeenschappen in duidelijk middellange en complexe gemeenschappen in uitdagende matrices, respectievelijk. We beschrijven van individuele procedures voor bemonstering en fixatie en geoptimaliseerd kleuring van protocollen voor de respectieve sample sets. We werken de analyse van de cytometrische met een complex onderzoek gecentreerd en een toepassing gerichte bank top apparaat, beschrijven de cel sorteren van de procedure en suggereren datapakketten analyse. Wij bovendien belangrijke experimentele besturingselementen voorstellen en de gepresenteerde werkstromen van toepassing op de respectieve sample sets.

Introduction

Micro-organismen spelen een vitale rol in veel aspecten van de mens live. Ze zijn de belangrijkste biotische factoren van de planeten koolstof, stikstof, fosfor en zwavel cycli¹, en fungeren als vernederende^2,3 , alsmede het synthetiseren van⁴ biokatalysatoren in diverse industrieën, zoals de behandeling van afvalwater ⁵ of de biotechnologie⁶. Zij vormen zelfs de menselijke microbiome, die direct gezondheid van de mens en metabolisme^{7,8 beïnvloeden is}. Daarom is de informatie over de structuur, functie en dynamisch gedrag van micro-organismen, in reactie op hun directe omgeving, nodig als wij willen volledig te begrijpen en manipuleren van deze systemen. Volgende generatie sequencing (NGS) is de gevestigde technologie voor het oplossen van de structuur en functie van de microbiome⁹. Echter de analyse en evaluatie van gegevens van het NGS kwantitatieve informatie niet kan opleveren, en is nog steeds duur, tijdrovend en geenszins bereid te verlenen ter plaatse resultaten binnen prestaties gangen. Sommige bacteriën weergegeven generatie tijden hieronder 1 h en oorzaak voortdurend veranderende structuren van de Gemeenschap in bepaalde omgevingen¹⁰. Na een dergelijke dynamiek, zou met behulp van sequencing benaderingen de capaciteit van het financiële en arbeidskrachten van de meeste wetenschappelijke labs overschrijden.

Daarentegen kan de stroom cytometry Gemeenschap vingerafdrukken NGS gegevens, vergelijkbaar met behoud van een hogere tijd-, arbeid- en kosten-efficiëntie bieden. Hier presenteren we stroom cytometrische technieken kunnen volgen van de microbiële Gemeenschap dynamiek op-lijn op het niveau van één cel. In tegenstelling tot NGS, stroom cytometry biedt geen fylogenetische verwantschap of informatie over functionele genen, maar levert kwantitatieve cel nummers. Met behulp van stroom cytometry, kunnen microbiële gemeenschappen worden opgelost in subcommunities met verschillende lichte spreidings- en fluorescentie-eigenschappen (forward scatter (FSC) en kant scatter (SSC) aanwijzingen geven voor Celgrootte en granulariteit, respectievelijk). De voorgestelde aanpak maakt voornamelijk gebruik van cel grootte - en DNA bedrag van verwante gegevens die zijn gekoppeld aan bepaalde celtypen en valt bestuurlijk gezien onder fysiologische (groei). De DNA-inhoud is gekwantificeerd aan de hand van de UV-prikkelbaar 4', 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) kleurstof, die bindt aan de A-T rijke regio's van het DNA en kan zelfs het oplossen van verschillende chromosomale niveaus. Door het combineren van de DAPI fluorescentie en FSC kunnen meer dan 50 subcommunities worden onderscheiden en gecontroleerd voor het wijzigen van abundanties over tijd¹¹. De subcommunity overvloed variaties kunnen worden gecorreleerd met veranderingen in het milieu micro-omgeving, zoals pH en product titers¹², met globale parameters, zoals het weer^13,14, of in geval van darm of speeksel microbiomes met bepaalde medische behandelingen¹⁵. Deze correlaties onthullen belangrijke subcommunities die verantwoordelijk zijn voor bepaalde functies in het metabolische netwerk van de hele Gemeenschap. De belangrijkste subcommunities kunnen vervolgens worden specifiek bevorderd of onderdrukt door een wijziging van de omliggende micro-omgevingen of voor latere sequencing¹⁵ of Proteoom Onderzoek¹⁶gesorteerd.

Echter, microbiële Gemeenschap stroom cytometry niet is nog wijdverbreide gevestigd als gevolg van een nogal lage aantal stroom cytometrische apparaten staat correct omzetten van microbiële populaties of gemeenschappen. Anderzijds kan het gebrek aan ervaring, Gemeenschap analyse pijpleidingen en effectieve gegevensevaluatie een toetredingsdrempel voor onderzoekers microbiome analyse uitdagingen vormen. Wij hebben vastgesteld dat uitgebreide werkstromen om deze kwesties aan te pakken. Om te illustreren hun algemene toepasbaarheid, zal presenteren we hen op drie voorbeeldige sample sets (aanvullende bestand 1-S1), namelijk ik) een reincultuur (PC) voor biotechnologische toepassingen gegroeid in beschreven duidelijk medium (Pseudomonas putida KT 2440 op glucose), ii) een complexe lab Gemeenschap in duidelijke medium (actief slib Gemeenschap (ASC) in synthetische afvalwater) en iii) een complexe Gemeenschap van natuurlijke omgevingen in een dichte matrix (biogas Gemeenschap (BC) in maïs kuilvoer).

Verschillende factoren beïnvloeden de keuze van het protocol voor elk van deze sample-sets. Middel van diepvriezen afziet van het gebruik van giftige chemische stoffen, maar is meestal beperkt tot lab omgevingen ten gevolge van het gebruik van vloeibare stikstof voor schok glazuur. De formaldehyde stabilisatie en de daaropvolgende ethanol fixatie kunt bulk steekproeven zonder de noodzaak voor aliquoot voorbereiding en heeft bewezen stabiel te zijn over lange periodes. Eiwitrijke monsters zoals menselijke speeksel¹⁵ kunnen echter problematisch, omdat eiwitten Floc, denaturized door de formaldehyde, ongunstige signaal ruisverhoudingen kunnen veroorzaken. Het monster drogen duurt de meeste tijd (ongeveer 1 uur in totaal) van de procedures in deze vergelijking, maar kan worden uitgevoerd op de site, zonder giftige chemicaliën. Het levert stabiele pellets in buizen, die gemakkelijk kunnen worden verzonden zonder koeling of extra gevaar voorzorgsmaatregelen. Bovendien zijn tal van alternatieve fixatie methoden voorgestelde¹¹geweest. Wij adviseren sterk om te testen van de resolutie en fixatie stabiliteit van verschillende protocollen bij de invoering van een nieuwe reeks van de steekproef.

Wij twee verschillende flow cytometers gebruikt voor het analyseren van de sets: i) een zeer verfijnde en duur, onderzoek gecentreerd cel diasorteerderweergave en ii) een toepassing gericht Bank top analyzer die meer geschikt is voor on-site toepassing⁵verschijnt. De BC werd gemeten met de Bank top analyzer, terwijl de PC en de ASC werden gemeten met de cel sorteerder. De analyse van de drie voorbeeldige monster wordt vereist verschillende procedures voor geoptimaliseerde reproduceerbaarheid, monster stabiliteit en gemak van de werkstroom ingesteld. Het volgende protocol geeft de secties voor de drie verschillende systemen.

