Niet-destructieve controle van afbreekbaar steiger gebaseerde weefsel-Engineered bloedvat ontwikkelen met behulp van optische coherentie tomografie

Samenvatting

Een stap voor stap protocol voor niet-destructieve en lange-termijn follow-up van het proces van vasculaire remodeling en aantasting van de steiger in real-time cultuur van biologisch afbreekbaar polymeer steiger gebaseerde weefsel-engineered bloedvaten met Pulsatiele stimulatie met behulp van optische coherentie tomografie wordt hier beschreven.

Samenvatting

Gemanipuleerde vaattransplantaten met structurele en mechanische eigenschappen die lijken op natuurlijke bloedvaten worden verwacht om te voldoen aan de groeiende vraag naar arteriële bypass. Karakterisering van de groeidynamiek en remodelleert proces van afbreekbaar polymeer steiger gebaseerde weefsel-engineered bloedvaten (TEBVs) met Pulsatiele stimulatie is cruciaal voor vaatweefsel engineering. Optische beeldvormingstechnieken opvallen als krachtige tools voor de monitoring van de vascularisatie van gemanipuleerde weefsel inschakelen met een hoge resolutie imaging in real-time cultuur. Deze paper toont een niet-destructieve en snel real-time beeldvormings strategie voor het controleren van de groei- en verbouwing van TEBVs in langetermijnkweek met behulp van optische coherentie tomografie (OCT). Geometrische morfologie wordt geëvalueerd, met inbegrip van vasculaire remodelleert proces, wanddikte en vergelijking met de dikte van de TEBV in verschillende cultuur tijdstippen en aanwezigheid van Pulsatiele stimulatie. Ten slotte, OCT biedt praktische mogelijkheden voor het real-time opvolgen van de afbraak van het polymeer in de reconstructie weefsels onder Pulsatiele stimulatie of niet en in elk segment van schip, vergeleken met de beoordeling van het gebruik van de afbraak van de polymeer scanning electron microscopic(SEM) en gepolariseerde Microscoop.

Inleiding

Weefsel-engineered bloedvaten (TEBVs) is de meest veelbelovende materiaal als een ideale vasculaire graft-¹. Met het oog op transplantaties te klinisch nuttig met soortgelijke structurele en functionele eigenschappen als inheemse vaartuigen, zijn meerdere technieken ontwikkeld om vasculaire functie^2,3. Al tijdens de implantatie en in fase III klinische studie⁴zijn er gemodificeerde schepen met aanvaardbare bij tarieven, langetermijnkweek en hoge kosten blijkt ook de noodzaak van toezicht op de ontwikkeling van TEBVs. Begrip van extracellulaire matrix(ECM) groei, remodelleren en aanpassing processen in de TEBVs in de omgeving van de chemo-mechanische biomimetische bieden cruciale informatie voor de ontwikkeling van vaatweefsel engineering.

De ideale strategie om bij te houden van de ontwikkeling van kleine diameter gemodificeerde schepen⁵ moet op niet-destructieve, steriele, longitudinale, driedimensionale en kwantitatieve. TEBVs onder andere cultuur voorwaarden kunnen worden beoordeeld door dit imaging modaliteit, zelfs met inbegrip van wijzigingen vóór en na de vasculaire transplantatie. Strategieën voor het beschrijven van de kenmerken van levende gemodificeerde schepen nodig zijn. Optische beeldvormingstechnieken toestaan visualisatie en kwantificering van weefsel depositie en biomaterialen. Andere voordelen zijn de mogelijkheid om diep-weefsel- en label-vrije beeldbewerking met hoge resolutie^6,7. Afbeelding-specifieke moleculen en minder toegankelijke optische apparatuur voor real-time bewaking is echter een aanzienlijke praktische hindernis, die de uitgebreide toepassing van niet-lineaire optische microscopie is beperkt. Optische coherentie tomografie (OCT) is een optische benadering met intravasculaire imaging modaliteit als een veel gebruikte klinische hulpmiddel bij cardiale Interventionele therapie⁸. In de literatuur is de methode van LGO werd gerapporteerd als een manier om te beoordelen van de wanddikte van TEBVs^9,10, bevestigend beeldvormende modaliteiten voor vaatweefsel engineering onderzoek wordt gekoppeld. Overwegende dat de dynamiek van gemanipuleerde vasculaire werd groei en remodeling niet waargenomen.

