Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58041

⸱

3 augustus 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation (Yantai University), Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

In dit artikel

Samenvatting

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Samenvatting

Met de stijgende prevalentie van neurodegeneratieve ziekten is het steeds belangrijker om te begrijpen van de onderliggende pathofysiologie, dat tot neuronale disfunctie en verlies leidt. Fluorescentie gebaseerde imaging tools en technologieën inschakelen ongekende analyse van subcellular neurobiologische processen, maar er nog behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen is voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies . We hebben een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie gebaseerde imaging studies met behulp van Drosophila modellen van neurodegeneratie ontwikkeld. Specifiek, beschrijven we een aanpak van het gemakkelijk-aan-volg, semi-geautomatiseerde Fiji/ImageJ met twee cellulaire processen te analyseren: ten eerste, we kwantificeren totale eiwitgehalte en profiel in de Drosophila optic kwab met behulp van fluorescentie-gelabeld mutant huntingtin eiwitten; en ten tweede, wij beoordelen autophagy-lysosoom flux in het visuele systeem van de Drosophila met ratiometric gebaseerde kwantificering van een tandem fluorescerende verslaggever van autophagy. Nog belangrijker is, bevat het protocol hier geschetste een semi-automatische segmentatie stap om ervoor te zorgen dat alle TL structuren worden geanalyseerd om te minimaliseren van selectie bias en om resolutie van subtiele vergelijkingen te verhogen. Deze aanpak kan worden uitgebreid voor de analyse van andere cel biologische structuren en processen betrokken in neurodegeneratie, zoals eiwithoudende puncta (stress korrels en synaptische complexen), zo goed als membraan-gebonden afdelingen (mitochondriën en membraan mensenhandel blaasjes). Deze methode biedt een gestandaardiseerde, maar aanpasbare referentiepunt voor beeldanalyse en kwantificering, en kon vergemakkelijken van betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid over het veld, en uiteindelijk mechanistische inzicht van neurodegeneratie vergroten.

Inleiding

Neurodegeneratieve ziekten miljoenen mensen elk jaar en de incidentie neemt toe met een verouderende bevolking1. Terwijl elke neurodegeneratieve ziekte heeft een unieke etiologie, zijn aggregatie van eiwitten van de misfolded en de verdeling van het proteostasis-netwerk gemeenschappelijk pathologische kenmerken van veel van deze ziekten. Ophelderen hoe verstoring van deze fundamentele en onderling verbonden processen misgaat is om bij te dragen tot de neuronale cel en dysfunctie dood essentieel voor het begrip van neurodegeneratieve ziekten, alsmede het begeleiden van therapeutische interventies. Fluorescentie gebaseerde beeldvorming voorziet in onderzoek van deze complexe en dynamische processen in neuronen en heeft bijgedragen aan ons begrip van de neuronale celbiologie. Analyse van fluorescently tagged eiwitten is uitdagend, met name wanneer de experimenten zijn uitgevoerd in vivo, als gevolg van de zeer compacte weefsels, diverse celtypes en morfologische heterogeniteit. Handmatig geassisteerde kwantificering is betaalbaar en eenvoudig, maar is vaak tijdrovend en onder voorbehoud van menselijke bias. Daarom is er behoefte aan een onpartijdige, reproduceerbaar zijn, en toegankelijk benaderingen voor het extraheren van meetbare gegevens van imaging studies.