Protocol

1. de bemonstering en fixatie

1. Reincultuur: diepe bevriezing^15,17
   1. Neem 2 mL celsuspensie, centrifuge gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en 5.000 x g en verwijder het supernatant.
      Opmerking: De bemonsterde celsuspensie wordt beschreven in aanvullende bestand 1-S1.
   2. Resuspendeer de cellen in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 6 mM nb₂HPO₄, 1,8 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl met bi-gedistilleerd H₂O, pH 7,2) Bovendien met 15% (v/v) glycerol als cryoprotective agent.
   3. Incubeer gedurende 10 min op ijs en shock freeze in vloeibare stikstof voor daaropvolgende opslag bij-80 ° C.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters zijn stabiel gedurende ten minste één maand.
2. Geactiveerd slib Gemeenschap: formaldehyde stabilisatie + ethanol fixatie^5,10,18
   1. Neem 4 mL van de celsuspensie, centrifuge gedurende 20 minuten bij 15 ° C en 3200 x g en verwijder het supernatant.
      Opmerking: De bemonsterde celsuspensie wordt beschreven in aanvullende bestand 1-S1.
   2. Voeg 4 mL 2% formaldehyde in PBS en incubeer gedurende 30 min op RT.
      1. Bereiden van 8% formaldehyde stockoplossing van paraformaldehyde om te voorkomen dat de behoudende additieve methanol toegevoegd aan formaldehyde geleverd in vloeibare vorm. 4 g paraformaldehyde toevoegen aan 50 mL PBS bij 70 ° C. Voeg ongeveer 125 µL van 10 M NaOH-oplossing. Roer totdat de paraformaldehyde volledig is opgelost en laat het vervolgens afkoelen tot RT. aanpassen de pH waarde 7.0 met ongeveer 100 µL 37% HCl. bevriezen de formaldehyde-oplossing in 15 mL aliquots voor opslag. Gebruik geen ontdooide aliquots langer dan 10 dagen.
         Let op: Formaldehyde moet worden behandeld en met zorg als gevolg van de toxische en mutagene eigenschappen verwijderd. Draag altijd handschoenen tijdens het verwerken van het. Gebruik een uitlaat kap terwijl de ontbinding van de paraformaldehyde te voorkomen van blootstelling aan giftige dampen.
   3. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 15 ° C en 3200 x g en verwijder het supernatant.
   4. Resuspendeer de steekproef in 4 mL 70% ethanol en winkel bij-20 ° C.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters zijn stabiel gedurende ten minste 2 maanden. Afhankelijk van de eigenschappen van het monster kan ook het centrifugeren stap in punt 1.2.1 worden uitgevoerd gedurende 10 minuten bij 4 ° C om tijd te besparen.
3. Biogas Gemeenschap: drogen
   1. Gebruik een geknipte 1.000 µL Pipetteer tip om monster 200 µL van de viskeuze digestaat in een tube van 2 mL.
   2. Voeg 1.700 µL van PBS buffer en meng.
   3. Plaats de buizen in het ultrasoonbad bij 35 kHz en 80 W effectieve vermogen voor 1 min te ontbinden grote cel aggregaten en losmaken van cellen steken plantenziekterisico cel residuen.
   4. Het monster Meng, filtreer het monster door een 50 µL mesh filter en verdelen van het filtraat in vier aliquots van ongeveer 400 µL.
      Opmerking: Voorbereiding aliquots op dit punt biedt twee belangrijke voordelen. Eerste, kleinere volumes zijn eenvoudiger en sneller om mechanisch scheidt (centrifuge) en thermisch (drogen), bemonstering van kleine hoeveelheden van meestal dik biogas slib kan echter zeer uitdagend. Tweede, extra monsters mogen worden gebruikt voor latere cel sorteren, back-metingen of besturingselementen.
   5. Centrifugeer het aliquots tweemaal gedurende 10 minuten bij 10 ° C en 4000 x g en verwijder het supernatant volledig beide keren naar mechanisch scheidt het monster zo volledig mogelijk.
   6. Het drogen van de monsters in een verwarmde vacuüm centrifuge voor 40 min bij 35 ° C, ongeveer-97 kPa en 2.500 x g maken stabiele pellets. Bewaar de pellets bij 4 ° C in het donker.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De pellets zijn stabiel gedurende ten minste 6 maanden.

2. kleuring

Opmerking: DAPI kleuring heeft bewezen hoge resolutie dot plots en daarom bijzonder voordelige bij het analyseren van de Gemeenschappen. De DAPI-concentratie in de kleurstofoplossing moet worden geoptimaliseerd voor het garanderen van een intensiteit van de fluorescentie van cel-poort, ruim boven het geluidsniveau maar onder de kralen. De optimale hangt af van de gevoeligheid en parel-keuze van instrument kan variëren tussen sample sets als gevolg van de G/C-gehalte van de ingeperkte micro-organismen en in het algemeen moet worden getest voor nieuw geïntroduceerde sample sets. Testen van concentraties van 0,24 µM DAPI en 1 µM DAPI wordt aanbevolen voor de gepresenteerde setup. Andere kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor specifieke toepassingen. Het gebruik van een SYBR groen ik kleuring protocol wordt geadviseerd als absolute celverwijzingen tellen nauwkeurigheid wordt geprioritizeerd over de vingerafdrukken analyse (aanvullende bestand 1-S1)^6,15. Het bevat minder monster manipulatie en centrifugeren stappen en is van toepassing met zowel vaste als vitale cellen. Het gebruik van vitale cellen verder vermindert monster behandeling stappen door het overslaan van de fixatie en heeft dus slechts één centrifugeren voor de oogst van de cel. Dit minimaliseert de potentiële verlies van de cel en bijgevolg systematische meetfouten. De PBS, permeabilization buffer en de kleurstofoplossing gebruikt tijdens alle volgende stappen moet worden gefilterd via 0,2 µm spuit filters om extra deeltje lading in de steekproef te verminderen. De kleuring van één monster met Escherichia coli BL21 (DE3) zoals een biologische norm met elke steekproef zwembad is geadviseerd.