In dit manuscript detailleren wij de voorbereiding van biologisch afbreekbaar polymeer steiger gebaseerde TEBVs voor vier weken cultuur. Menselijke navelstreng slagaders vasculaire zachte spiercellen (HUASMCs) worden uitgebreid en in een poreuze afbreekbaar polyglycolic zuur (PGA) steigers in de bioreactor agarvoedingsbodem. Biologisch afbreekbare polymeren de rol te spelen in een tijdelijke substraat voor weefselengineering en hebben een bepaalde afbraak tarief¹¹. Met het oog op een juiste match tussen steiger afbraak en vorming van de neo-weefsel, zijn ECM en PGA steigers cruciale factoren voor effectief vasculaire remodeling. Het systeem van de perfusie simuleert de biomechanische communicatie van inheemse vaartuigen en handhaaft een consistent vervorming onder druk stimulatie.

Het doel van het voorgestelde protocol is voor het beschrijven van een relatief eenvoudig en niet-destructieve strategie voor TEBVs imaging en langdurige bewaking van cultuur. Dit protocol kan worden gebruikt voor visualisatie van morfologische veranderingen en diktemetingen van gemodificeerde schepen onder verschillende cultuuromstandigheden. Bovendien kunnen de analyses van de aantasting van het polymeer gebaseerde materialen in het weefsel engineering steigers worden uitgevoerd voor de identificatie. Door het combineren van methoden voor het scannen van elektronen microscopic(SEM) en gepolariseerde Microscoop gebruikt in dit protocol, correlatie en kwantificering van extracellulaire matrix distributie en aantasting van de PGA kunnen worden gemaakt, die kan vergemakkelijken beoordeling steiger afbraak gecombineerd met OCT beeldvorming.