We hebben een eenvoudige en flexibele workflow met behulp van Fiji/ImageJ, een krachtige en vrij toegankelijke beeldverwerking software2,3, kwantitatieve om gegevens te extraheren uit imaging fluorescentiestudies in experimentele modellen van geschetst neurodegeneratie met behulp van Drosophila. Door het volgen van dit protocol om te kwantificeren aggregatie van eiwitten en autophagic flux — twee biologische functies die zeer relevant voor neurodegeneratieve ziekte pathologie zijn cel — we de gevoeligheid en de reproduceerbaarheid van deze aanpak aangetoond. Onderzoek van fluorescently tagged mutant huntingtin (Htt) eiwitten in de Drosophila optic kwab bleek het aantal, de grootte en de intensiteit van de eiwit-aggregaten. Wij een tandem fluorescerende verslaggever van autophagic flux binnen het visuele systeem van Drosophila , waarin verschillende emissie signalen afhankelijk van de compartimentaire omgeving4gevisualiseerd. Ratiometric gebaseerde analyse van de tandem verslaggever toegestaan voor een kwantitatieve en compleet beeld van autophagy-lysosoom flux van autophagosome formatie, rijping en vervoer tot degradatie in het lysosoom en daarnaast gemarkeerd kwetsbaar compartimenten verstoord in neurodegeneratieve omstandigheden. Nog belangrijker is, in beide analyses uitgevoerd we semi-geautomatiseerde drempelmethode en segmentatie stappen in ons protocol aan onbewuste bias te minimaliseren, vergroten van de macht van de bemonstering en bieden een standaard om vergelijkingen tussen soortgelijke studies. De eenvoudige werkstroom is bedoeld om krachtige Fiji/ImageJ plugins (ontwikkeld door informatici die zijn gebaseerd op wiskundige algoritmen) toegankelijker voor neurobiologists en de biowetenschappen Gemeenschap in het algemeen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. overwegingen en preparaten voor het ontwerpen van het beeld analyse Experiment

  1. Vooraf geschikt anatomische, mobiele of subcellular markeringen om te dienen als monumenten voor standaardisering van een regio van belang (ROI) in verschillende verschillende steekproeven, bijvoorbeeld 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), membraan markers, gelokaliseerde TL eiwit, enz.
  2. Selecteer een fluorescerende markering die discrete puncta buiten achtergrondniveaus voor de structuur van belang bakenen kan.
    Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd voor eiwithoudende structuren (b.v., misfolded eiwit-aggregaten) en membraan-gebonden organellen (b.v., autophagy verslaggever). Om te visualiseren aggregatie van eiwitten, was een fragment van de RFP-gelabeld N-terminal van menselijke Htt eiwit met een pathogene polyQ tract 138 herhalingen (RFP-hHttQ138) gebruikte5. De mutant Htt proteïne vormt cytoplasmatische aggregaten als uitgedrukt onder neuronale specifieke stuurprogramma's zoals elav-GAL45,6. Om te visualiseren autophagosome-lysosoom flux, werd Actine-GAL4 gebruikt om de uitdrukking van de tandem mCherry-GFP-Atg8a verslaggever overal te rijden. mCherry - en GFP-positieve puncta geven autophagosomes en de flux zoals GFP fluorescentie is uitgeblust in het zure milieu van de lysosoom, waar zuur-ongevoelig mCherry blijft totdat de proteïne aangetaste7 iswordt gecontroleerd. Voor de analyse van de ratiometric, kan een enkellijns thats een consistente marker van de structuur worden gebruikt voor segmentatie of eventueel dat een projectie van twee of meer kanalen kan worden gebruikt om af te bakenen structuren, hoewel niet expliciet beschreven in dit protocol. In dit voorbeeld wordt mCherry gebruikt voor segmentatie van Atg8-positieve deeltjes, zoals het zuur-ongevoelig is en in het compartiment in de gehele flux door middel van het traject blijft.
  3. Download en installeer de open beeld analyse sourceplatform ImageJ of Fiji — de gewenste verdeling van ImageJ met gebundeld plugins2,3.
  4. Installeer de plugin voor h-maxima interactieve waterscheiding.
    Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van Fiji; extra plugins kan worden verlangd voor ImageJ. De plug-in ontwikkeld door Benoit Lombardot voor SCF-MPI-CBG is beschikbaar online (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
  5. Navigeer naar "Help | Update", selecteer"Update-sites beheren"van de"ImageJ Updater", kies de SCF-MPI-CBG update-site in de lijst, sluit de database en start opnieuw op Fiji.