1. Reincultuur
   1. Ontdooiing van de monsters, centrifuge voor 5 min op RT en 5.000 x g en verwijder het supernatant.
   2. Resuspendeer de pellet cel in ijskoude PBS door herhaalde pipetteren en aanpassen van de OD-_700nm tot 0,035 (pad lengte_cuvette = 0,5 cm).
   3. Voorbereiden op de cellen kleuring.
      1. 1 mL van aangepaste celsuspensie voor 5 min op RT en 5.000 x g centrifugeren en verwijder het supernatant.
      2. Resuspendeer de cellen in de buffer van de permeabilization met citroenzuur van 0,3 M en 4.1 mM Tween20 1 mL en meng.
      3. Incubeer het monster gedurende 10 minuten op ijs maken doorlatende celmembranen voor latere kleuring.
      4. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten op RT en 5.000 x g en verwijder het supernatant.
   4. Voeg 1 mL kleurstofoplossing met 0.68 µM DAPI in 417 mM nb₂HPO₄/NaH₂PO₄ buffer (289 mM nb₂HPO₄, 128 mM NaH₂PO₄ met bi-gedistilleerd H₂O, pH 7), meng en Incubeer gedurende minstens 15 min op RT in het donker.
      Opmerking: Precieze OD aanpassing is essentieel voor het garanderen van vergelijkbare metingen omdat de DAPI fluorescentie met de celdichtheid variëren zal als de concentratie van de DAPI constant wordt gehouden. Het supernatant moet zorgvuldig worden verwijderd als gevolg van een over het algemeen fragiele pellet om cel verlies te voorkomen.
      Let op: Verwerken en gooi DAPI met zorg als gevolg van de mutagene eigenschappen.
2. Actiefslibinstallatie Gemeenschap
   1. Meng het vaste monster en breng 0,6 mL in een glazen buis. Voeg 1,4 mL PBS en bewerk ultrasone trillingen ten voor 10 min op RT zoals beschreven in stap 1.3.3. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 4 ° C en 3200 x g en verwijder de bovendrijvende substantie. Voeg 2 mL PBS toe en meng. Bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min.
   2. Aanpassen van de OD-_700nm tot 0,035 (pad lengte_cuvette = 0.5 cm) met PBS.
   3. Voorbereiden op de cellen kleuring.
      1. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 4 ° C en 3200 x g en verwijder de bovendrijvende substantie.
      2. Resuspendeer de cellen in de buffer van de permeabilization met citroenzuur 0.11 M en 4.1 mM Tween20 1 mL en meng.
      3. Incubeer gedurende 20 min op RT maken doorlatende celmembranen voor latere kleuring.
      4. Centrifugeer het monster opnieuw gedurende 10 minuten bij 4 ° C en 3200 x g en verwijder de bovendrijvende substantie.
   4. Voeg toe 2 mL kleurstofoplossing met 0.68 µM DAPI en 417 mM nb₂HPO₄/NaH₂PO₄ buffer, meng en ten minste 60 min op RT in het donker uit te broeden.
      Opmerking: Het gebruik van glazen buizen wordt geadviseerd, zoals bepaalde micro-organismen hebben de neiging vast te houden aan het plastic buis muren en mogelijk verloren tijdens het proces. Het broeden 's nachts is ook mogelijk en meestal vereenvoudigt lab procedures.
      Let op: DAPI moet worden behandeld en met zorg als gevolg van de mutagene eigenschappen verwijderd.
3. Biogas Gemeenschap
   1. Schorten de gedroogde cel pellet in PBS.
      1. Voeg 800 µL van PBS, meng zorgvuldig en laat de pellet geniet gedurende 15 minuten.
      2. De vloeibare fase met een 1.000 µL pipet gecombineerd en de geweekte pellet naar het cilindrische gedeelte van de buiswand met het uiteinde van de pipet. Het moet er vasthouden.
      3. Het uiteinde van de pipet verplaatsen in een draaiende beweging om te pletten van de pellet langs de muren van de buis.
      4. Wassen van de resulterende drijfmest uit de muren van de buis door de verstrekking van de vloeibare fase vanaf de punt van de pipet langs de buiswand.
      5. De opschorting door zuigen en schorsing van het in de pipet driemaal doorroeren.
   2. Het monster met PBS tweemaal wassen.
      1. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 10 ° C en 4000 x g en verwijder het supernatant.
      2. Voeg 1.500 µL van PBS en meng.
      3. Herhaal de twee stappen hierboven eens.
   3. Plaatsen van de buizen in het ultrasoonbad voor 1 min, zoals beschreven in stap 1.3.3 en, vervolgens, filtreer elk monster door een 50 µL mesh filter in een afzonderlijke glazen buis.
   4. Verdun 2 mL van het monster tot OD_700nm 0,035 (pad lengte_cuvette = 0.5 cm) met PBS.
   5. Voorbereiden op de cellen kleuring zoals beschreven in stap 2.2.3 hierboven.
   6. Voeg 2 mL kleurstofoplossing met 0,24 µM DAPI en 417 mM nb₂HPO₄/NaH₂PO₄ buffer, meng en incubeer over nacht op RT in het donker.
      Let op: DAPI moet worden behandeld en met zorg als gevolg van de mutagene eigenschappen verwijderd.

3. meting

Opmerking: De voorbeeldige sample sets zijn geanalyseerd met twee verschillende flow cytometers. De PC en de ASC werden geanalyseerd met een meer complexe, zeer verstelbaar en gemakkelijk aan te passen, onderzoek gecentreerde cel diasorteerderweergave. Voor de PC-analyse, dit apparaat was uitgerust met een laser instellen tot zoals beschreven in de vorige publicatie¹⁶, kortom een blauw (488 nm, 400 mW) en een ultraviolet (334-364 nm, 100 mW) argon ion laser. Voor de analyse van de ASC, nieuwere blauw (488 nm, 400 mW) en ultraviolet (355 nm, 150 mW) Halfgeleiderlasers werden geïnstalleerd. In beide gevallen veroorzaakte de blauwe laser het CFS (bandfilter filter 488 nm ± 5 nm, neutrale-opaciteitsfilter 1.9) en de wetenschappelijke stuurgroep (bandfilter filter 488 nm ± 5 nm, neutrale-opaciteitsfilter 1.9, trigger). Deze optische kenmerken zijn gerelateerd aan Celgrootte en celdichtheid, respectievelijk. De UV-lasers opgewonden de DAPI-fluorescentie (bandfilter filter 450 nm ± 32,5 nm) voor de kwantificering van cellulaire DNA-inhoud. Het fluidic systeem werd uitgevoerd op 56 psi (3.86 bar) met de monster overdruk op maximale 0.3 psi en een 70 μm mondstuk. Alle parameters werden geregistreerd als piekhoogten in plaats van de piek gebieden ter verbetering van de resolutie van de meting. De lange termijn monitoring van de biogas Gemeenschap werd uitgevoerd met de minder complex, stroom cuvette gebaseerd, Bank top analyzer. Een ultraviolet halfgeleider-laser (355 nm, 50 mW) werd gebruikt voor het opwekken van de FSC (bandfilter filter 355 nm ± 5 nm) en SSC (bandfilter filter 355 nm ± 5 nm, trigger) signalen en prikkelen de DAPI-fluorescentie (bandfilter filter 455 nm C). Het water gebruikt voor de buffer van de schede van beide apparaten was bi-gedistilleerd en 0.1 µm gefilterd. De PBS gebruikt voor monsterverdunning moet worden gefilterd via 0,2 µm spuit filters om vermindering van het lawaai van de deeltjes in de metingen zo veel mogelijk.