Protocol

1. afbreekbaar PGA steiger op basis van weefsel-engineered vaartuigen cultuur

1. PGA steiger Fabrication
   1. Naai de PGA mazen (diameter van 19 mm en 1 mm dik) rond silicone slangen gesteriliseerd met ethyleenoxide (17 cm lengte, 5.0 mm diameter en 0,3 mm dik) met 5-0 hechtdraad.
   2. Naai de polytetrafluorethyleen (ePTFE, 1cm lengte) met 4-0 hechtdraad op elk uiteinde van PGA Maas en overlapt door 2 mm.
   3. Dompel PGA steigers met de hand in 1 mol/L NaOH voor 1 min te passen de ruimtelijke structuur van de Maas en geniet met weefselkweek rang water drie keer, gedurende 2 minuten elk. Voorzichtig pat droog het schavot met een papieren zakdoekje telkens. Vervolgens opdrogen steigers in een kap met een blower gedurende 1 uur.
2. Vergadering van bioreactor en de Y-junction voor OCT imaging
   1. Geniet van de zelf ontwikkelde glas cilindrische bioreactor (10 cm diameter en 11,7 cm in hoogte met vier lippen binnen en vier kant-armen buiten de reactor zoals afgebeeld in Figuur 1), PGA steigers, Siliconen slang (uitwendige diameter 5 mm, dikte 0,3 mm), biocompatibel buizen, connectoren, roer bar en apparatuur voor montage in een 95% ethanol tank voor 2 h.
   2. Trek PGA steiger door kant-wapens van de bioreactor verbonden aan één zijde voorzien van een connector, evenals een andere kant bij de Y-junction gebruikt voor het leveren van OCT guidewire. Een ander PGA steiger in de bioreactor monteren op dezelfde manier. Zie Figuur 1.
   3. Passen ePTFE aan bioreactor lippen door aanscherping met 4-0 hechtingen.
   4. Zet de bioreactor in de ethanol bak weer voor 1 h en overnachting in kap met blower op opdrogen.
3. Zaaien van HUASMCs en statische Bioreactor Conditioning
   1. Isoleren HUASMCs van menselijke navelstreng slagaders door standaard explant technieken.
   2. Uitbreiden en onderhouden van cellen in gladde spieren cel groeimedium samengesteld uit DMEM medium, 20% foetale runderserum, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL penicilline G, 50 µg Mo/mL proline, 20 µg Mo/mL alanine, 50 µg Mo/mL glycine, 1,5 µg/mL CuSO4, ascorbinezuur 50 µg Mo/mL , 10 ng/mL basis fibroblast groeifactor en 10 ng/mL bloedplaatjes afkomstige groeifactor.
   3. De HUASMCs van het zaad in een concentratie tussen 5 × 10⁶ cellen/mL in het bovenstaande kweekmedium op de PGA steigers.
   4. Zet een roer bar (1,5 cm lengte) in de bioreactor. Plaats een vultrechter (diameter 5 mm, 15 cm lengte) en drie korte buis segmenten (diameter 5 mm, lengte 7 cm) voor gasuitwisseling via het silicone kurk deksel.
   5. Hechten PTFE 0,22 µm filters aan elke verandering luchtslang en één heparine GLB naar de vultrechter. Aanpassen van de roer-bar met een opzwepende snelheid van 13 rondes per minuut. Monteren het glas bioreactor, siliconen kurk deksel en PGA steiger in het systeem van de cultuur.
   6. Toestaan HUASMCs te houden voor 45 min door leunend de bioreactor elke 15 min met standaard, links en rechts. De poorten van de reactor en de gewrichten worden afgedicht met paraffine film.
   7. Sluit de Luo-gij pomp, PBS tas, de chauffeur met biocompatibel buizen als de perfusie-systeem. Open de drive te vullen de buizen met PBS.
   8. Plaats de algehele bioreactor in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 ° C. Vul de cultuur kamer met 450 mL gestolde voedingsbodem HUASMCs.
   9. Druk op de stopknop en schakel de stroom van het apparaat rijden. Groeien de geplaatste steigers onder statische cultuur gedurende één week.
   10. Wijzigen van het kweekmedium elke 3-4 dagen door aspirating de helft van het oude medium via de vultrechter en het bijvullen van de reactor met een equivalente hoeveelheid verse kweekmedium.
4. Voorbereiding van het systeem van de perfusie van OCT imaging
   1. Pomp vloeistoffen in de zak van de PBS te circuleren door middel van biocompatibel buizen en terug naar de zak.
   2. Open de kracht van het stuurprogramma en reguleren pomp instelling met een frequentie van 60 slagen per minuut en output systolische druk van 120 mmHg. Aanpassen van de mechanische parameters volgens de behoeften van engineering vasculaire weefselkweek.
   3. Klik op uitvoeren om het systeem van de perfusie werken te maken. Bieden de bovenstaande vaste Pulsatiele stimulatie voor de vaartuigen voor 3 weken door het iteratief Drukbehandeling biocompatibel buizen^10,12 na 1 week van statische cultuur.