2. brain dissectie en immunofluorescentie kleuring

  1. Zorg silicone-elastomeer omzoomde dissectie gerechten.
    1. Giet siliconen elastomeer componenten in een bekerglas zoals aangegeven door de fabrikant en roer goed tot goed gemengd.
    2. Gebruik een pipet om te vullen van 5 cm weefselkweek gerechten, een derde tot de helft vol (ongeveer 10 mL van het mengsel van de elastomeer). Laat alle bellen opstijgen naar de oppervlakte en zachtjes verwijderen met papieren zakdoekje. Dekking van de gerechten en leg ze op een vlakke ondergrond om te genezen gedurende 48-72 uur bij kamertemperatuur (RT).
  2. Ontleden Drosophila hersenen en visuele systeem indien nodig.
    1. Uitvoeren van Drosophila dissectie van de hersenen als eerder beschreven8,9. Voer de dissectie in elastomeer omzoomde dissectie gerechten, met behulp van een elastomeer bodem te stabiliseren van de hersenen om te voorkomen dat schadelijke weefsel of pincet.
    2. De lamina intact te houden tijdens de dissectie, Schuif twee pincet onder het netvlies en zachtjes scheuren door het midden van het oog om te verwijderen van het netvlies. Trek weg een retinale weefsel gehecht aan de lamina met een tang die evenwijdig aan het oppervlak van de lamina gehouden.
      Opmerking: Resterende pigment zal afwassen in de volgende stappen en meestal niet interfereert met antilichaam kleuring en beeldvorming.
    3. Verdun 37% formaldehyde in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 3,7% verse vóór gebruik in een 500 µL microcentrifuge buis. Breng de ontleed hersenen aan microcentrifuge buis met fix oplossing en incubeer gedurende 15 minuten op RT met zachte rockende.
      Opmerking: Formaldehyde heeft een natuurlijke neiging om te worden geoxideerd, productie van mierenzuur. Daarom is het voorgestelde aan aliquot de 37% formaldehyde voor opslag en vul aan tot 3,7% vers vóór elk gebruik. Overmatige fixatie of onder fixatie zal van invloed zijn op de integriteit van de weefsels en fluorescentie10.
    4. Wassen 3 keer met PBTx (PBS met 0,4% Triton X-100) voor elke 15 min.
  3. Uitvoeren van immunohistochemistry en mount exemplaren.
    1. Als antilichaam kleuring nodig is, verwijderen van PBTx, toevoegen van primair antilichaam verdund in PBTx met 5% normale geit serum en incubeer op een aliquoot mixer's nachts bij 4 ° C.
    2. Verwijder primair antilichaam en 3 keer wassen met PBTx voor elke 15 min. Toevoegen van secundair antilichaam verdund in PBTx met 5% normale geit serum en incubeer gedurende 1 h op RT of overnacht bij 4 ° C. 3 keer wassen met PBTx voor elke 15 min.
    3. Desgewenst DAPI kleuring is verwijderen van PBTx, voeg DAPI oplossing (stockoplossing: 5 mg/mL, Verdun tot een concentratie van de werken van 15 µg/mL in PBTx), en incubeer gedurende 10 min op RT. Wash 3 keer met PBTx voor elke 15 min.
    4. Schakel het weefsel, breng een druppel van montage medium in het midden van een dia microscopie met een spacer van één laag van duidelijke tape aan beide zijden. Breng de hersenen op de daling van montage medium, en 1-2 min wachten totdat de hersenen transparant wordt. Verwijder voorzichtig het medium van de montage met een pipet.
    5. Om te monteren, een daling van verse montage medium op de hersenen van toepassing op de dia. Zorgvuldig overlay een cover glas bubbels te vermijden. Zegel van de randen met rubber-cement en luchtdroog op RT voor 20 min. doorgaan naar Beeldacquisitie voor de beste resultaten.