1. Reincultuur en actiefslibinstallatie Gemeenschap
   1. Start het instrument, de laser, de computer en de software en monster analyse voorbereiden.
      1. Zet de lasers en uitvoeren voor 15 min te bereiken van de bedrijfstemperatuur en straal stabiliteit te verzekeren.
      2. Vullen van de tank van de schede met 10 x foedraal buffer (19 mM KH₂PO₄, 38 mM KCl, 166 mM nb₂HPO₄, 1.39 M NaCl met bi-gedistilleerd H₂O) verdund met bi-gedistilleerd H₂O een 0,2 x werkoplossing (voor het sorteren van de cel: 0,5 x werkende oplossing).
      3. Prime het fluidic systeem met 56 psi druk en de afval tank met ongeveer 6 psi vacuüm.
      4. Het instrument voor minimum 15 min in afgeboekt modus te spoelen van de steekproef haven, slang en mondstuk uitgevoerd.
   2. Kalibreren met standaard kralen.
      1. De kraal mixen voor te bereiden voor de kalibratie in het lineaire (1 μm blauw + 2 μm geelgroen TL) en logaritmische reeks (0,5 μm en 1 μm blauwe TL). Verdun de opschorting van de parel van de oorspronkelijke voorraad schorsingen om gelijke concentraties.
      2. Voortdurend meten de lineaire kraal mix en passen de kraal pieken naar een vooraf ingestelde kalibratie sjabloon door het manipuleren van het mondstuk en laser optics posities vooraf het kalibreren van het instrument in de lineaire bereik.
      3. Schakel over naar de logaritmische reeks en continu meten de logaritmische kraal mix. De toppen van de parel aan hun vooraf ingestelde kalibratie-sjabloon te fine-tunen van de hardware van het instrument passen. Laatste aanpassingen aan de positie van de kraal met behulp van de instelling van de winst van de fotomultiplicator buizen (PMTs).
      4. Controleer de positie van het instrumentale lawaai en eventueel aanpassen aan te passen de sjabloon kalibratie.
         Opmerking: Een vaste kalibratie-sjabloon voor de positie van de kralen moet worden voorbereid voordat een meting project en kan niet worden gewijzigd (Zie aanvullende bestand 1-S4)! Instrumentale ruis kan worden veroorzaakt door deeltjes in het monster of de motorgeluiden van de PMTs en zal altijd tot op zekere hoogte worden opgenomen. Het is niet raadzaam om te verbergen van het lawaai volledig door winst aanpassing of plot offset. De overvloed en de positie van de ruis gebeurtenissen kunnen een waardevolle bron van informatie en moeten daarom worden opgenomen in de ruwe gegevens. Zeer deeltje intensieve monsters kunnen vereisen de latere verwijdering van het lawaai redenen plotten en data analyse. Controle van de kalibratie regelmatig overdag een meting te garanderen van de stabiliteit van het instrument en dus proef vergelijkbaarheid.
   3. Meten van een monster met de biologische standaard zoals beschreven in 2.1.4 (DAPI gekleurd Escherichia coli BL21 (DE3), bemonsterd en vaste tijdens de stationaire fase (16u) volgens het protocol van de ASC beschreven in 1.2). Controleer de positie van de piek ten opzichte van hun vooraf ingestelde kalibratie-sjabloon (Zie aanvullende bestand 1-S5).
      Opmerking: De routine kleuring en meting van de biologische norm met elke pool van monsters zal ook dienen als een interne controle voor de kleuring procedure. Als het apparaat is gekalibreerd met behulp van kralen en de biologische standaard niet de vooraf ingestelde kalibratie-sjabloon past, moet de kleuring procedure waarschijnlijk worden herhaald.
   4. Monster acquisitie.
      1. De kleurstofoplossing gedurende 10 minuten te spoelen van de poort van de steekproef en de buis en de stabiliteit van de DAPI fluorescentie in latere monsters worden uitgevoerd.
      2. Filter het gebeitst monster met een filter maaswijdte 50 μm vóór de meting te voorkomen verstopping van de cytometer verstuiver of capillaire stromen.
      3. Voeg de logaritmische kraal mix aan het monster te controleren van de stabiliteit van het instrument en de mogelijkheid voorzien in een controle achteraf kalibratie. De monsters moeten bevatten tussen de 1.000 en 2.500 gebeurtenissen in elk van de twee kraal-poorten.
      4. Maak een cel-gate in de software instrument tijdens de eerste proef metingen van een nieuwe reeks van de steekproef. Deze poort moet bevatten van de gekleurde cellen en uitsluiten van het lawaai en kralen.
      5. Meng de monsters en meten met een maximale snelheid van 3.000 gebeurtenissen s^-1 tot 250.000 cellen (gemeenschappen) of 50.000 cellen (reinculturen) worden gedetecteerd binnen de cel-poort.
         Opmerking: Deze cel tellingen worden gekozen op basis van de ervaring met de sample-sets. Verschillende nummers kan worden gebruikt om te verschuiven van de afweging tussen de efficiëntie van de meting en de opsporing van lage overvloed subcommunities in beide richtingen.
         Problemen oplossen: Plotselinge intra-meting verschuivingen van de parel en positie van de cel kan worden veroorzaakt door luchtbellen gevangen in het mondstuk. Dit vereist dat de verwijdering en het schoonmaken van de verstuiver en de spoelen van het fluidic systeem met schede buffer. Het instrument moet worden aangepast na montage van de verstuiver (begin met stap 3.1.2).
      6. Afgeboekt het instrument grondig met schede buffer voor shutdown en monsters over te schakelen.
2. Biogas Gemeenschap
   1. Opstarten van het instrument, laser, computer en software voor analyse van monster te bereiden.
      1. Afgeboekt ten minste 6 mL schede buffer (bi-gedistilleerd H₂O) via de buis en monster poort in een losjes verbonden buis met behulp van de functie "schede vloeistof prime" van de software instrument.
      2. Maatregel bi-gedistilleerd H₂O op 5 µL s^-1 te spoelen het fluidic systeem tot minder dan 200 evenementen s^-1 worden gedetecteerd op het regelmatige debiet van 0,5 µL s^-1.
   2. Kalibreren van het systeem.
      1. De kraal mix (0,5 μm en 1 μm blauwe TL) voor te bereiden. Verdun de opschorting van de parel van de oorspronkelijke voorraadoplossingen om gelijke concentraties.
      2. Voortdurend meten de kraal mix in het logboek₄ bereik en passen de pieken van de parel aan hun vooraf ingestelde kalibratie sjabloon door het manipuleren van de stroom cuvette en laser optische posities. Laatste aanpassingen aan de positie van de kraal met de instelling van de winst van de PMTs.
   3. Controle van de kalibratie met de biologische standaard zoals beschreven in stap 3.1.3.
   4. Monster acquisitie.
      1. Verdun 400 µL van gebeitst monster in 1600 µL van PBS, meten en controleren van de telling van de gebeurtenis als een concentratie-test wilt uitvoeren.
         Opmerking: Aangepaste verdunning tarieven eventueel voor andere bronnen van de steekproef. Het aantal gebeurtenissen mag niet meer dan 1.200 gebeurtenissen s^-1 in de rijke monsters deeltje om resolutie verlies in de vooruit scatter (negatieve voorbeeld in aanvullende bestand 1-S2) te voorkomen. Zuivere culturen kunnen worden gemeten met maximaal 2.000 gebeurtenissen s^-1.
      2. Maak een cel-gate in de software instrument tijdens deze eerste proef metingen. Deze poort moet bevatten van de gekleurde cellen en uitsluiten van lawaai en kralen.
      3. Verdun het monster volgens de resultaten van de test van de concentratie uit te voeren op maximaal 1.200 totaal evenementen s^-1 en de kraal mix Voeg aan het monster te controleren instrument stabiliteit en bieden de mogelijkheid voor een retrospectieve kalibratie-check. De monsters moeten bevatten tussen de 1.000 en 2.500 gebeurtenissen in elk van de twee kraal-poorten.
      4. Mengen en meten van het monster tot 250.000 cellen (gemeenschappen) of 50.000 cellen (reinculturen) worden gedetecteerd binnen de cel-poort.
      5. Spoel het instrument grondig met bi-gedistilleerd H₂O voor shutdown en switch monsters.

4. de cel sorteren

Opmerking: De cel sorteren van procedure vereist aanvullend instrument ingesteld en wordt uitgevoerd volgens gepubliceerde protocollen¹².

1. Opstarten en kalibreren van het instrument, zoals beschreven in stappen 3.1.1-3.1.3, maar een 0.5 x werkoplossing de schede buffer gebruiken.
2. Stel de frequentie van de DD en DD amplitude te vinden de druppel break-off.
3. Mount de doorbuiging platen, kosten ze en beslissen voor 2 - of 4-Way sorteren modus.
4. Uitvoeren van de daling van de interne vertraging kalibratie met 2 μm geel-groene parels om te definiëren van de tijdspanne die een deeltje of cel om te reizen van de ondervraging wijs (laser hits cel) tot de laatste druppel op de stroom aangesloten.
5. 6 keer 20 kralen op een glasplaatje sorteren en tellen ze met een microscoop om te controleren of de daling vertraging kalibratie.
6. De sorteer gate-sjabloon voor te bereiden.
7. Gebruik de "één en één neerzetten modus: hoogste zuiverheid 99%" tegen een tarief dat niet hoger is dan 2.500 total gebeurtenissen s^-1 als u wilt sorteren van 500.000 cellen in maximaal 4 poorten tegelijk (4-weg sorteren modus).
8. Oogsten van de cellen door middel van centrifugeren (20.000 x g, 6 ° C, 25 min) en het bevriezen van de pellet bij-20 ° C voor later DNA isolatie en sequencing.
   Opmerking: Vermijd sorteren van cellen in de poorten met minder dan 5% relatieve overvloed, als de sorteer tijd is omgekeerd evenredig met de relatieve overvloed. De afzonderlijke stappen worden in detail in de cel sorter handleiding beschreven. De vereiste cel nummers zijn sterk afhankelijk van de respectieve use cases en de protocollen van de extractie. Tal van methoden zijn toegepast: ddPCR (1000 cellen^17,19), 16S rDNA of mcrA amplicon sequentie (500.000 cellen^6,10,15) en proteomics (maximaal 1.1 x 10⁷ cellen ^16,,¹⁷). De cel sorteren zullen bijzonder voordelige vanwege de lagere diversiteit in de gesorteerde subcommunities in combinatie met een metagenomics benadering.
   Let op: Raak niet de deflector platen tijdens het sorteren procedure als gevolg van hoge spanningen.