2. uitvoeren van optische beeldvorming met OCT

1. Gebruik een lichtbron om de axiale resolutie van 10-20µm en de diepte van 1-2 mm ter identificatie van de structuur van de TEBV op basis van de frequentie-domein OCT intravasculaire imaging systeem⁹.
2. Zet de schakelaar en open de afbeelding capture software.
3. De vezel optische beeldvorming katheter verbinden met de drive-motor en optische controller (DOC) met katheter automatische retraite functie.
4. Instellen van de parameters van de beeldsnelheid van de verwerving tot 10 beelden per seconde met een snelheid van de automatische pullback van 10 mm/s.
5. Bevestig imaging katheter naar Y-kruising via heparine cap met een naald 18G.
6. Plaatsen van de katheter in de silicone buis en identificeren van de hechtdraad krapte van PGA Maas alvorens PGA steiger op de bioreactor te laden.
7. Plaats het uiteinde van de katheter op de regio van belang. Pas de pullback apparaat en het selectievakje voor de beeld kwaliteit⁸.
8. Verwerven van beelden op 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 dagen in cultuur voor elke afzonderlijke TEBV en opeenvolgend opslaan met real-time observatie van de microstructuur van de TEBV, met inbegrip van bovengrondse morfologie, de interne structuur en de samenstelling.
9. Herhaal de meting voor 3 keer om betrouwbare meting van gemodificeerde schepen telkens. Vastleggen van een reeks beelden in de gehele testen met behulp van de image capture software.

3. beeldvorming analyse

1. Gebruik de software van de analyse van de afbeelding voor het meten van de wanddikte van de TEBV. Selecteer de afbeelding te analyseren. Klik op de tracking tool om te identificeren van de binnenzijde van de TEBV door de software automatisch en handmatig schets de buitenzijde. Een diagram van dikte wordt weergegeven op het scherm.
2. Herhaal de meting voor 5 keer om betrouwbare meting van de constructies. De OCT-analyse werd uitgevoerd door twee onafhankelijke onderzoekers verblind tot de verkregen informatie.

4. de oogst van TEBV en weefsel verwerking

1. Open het silicone kurk deksel geplaatst over de bioreactor wanneer de cultuur is voltooid en gooi het kweekmedium. EPTFE van bioreactor lippen los en snijd de silicone tubes van de buitenste zijde van de ePTFE met een schaar. Oogst TEBVs uit de bioreactor en snijd in secties voor het scannen van elektronenmicroscopie onderzoek.
2. Neem de rest van de TEBVs en snijd in 4 µm dik secties. Trek de ondersteunende Siliconen slang en herstellen van secties met 4% paraformaldehyde. Het uitvoeren van routinematige histologische kleuring van Masson van trichrome en Sirius rode te onderzoeken van de morfologie van collageen en PGA^10,13,14.
3. Om te beoordelen PGA inhoud en collageen component, observeren histologische monsters met Sirius rode kleuring door een gepolariseerde Microscoop. PGA overblijfselen zijn duidelijk afgebakend door middel van dubbele breking en het restant gebied kan worden gekwantificeerd op basis van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede¹⁰.

Resultaten

Het driedimensionale cultuur-systeem bestaat uit een kamer van de cultuur in de bioreactor en het systeem van de perfusie met een gesloten vloeistof cyclus^10,13 (Figuur 1). De OCT imaging katheter werd ingevoegd in het distale einde van de Y-junction en trok zich terug in de silicone buis voor imaging. OCT imaging werd voor het eerst gebruikt om af te bakenen de structurele karakterisatie van het biol...

Discussie

Ontworpen voor het genereren van vaartuigen met structurele en mechanische eigenschappen die lijken op die van de inheemse bloedvaten kunnen leiden tot het verkorten van de tijd voor klinisch gebruik en is het ultieme doel van vasculaire engineering. Optische beeldvormingstechnieken toestaan de visualisatie van weefsel ontworpen vasculaire specifieke onderdelen die individuele constructies in cultuur en blootstelling transplantaties aan een cultuur omgeving zonder de steriliteit⁷niet controleren. ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PGA mesh	Synthecon
silicone tube	Cole Parmer
connector	Cole Parmer
intravascular OCT system	St. Jude Medical, Inc	ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic	Philips	FEI Philips XL-30
polarized microscope	Olympus	Olympus BX51
sutures	Johnson & Johnson
pulsatile pump	Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software	St. Jude Medical, Inc