3. de Beeldacquisitie

  1. Microscoop verwerving parameters, met inbegrip van ruimtelijke resolutie, doelstelling, zoom, scansnelheid, optimaliseren en stap grootte, resolutie van de structuren van belang om semi-automatische segmentatie tijdens beeldanalyse maximaliseren.
    Opmerking: Het kan nuttig zijn te vangen een voorbeeldafbeelding en semi-automatische segmentatie (in stap 5 van dit protocol) test voordat u alle experimentele monsters imaging. Op deze manier kan de gebruiker imaging instellingen aanpassen zodat de analytische instrumenten kunnen gemakkelijk onderscheiden van de biologische structuur van belang.
  2. Afstellen afbeelding detector te vangen de hoogste signal-to-noise verhouding en de hoogste dynamisch bereik van het specimen.
    1. Gebruik een LUT (zie tabel) die aangeeft pixel verzadiging (blootstelling te hoog) of undersaturation (offset te laag) terwijl de instellingen (figuur 3B, rode geeft pixel verzadiging door een Hi/Low LUT) aan te passen.
    2. Controleer of de winst en offset instellingen zijn geschikt voor alle experimentele groepen, zoals experimentele manipulaties waarschijnlijk de structuur van belang wijzigen.
      Opmerking: Het is noodzakelijk dat dezelfde instellingen voor alle groepen worden gebruikt om kwantitatieve vergelijkingen te maken.
  3. Beeld door het weefsel te vangen alle gegevens.
    Opmerking: Het wordt aangeraden om alle beschikbare gegevens te vangen tijdens één sessie van de beeldvorming en een nauwkeuriger om gebied te definiëren tijdens ROI selectie in stap 4 indien nodig.
  4. Sla de afbeelding als het bestandstype, ondersteund door de denkbaar software om te bewaren van de metagegevens zoals acquisitie parameters en ruimtelijke kalibratie. Sla de afbeelding op met een bestandsnaam met inbegrip van experimentele datum, genetische achtergrond en fluorescerende verslaggevers, antilichamen en kleurstoffen die overeenkomt met de kanalen gescand zoals [de naam van de experimentele groep] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _Ch1. [Fluorophore-target /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye], enz.

4. Fiji/ImageJ afbeelding importeren en ROI selectie

  1. Een afbeelding openen in Fiji. Gebruik het dialoogvenster "Bio-formaten importopties", kies "weergave stack met: Hyperstack" en "kleurmodus: grijswaarden".
    Opmerking: Het wordt aanbevolen de Microscoop om bestandstype te openen, als metagegevens zoals ruimtelijke kalibratie kan worden gelezen door Fiji.
  2. Identificeer een gebied uit een enkel z-vliegtuig of een projectie op basis van de marker zender (s) die kan worden gebruikt als een gestandaardiseerde ROI over specimens (Figuur 1, ROI selectie).
    1. Gebruik de schuifbalk "C" te bekijken van de zender (s) gebruikt voor het vastleggen van de marker(s) in stap 1.1 aangewezen.
    2. Gebruik de schuifbalk "Z" om te doorlopen van de focale vliegtuigen. Kies een enkel sneetje of een projectie van meerdere segmenten maken door te klikken op "afbeelding | Stapels | Z project"en stel"Start slice"en"Stop slice"te omvatten van de ROI.
      Opmerking: Instellen van het type " "projectie "naar"Max intensiteit"in het"Z-project"dialoogvenster vaak het best geschikt is om te benadrukken van de structuren voor segmentatie in paragraaf 5, hoewel dit misschien niet geschikt voor alle toepassingen. Als een ander type projectie vereist voor analyse is, zorg op te slaan en dit bestand als zodanig voor functie extractie in sectie 6 en/of 7 document.
    3. Genereer een nieuwe afbeelding met de zender (s) en focale plane(s) van belang zijn voor het vereenvoudigen van de volgende stappen in het beeld-analyse-protocol. Selecteer "afbeelding | Dubbele", stel de gewenste"kanalen"(c) en"Segmenten"(z), en wijzig de bestandsnaam aan van de selectie (bijv., [Experimental groepsnaam] [naam van het Specimen] _ _ [experimenteren date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
  3. Gebruik een van de "selectiegereedschappen" op de Fiji-werkbalk handmatig selecteren een gestandaardiseerde ROI op basis van de selectiecriteria bepaald in stap 4.2.
  4. De ROI toevoegen aan de ROI-manager door te klikken op "Analyze | Tools | ROI-Manager "en klik op"Toevoegen"in het menu van de Manager van de ROI. De ROI behoeden voor het menu ROI Manager door te klikken op "meer | Save", en geef de naam van het bestand aan de ROI (bv, [Experimental groepsnaam] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Kanalen] _ [z-plane(s)] _ [ROI description]).
    Opmerking: Dit kan worden geopend in Fiji voor latere analyses of kan worden toegepast op andere kanalen of de beelden zoals in punt 5.3.