5. de gegevensanalyse

Opmerking: De cytometrische meting levert "stroom cytometry standaard".fcs-gegevensbestanden met een over het algemeen uniforme gegevensstructuur. Echter, verschillende cytometer fabrikanten gebruiken enigszins aangepast versies en oudere instrumenten kunnen dateren van vóór de invoering van de 2010 van de nieuwste FCS standaard 3.1. Dit kan leiden tot dot perceel schalen kwesties, waardoor de directe vergelijking van de resultaten verzameld met verschillende instrumenten. De afzonderlijke gegevenspunten worden echter altijd opgeslagen op de regels van een matrix, met de respectieve spreidings- en fluorescentie intensiteitswaarden in de verschillende kolommen. De gepresenteerde microbiome analyse pijpleidingen gebruik de kenmerkende Celgrootte en de DNA-inhoud wilt beschrijven van microbiële subcommunities. Deze parameters zijn gecorreleerd aan de FSC en DAPI fluorescentie kanaal intensiteiten (cel sorter: FL-4, analyzer: FL-1) en resultaat in subcommunity clusters wanneer gevisualiseerd op de twee-dimensionale FSC vs. DAPI fluorescentie percelen. Deze dot plots de interpretatie en analyse van stroom cytometry gegevens toestaan en meestal logaritmisch worden geschaald. Zij kan worden weergegeven vanuit .fcs bestanden met behulp van gepatenteerde cytometer software of derden oplossingen en vormen de basis voor de geautomatiseerde (cytometrische Histogram afbeelding vergelijking, CHIQUE) en semi-geautomatiseerde (Cytometric Barcoding, CyBar) analyse van de Gemeenschap.

1. Cytometrische Histogram afbeelding vergelijking
   Opmerking: De code, gedetailleerde documentatie en een handleiding voor dit pakket zijn beschikbaar op http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. Ze zijn ook gepubliceerde²⁰.
   1. Installeren en de R package laden, de werkmap met de .fcs bestanden instellen en een lijst met bestanden door te voeren:
      > Bron ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # De werkmap ingesteld op het pad waar uw FCS-bestanden zich bevinden
      > # Typ het pad naar de aanhalingstekens
      > setwd("")
      > # Krijgen een lijst van de bestandsnamen van de FCS bestanden in je werkmap
      > bestanden <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Een lijst van de bestandsnamen van de FCS-bestanden opgenomen aan het pakket krijgen
      > bestanden <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + volledige = TRUE, patroon = "*.fcs")
      > # Lees het eerste FCS-bestand als flowFrame
      > frame < - Lees. FCS(files[1],Alter.names=True,Transformation=false)
      > # Krijgen een lijst met de namen van de parameter/kanaal
      > unname(frame@parameters@data$name)
   2. Afbeeldingen maken voor de ruwe gegevens van de cytometrische door het uitvoeren van de "fcs_to_img" pakket functie:
      > # Maak de histogram beelden met behulp van de standaardparameters
      > fcs_to_img(files)
   3. Deelverzamelingen van de histogram beelden door het uitvoeren van de functie van "img_sub" pakket definiëren:
      > # Maak het histogram deelverzamelingen van de afbeelding met behulp van de standaardparameters
      > img_sub (bestanden, ch1 = "FS. Log",CH2="FL.4.log")
   4. Berekenen van de overlapping en XOR waarden om uit te voeren van de beeldanalyse door het uitvoeren van de "calculate_overlaps_xor" pakket functie:
      > # De namen van alle subset afbeeldingen opslaan als een lijst
      > deelverzamelingen <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Berekenen van overlapping en XOR beelden en schrijf de waarden naar twee nieuwe bestanden
      > resultaten <-calculate_overlaps_xor(subsets)
   5. Niet-metric die Multidimensional scaling (NMDS) voor gelijkenis analyse percelen door het uitvoeren van de functie van "plot_nmds" pakket te maken:
      > # Toon een complot van de NMDS van de monsters
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
2. Cytometrische Barcoding
   Opmerking: De code, gedetailleerde documentatie en een handleiding voor dit pakket zijn beschikbaar op http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. Ze zijn ook gepubliceerde^11,12.
   1. Ontwikkelen van een basispagina gate sjabloon voor gebruik op alle monsters.
      1. De .fcs-bestanden laden in de analysesoftware met behulp van de functionaliteit voor slepen en neerzetten.
      2. Dubbelklik op een meting en kies de parameters voor de x - en y - as van de respectieve dropdown-lijsten te openen een FSC vs. DAPI fluorescentie plot.
      3. Gebruik het gereedschap Veelhoek te reproduceren van de poort van de cel eerder gebruikt om te bepalen van het aantal geanalyseerde cellen in stappen 3.1.4.5 en 3.2.4.4 en noem deze dienovereenkomstig. Sleep de cel gate vermelding in de lijst van monster op de alle monsters-Fractie aan het zwembad.
      4. Dubbelklik op de cel-poort en corrigeren van de toewijzing van de as te visualiseren de cel gate gebeurtenissen.
      5. De subcommunities voorkomende in de steekproef set definiëren met het hulpmiddel van de elliptische gates na de gepubliceerde richtsnoeren¹² en het scannen van de wetenschappelijke stuurgroep of een andere derde parameter²¹ gebruiken om de integriteit van de poort-sjabloon. Bundelen, beheren en aanpassen van de toewijzing van de subcommunity op de andere monsters.
   2. De subcommunity van de relatieve abundanties in een txt-bestand voor gebruik in de R-script exporteren.
      1. Open de tabel editor met het tabblad bewerken.
      2. Kolommen toevoegen voor elke subcommunity die is gedefinieerd in stap 5.2.1.5 en instellen van de statistiek van de uitgang "frequentie van bovenliggende" en een naam geven.
      3. Maak de tabel in de "tabel editor" na het kiezen van opslaan de bestandsindeling en een doelmap.
         Opmerking: De analysesoftware biedt rechtstreeks subcommunity van de relatieve abundanties. Ze kunnen ook worden verkregen via divisie van de graaf van de gebeurtenis in de afzonderlijke subcommunity-poort door de graaf van de gebeurtenis in de poort van de cel. De waarden moeten worden opgeslagen in een matrix van de tabs in een txt-bestand dat niet alle n.a. velden kan bevatten en moet voldoen aan bepaalde aanvullende eisen kan worden gelezen door de R-code (zie handleiding en veelgestelde vragen voor specifieke instructies).
   3. Installeren en laden van de R-pakket en het laden van de gegevens door te voeren:
      > Bron ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Typ het pad naar de aanhalingstekens
      > setwd("")
      > # Load dataset
      > data(Cell_number_sample)
      > # Gegevens weergeven
      > Cell_number_sample [, -1]
   4. De relatieve abundanties normaliseren door het uitvoeren van de functie pakket "normaliseren":
      # Gegevens normaliseren, afdrukken van 2 cijfers
      normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
   5. Maak een streepjescode van de genormaliseerde en een boxplot van de oorspronkelijke relatieve abundanties door het uitvoeren van de "cybar_plot" pakket functie:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Plot met standaardparameters
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
   6. Maak een NMDS perceel van de oorspronkelijke relatieve abundanties.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMDS plot van genormaliseerde cel nummers
      > nmds(Normalized_mean)
   7. Maak de analyse van de correlatie van de genormaliseerde relatieve abundanties en andere parameters door te voeren van het pakket "correlatiefunctie":
      > # Load dataset
      > data(Corr_data_sample)
      > # Toon correlatie waarden
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Run correlatie analyse
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Opmerking: CHIC en CyBar afhankelijk van de relatieve abundanties. Stroom cytometry kan echter ook absolute celverwijzingen nummers, die misschien wel van groot belang voor de biotechnologische toepassingen bepalen. Om te bepalen hoeveel absolute celverwijzingen, wordt het aantal cellen in de poort van belang gedeeld door het monstervolume van het geanalyseerde. Het monstervolume van het geanalyseerde kan worden bepaald door het toevoegen van de kraal suspensie met een bekende concentratie in de steekproef (formule in aanvullende bestand 1-S7). De Bank top analyzer is bovendien uitgerust met een ware volumetrische tellen functie die direct het volume in het monsterbuisje tijdens de meting kwantificeert. Het wordt geadviseerd om te gebruiken in een groen SYBR I kleuring protocol voor het tellen van de cel.

Results

De volgende representatieve resultaten benadrukken de noodzaak van replicaat-organismen en illustreren van verschillende data visualisatie- en analysetechnieken op elk van de drie sets van de steekproef. Ze tonen de resultaten van mogelijke gegevens evaluatie pijpleidingen geschikt voor het beantwoorden van onderzoeksvragen van de standaard over de respectieve set. De voorgestelde technieken zijn echter niet exclusief voor de monster-set die zij met zijn gepresenteerd. De stroom cytometry onbewerkte gegevens publiekelijk beschikbaar met de FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 gesteld. Eerder zijn geüploade ASC-gegevens beschikbaar onder ID FR-FCM-ZYD7.

Biologische en technische replicatieonderzoeken werden gegrepen, voorbereid en geanalyseerd volgens gepubliceerde protocollen¹¹. Biologische wordt gerepliceerd van de PC en de ASC werden genomen uit drie parallelle kolven. Biologische replicatieonderzoeken voor de BC werden genomen als drie latere proeverijen op één locatie in een pilot schaal plant. Drie aliquots van één monster werden vastgesteld, gekleurd en geanalyseerd om te zorgen voor technische reproduceerbaarheid. De reproduceerbaarheid van methoden werd beoordeeld op basis van eerder gepubliceerde procedures¹¹. Een sjabloon van de poort voor alle monsters van één monster set (aanvullende bestand 1-S6) werd gebruikt voor het berekenen van de standaarddeviatie (%) per poort.

Voor de PC werd de maximale standaardafwijking van de relatieve overvloed 3.44%, terwijl de gemiddelde standaardafwijking 2,13% (Figuur 1 was). Voor de ASC en de BC waren de maximale standaardafwijkingen van de relatieve abundanties 1,27% en 0.88%, terwijl de gemiddelden van de standaarddeviaties 2,13% en 0,21% (aanvullende bestand 1-S8 waren).

Een standaardprocedure, bij het onderzoeken van een zuivere stam cultuur, is de voorbereiding van een groeicurve lag fase, de generatie tijden en de celdichtheid onder bepaalde voorwaarden analyseren. We deze procedure in combinatie met de stroom cytometrische analyse workflow te bereiken een dieper begrip van het systeem (Figuur 2). De FSC vs. DAPI fluorescentie percelen onthullen de Staten van de celcyclus van de cultuur op verschillende tijdstippen van de batch-cultuur. Een master gate sjabloon (aanvullende bestand 1-S6) werd opgericht om het kwantificeren van het percentage cellen met één (c1n), twee (c2n) en meerdere chromosomen (cXn, figuur 2B). Het overheersende aantal geënte cellen had slechts één chromosoom (93,7% bij 0 h). Dit veranderde drastisch tijdens exponentiële groei, waar bijna alle cellen die meer dan één (99,6%, 4 h) en meer dan de helft van de bevolking (53,1%) bevatte zelfs meer dan twee chromosomen. Dit illustreert P. putidas vermogen om te repliceren de chromosomen sneller dan de generatietijd van zijn.

Flow cytometrische analyse heeft bewezen zeer nuttig zijn voor het toezicht op de evolutie van microbiële gemeenschappen. Het kunt communautaire dynamiek dichterbij dan de meer resource intensieve moleculaire methoden^5,10volgen. Wij gewezen op deze dynamiek in een film en een overzicht van de actiefslibinstallatie Gemeenschap verschuivingen na verloop van tijd kreeg. Elk één seconde frame toont een FSC vs. DAPI fluorescentie-plot van een monster punt (aanvullende bestand 2). Een duidelijke verschuiving tussen dag 0 en dag 4 werd gevolgd door de oprichting van een kern-Gemeenschap na dag 7. Extra subcommunities kwam op dag 21. Wij vastgesteld een master gate-sjabloon (aanvullende bestand 1-S6) waardoor de evaluatie van microbiële dynamiek op een subcommunity niveau. Het dominante subcommunities in verschillende stadia van het experiment waren duidelijk geïdentificeerd met behulp van het hulpprogramma CyBar (Figuur 3). In combinatie met de frequentieverdeling van de subcommunity van de relatieve abundanties hielp om te selecteren poorten die interessante (significante verandering in overvloed geactiveerd op een belangrijke tijdstip) en levensvatbare (meer dan 5% relatieve overvloed) voor het sorteren en verder analyse²².

Industriële schaal bioreactor toepassingen kunnen potentiële ruimtelijke heterogeniteiten vanwege agitatie beperkingen worden geconfronteerd. Ze worden ook vaak blootgesteld aan de veranderende operationele parameters, zoals de afwisseling in de kwaliteit van de niet-synthetische substraten. De BC vertegenwoordigt van een dergelijk systeem en uit verschillende plaatsen in een dynamisch gedreven plug flow reactor werd bemonsterd. De FSC vs. DAPI fluorescentie percelen (Figuur 4) van de voorbeeldige voorbeeldpunten Toon alleen beetje ruimtelijke, maar uitgesproken temporele heterogeniteit. De BC werd verder onderzocht met behulp van beide, de snel-geautomatiseerde CHIC en de meer diepgaande master gate sjabloon gebaseerde aanpak van de CyBar.

Geautomatiseerde, snelle en onpartijdige karakter van haar, maakt de CHIC met name interessant voor on-site controle van bioprocessen in een industriële omgeving. Rauwe .fcs gegevens van alle beschikbare monsters worden vergeleken. Twee van deze vergelijkingen worden weergegeven in Figuur 5. De resultaatwaarden van de principegeloven bevestigen de eerdere opmerkingen met betrekking tot ruimtelijke en temporele heterogeniteit. De NMDS percelen gegenereerd vorm de CHIQUE tools volgens matrix (Figuur 6) verder concretiseert dit resultaat en visualiseert het dienovereenkomstig.

Bovendien, berekend we de relatieve abundanties van 23 subcommunities van de BC met behulp van een basispagina gate sjabloon (aanvullende bestand 1-S6). Een analyse van de correlatie van 48 monsters uit een periode van één jaar werd uitgevoerd om functionele betrekkingen in de microbiële Gemeenschap te begrijpen. Dit kan bijdragen tot het identificeren van de poorten van belang voor verder onderzoek (4 cel Sorteren). Sterke positieve of negatieve correlaties met abiotische parameters zoals product titers helpen kunnen te begrijpen en ecosystemen en biotechnologische processen te optimaliseren. De organische densiteit opgenomen in deze correlatie (Figuur 7) is een voorbeeld van een dergelijke abiotische parameter. G4, G5 en G10 vertonen sterke positieve correlaties en kan eventueel bevatten fermenterende soorten, terwijl de negatieve correlatie in de G8 naar methanogenic archaea hint kan.

Figuur 1: reproduceerbaarheid van cytometrische analyse van de reincultuur. FSC vs. DAPI fluorescentie Staanplaatsen met controle kralen (A, B) en bar percelen van de 3 subcommunity abundanties [%] met foutbalken vertegenwoordigen ± één standaarddeviatie (C, D). De relatieve abundanties werden vastgesteld met de sjabloon van de poort weergegeven in aanvullende bestand 1-S6. Drie biologische replicatieonderzoeken A, B en C werden genomen van de groeicurve 4 uur en drie technische replicatieonderzoeken P1, P2, P3 waren bereid van Monster A en gemeten driemaal, respectievelijk: M1, M2, M3, en worden gegeven met hun respectieve standaarddeviaties. 50.000 gebeurtenissen werden vastgelegd in de cel-poort. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: analyse van de celcyclus van de reincultuur genomen tijdens een groeicurve experimenteren meer dan 12 h. (A). FSC vs. DAPI fluorescentie percelen van de bi-uurtarief bemonsteringen die een verschuiving van de DNA-inhoud tijdens de fase van exponentiële groei vertonen. Deze meting-serie omvat geen kralen (Zie aanvullende bestand 1-S3). (B). optische dichtheid gebaseerde groeicurve met foutbalken die ± één standaarddeviatie en relatieve abundanties in de subcommunities na verloop van tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: evolutie van de actiefslibinstallatie communautaire structuur meer dan 24 dagen. (A) de flowCyBar met het bedekken van frequentie distributies gevisualiseerd in boxplots voor de afzonderlijke poorten die zijn gerangschikt door de gelijkenis van de trends, de overeenkomstige kleur toets (B) en een analyse van de gelijkenis in een NMDS perceel wit R < 0,001 () C). de onderliggende percelen worden weergegeven in de volgorde van de film in aanvullende File 2. Relatieve abundanties werden bepaald met behulp van de sjabloon poort in aanvullende bestand 1 - S6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: ruimtelijke en temporele heterogeniteit van de structuur van de microbiële Gemeenschap in industriële schaal plug flow biogas reactor. (A) de vergelijking van de structuur van de microbiële Gemeenschap van de vier bemonstering poorten I-IV op dag 223. (B) de vergelijking van de tijd afhankelijk communautaire structuur variaties van dag 0 tot dag 384 inpoort II. Het geluid heeft te laat zijn afgesneden om de visualisatie. 250.000 evenementen werden gemeten in de cel poort (aanvullende bestand 1-S6). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: cytometrische Histogram afbeelding vergelijking — CHIQUE. Het beginsel van het CHIQUE algoritme wordt geïllustreerd door het vergelijken van twee monsters ruimtelijke en temporele heterogeniteit, respectievelijk. (i) CHIQUE beelden zijn opgebouwd uit .fcs bestanden na het selecteren van twee parameters weer te geven (FSC vs. DAPI fluorescentie). De grijswaarden (0-255) codeert het aantal gebeurtenissen in een pixel. (ii) CHIQUE deelverzamelingen zijn gegenereerd na het opgeven van het gebied met cellen (hier: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) XOR combinatie image is gemaakt door het vergelijken van pixels tussen de subsets kunt weergeven. Geen verschil gelijk is aan 0 en wordt weergegeven als zwart. Maximaal verschil gelijk is aan 200 en wordt weergegeven als wit. De overeenkomstige XOR-waarde wordt berekend door de waarden van de grijsschaal van alle pixels in de XOR-afbeelding toe te voegen. (iv) combinatie overlaybeeld is gemaakt door de waarden van de grijswaarden van de pixels van de deelverzamelingen toe te voegen. Het bijbehorende overlay-waarde wordt berekend door het tellen van de pixels van een overlay-afbeelding die niet gelijk zijn aan nul en daarom informatie bevatten. (v) volgens waarden worden berekend door XOR en overlay waarden. Dit zijn de basis voor het perceel van de NMDS in Figuur 6. Zowel de principegeloven-waarden en de NMDS plot show een te verwaarlozen ruimtelijke- en een uitgesproken temporele Gemeenschap heterogeniteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: CHIC gebaseerd gelijkenis analyseresultaten van de monsters van de Gemeenschap biogas. De 0-dagen-monster werd uitgesloten van dit perceel als gevolg van de zeer verschillende communautaire structuur verstoren de analyse (aanvullende bestand 1-S11). De plot van de NMDS bevestigt de veronderstelling over lage ruimtelijke- en hogere temporele heterogeniteit gemaakt met behulp van het CHIQUE gereedschap en toegelicht in Figuur 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: correlatie analyse op de Gemeenschap biogas. De matrix was berekend aan de hand van Spearman rangorde coëfficiënt en is gebaseerd op de relatieve abundanties van 23 subcommunities, die werden vastgesteld met de master gate sjabloon in aanvullende bestand 1-S6. Ze werden gecorreleerd met de organische densiteit (OLR) voor 48 monsters uit een periode van één jaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: analyse van de gelijkenis van planktonische (P) en slib gebaseerd (S) gemeenschappen in afvalwater. Monsters werden genomen uit de primaire clarifier (PCL), geactiveerd slib bekken (AS) en digester tank (DT) voor een volledige behandeling van afvalwater (dot plots in aanvullende bestand 1-S10). Relatieve abundanties werden bepaald met behulp van de sjabloon van de poort weergegeven in aanvullende bestand 1-S6. Deze subcommunity abundanties waren ook geanalyseerd met het hulpprogramma flowCyBar om een CyBar (aanvullende bestand 1-S10) en NMDS perceel (R < 0,01). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9: fixatie stabiliteit van de reincultuur. Monsters van de groei curve experiment op 0 h genomen werden opgeslagen meer dan 28 dagen bij-80 ° C na fixatie in 15% glycerol. FSC vs. DAPI fluorescentie Staanplaatsen met controle kralen worden weergegeven. Meting serie omvat geen kralen (aanvullende bestand 1-S3). 50.000 gebeurtenissen werden vastgelegd in de cel poort (aanvullende bestand 1-S6). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende File 2: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Een succesvolle analyse van microbiële populaties en gemeenschappen vereist goed gestemde cytometers, een juiste keuze van de parameters van de cel en een betrouwbare workflow van de bemonsterings- en fixatie op weg naar de meet- en gegevens-evaluatie. De geselecteerde cel parameters moeten met de beschikbare excitatie golflengten gemaal. Wij gebruiken en raden DAPI, die zeer gevoelig is bij lage concentraties; maar moet worden opgewekt door een UV-laser, die meestal niet in de standaard cytometer set-ups bestaat. Andere kleurstoffen, zoals SYBR groene ik, ook hele populaties van de vlek of gemeenschappen, maar over het algemeen leveren lagere resoluties. Wij doen niet raden vis procedures of tests van de levensvatbaarheid in microbiële gemeenschappen. Deze benaderingen zijn onmogelijk te kwantificeren, te controleren en te besturen omdat hun effecten op de afzonderlijke soorten in de Gemeenschap is onzeker. Worden ze kunnen niet betrouwbaar getest, zolang een aanzienlijk deel van de typische gemeenschappen nog niet beschikbaar als een reincultuur is.

Kritische stappen in het protocol omvatten procedures voor bemonstering en fixatie, alsmede de cel sorteren. De bemonstering kan worden bemoeilijkt door de neiging van bepaalde reinculturen en microbiële gemeenschappen statistische aan Floc of houden aan deeltjes van de monstermatrix. Het is essentieel om te verdrijven van deze aggregaten en scheiden van de cellen in een monster vóór invoering van hen aan stroom cytometrische analyse te garanderen van betrouwbare resultaten. De gepresenteerde voorbereiding protocollen werden geoptimaliseerd zodat eencellige analyse. Een laatste 50 µm filtratie wordt uitgevoerd vóór de meting op het verwijderen van alle resterende aggregaten en verhinderen dat de 70 µm mondstuk van de cel sorter en de meetcel van de stroom van de analysator verstopping. Cel Floc uit zuiveringsinstallaties voor afvalwater zijn bijzonder overvloedig, robuuste en essentieel voor de functie van het systeem. We onderzochten de planktonische en slib gebaseerd microbiële gemeenschappen in verschillende reservoirs van een volledige behandeling van afvalwater, voor het testen van de gangbaar protocol. Het slib vormen van cel aggregaten waren duidelijk verdwenen en de samenstelling van de Gemeenschap stabiel gebleven. Bovendien tentoongesteld planktonische en slib-gebaseerde gemeenschappen opmerkelijke gelijkenis tussen hen in alle drie bemonsterde tanks (Figuur 8, aanvullende bestand 1-S10). Deze resultaten werden gecontroleerd door vergelijkende 16S rDNA amplicon sequentiebepaling van een zoet-, een formaldehyde behandelde-, een formaldehyde en ethanol gefixeerd-, en een gesorteerde monster¹⁰. Buitengewoon uitdagende milieu monsters, zoals sterke biofilms of bacteriën groeien in strak aangesloten kettingen, kan echter onmogelijk te verdrijven. Bodemmonsters kunnen bijzonder problematisch, zoals de alomtegenwoordige deeltjes in het histogram weergegeven en de cellen door enorme overvloed kunnen verdoezelen. In dergelijke gevallen moeten rangschikken van de traditionele methoden worden toegepast.

De stabiliteit van de fixatie van elke nieuwe sample set moet worden getest voordat het ontwerpen van het experiment om resultaat deugdelijkheid te waarborgen. Goede fixatie stabiliteit maakt het ook mogelijk de gepoolde kleuring en waardering van meerdere meetpunten van de tijd op één dag. Het maakt bovendien replicatie metingen en retrospectieve cel sorteren van beslissende tijdstippen na de sluiting en de definitieve evaluatie van het experiment. De stabiliteit van de fixatie van de reincultuur werd meer dan 28 dagen (Figuur 9) gecontroleerd. Voor on-site experimenten, met inbegrip van monster vervoer, moet de stabiliteit van de fixatie over langere perioden (in dit geval, 60 dagen voor de Gemeenschap van actief slib, 195 dagen voor de biogas-Gemeenschap, aanvullende bestand 1-S9) worden getest.

De kleuring is meestal niet problematisch, maar moet worden gecontroleerd met een biologische norm om toepassing van de bioinformatic evaluatie-instrumenten. We gebruikten de mock stam E. coli BL21 (DE3), die was gefixeerd volgens het protocol van ASC en opgeslagen voor gebruik in elke kleuring batch.

Afgezien van de DAPI, SYBR Green ik is met succes toegepast om op te lossen van microbiële gemeenschappen voor meerdere jaren^{14,23,24,25,26}. SYBR Green, ik kan het oplossen van gemeenschappen in hoge- en lage nucleïnezuur deelverzamelingen (HNA en LNA) met behulp van levende cellen in een online modus. DAPI, is specifieker in de binding met DNA en maakt het onderscheid van meer dan 50 subcommunities in één monster set maar vereist een fixatie stap vóór kleuring.

Cel Sorteren is een uitstekende functie van deze aanpak en kan worden toegepast als bepaalde subcommunities van de verdere rente. Het moet worden benadrukt dat noch PFA-(uitgevoerd voor slechts 30 min) noch ethanol behandeling of DAPI kleuring¹⁰ een negatief effect op de daaropvolgende 16S amplicon sequencing hadden. Potentieel invloeden van de fixatie en kleuring van procedures op subcommunity metagenome analyses nog moeten worden getest.

Een heleboel informatie over functies van de Gemeenschap en de dynamiek van de trend kan onafhankelijk van de sorteer aanpak worden verkregen wanneer waarbij bioinformatica tools community-features op een virtuele niveau van de cel door de cel te herleiden en verbinden deze functies met abiotische parameters.

Onlangs, een aantal nieuwe bioinformatics evaluatie-instrumenten, allemaal nuttig voor zowel de SYBR groene ik en de DAPI benaderingen, zijn ontwikkeld om op te lossen cytometrische Gemeenschap patronen. Dit zijn de FlowFP²⁷, de pakketten gebruikt in deze studie (flowCHIC²⁰, flowCyBar²⁸), een vastgesteld met zoet water gemeenschappen²⁹ deconvolutie-model en een instrument dat wordt gebruikt om te discrimineren stammen volgens hun fysiologische kenmerken³⁰. Bovendien kan cytometrische diversiteit bepaald²⁵ en zelfs stabiliteit eigenschappen van microbiële gemeenschappen kunnen nu worden gevolgd met een online hulpmiddel¹⁰.

Stroom cytometrische analyses hebben dus een enorm voordeel als het gaat om snelle evaluatie van microbiële gemeenschappen en mogelijk abiotische parameter correlaties. Er zijn echter nog steeds beperkingen aan de methode. Het kan niet echt online worden toegepast met het hulpmiddel van de flowCyBar, als gevolg van de ervaren gebaseerd poort instelling procedure. Bovendien zou de ontwikkeling van op maat gemaakte, makkelijk te gebruiken flow cytometers sterk vooraf de proliferatie van de aanpak van de microbiome analyse van het cytometrische van stroom. Eerste stappen in deze richting zijn ondernomen²⁸.

Toekomstige toepassingen van microbiële stroom cytometry kunnen worden voorzien in microbiële ecologie, omdat het zorgt voor de hoge frequentie opvolging binnen het bereik van bacteriële generatie tijden en het is aangetoond dat ecologisch paradigma's zijn van toepassing op gegevens van de cytometrische^{5 ,10}. De methode is zeer nuttig voor routinematige vertoningen van natuurlijke omgevingen zoals de verplichte drinkwater besturingselementen in Zwitserland³¹. Ook kan het een waardevol instrument voor medische toepassingen zoals menselijke¹⁵ of dierlijke³² microbiome screening. Daarnaast kunnen ontwikkelingen in bioinformatics microbiële stroom cytometry als een integraal sensor in het proces controles van beheerde microbiële systemen. Microbiële Gemeenschap cytometry biedt ook een screening tool voor het sorteren van de cel, waardoor hogere resolutie genomic onderzoeken van specifieke communautaire deelverzamelingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milli-Q system Synthesis A10	Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge	Merck, Darmstadt, (GER)	CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter	Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum, Milpitas, California, USA		355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software	Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F8815	350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F-8827	505/515 yellow-green fluorescent beads
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres	PolyScience, Niles, Illinois (USA)	18339	360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres	PolyScience, Niles, Illinois (USA)	17458	360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F-13081	505/515 yellow-green fluorescent beads
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX,	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software	Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters	Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Carl Roth, Karlsruhe (GER)	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)		Build number: 42398
R-software v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar	http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html