5. voorbewerken en segmentatie met h-maxima Watershedding

  1. Uitvoeren voorbewerken op het kanaal dat wordt gebruikt om vast te leggen van de structuren van belang.
    1. Als het afbeeldingsbestand uit meerdere kanalen bestaat, scheidt u de kanalen door te klikken op "afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen"te isoleren van het kanaal van belang.
    2. Toepassen van een filter zoals een mediaan filter om ruis of Gaussiaans vervagen voor het vloeiend maken door te klikken op "proces | Filters | Filtertype"(bijvoorbeeld"Mediaan Filter"of"Gaussian Blur").
      1. Proef verschillende filters en parameters op beelden uit elke experimentele groep filteren. Doorloop stap 6.2 met een representatief voorbeeld van elke groep om te controleren van de prestaties van de segmentatie. Selecteer het filter en de instellingen die de segmentatie van de structuren van belang te vergemakkelijken.
    3. Het opnemen van het filter en de instellingen. Deze parameters gelden verschillende experimentele groepen.
    4. Een kopie van de afbeelding opslaan als een TIFF-bestand met inbegrip van het toegepaste filter voor referentie. Gebruik een gedetailleerde naam zoals [Experimental groepsnaam] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Channel] _ [z-plane(s)] _ [Filter met parameters].
  2. Segmentatie van de structuren van belang met het hulpprogramma voor het stroomgebied van interactieve h-maxima op de voorverwerkte afbeelding gegenereerd en opgeslagen in stap 5.1 uitvoeren.
    1. Met de voorverwerkte beeld actief in Fiji, de h-maxima interactieve waterscheiding tool te starten door te klikken op "SCF | Labeling | Interactieve H_Watershed".
      Opmerking: Deze plugin eerst berekent de waterscheiding en vervolgens kan de gebruiker te onderzoeken van de effecten van lokale maxima en drempel opties over segmentatie door middel van een direct bijgewerkte output afbeelding.
    2. Selecteer op het bedieningspaneel zaad dynamics (h), intensiteit drempel (T) en piek overstromingen (%) voor het optimaliseren van segmentatie aanpassen.
      Nota: Verwijs altijd naar de onbewerkte afbeelding vóór het voorbewerken van punt 4.2 handmatig controleren van prestaties van de segmentatie van de structuren van belang.
    3. Wanneer tevreden met de resultaten van de segmentatie, selecteer "Export masker van de regio's" en kies "Export". Hierdoor genereert u een binaire beeld van de resultaten van de waterscheiding (Figuur 1, segmentatie).
    4. Opnemen van de segmentatie parameters; deze parameters moeten worden toegepast over experimentele groepen voor kwantitatieve vergelijkingen. Het masker van de binaire resultaten opslaan indien gewenst ter referentie met segmentatie parameters gedetailleerd in de naam zoals [de naam van de experimentele groep] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Kanalen] _ [z-plane(s)] [Filter met parameters] _ _ [H_Watershed parameters].
  3. Pak de structuren van belang uit de resultaten van de waterscheiding.
    1. Open de opgeslagen ROI uit stap 4.4, in de manager van de ROI. Met de binaire gebieden masker uit stap 5.2.4 actieve, selecteer u de ROI van de manager van de ROI toe te passen op de afbeelding om te beperken functie winning tot de gestandaardiseerde ROI.
    2. Met de ROI die actief zijn op het binaire waterscheiding masker, kies "Analyze | Analyze deeltjes"met"Toevoegen aan Manager"geselecteerd in het dialoogvenster extraheren van functies.
      Opmerking: Dit zal toevoegen een deeltje-id voor elke structuur afgebakend tijdens segmentatie naar de Manager van de ROI. Opties zijn beschikbaar in dit menu om uit te sluiten van functies op basis van grootte of cirkelvormigheid indien nodig om structuren die zijn opgenomen in de analyse te verfijnen.
    3. De deeltjes opslaan door te klikken op "meer | Save"uit het menu van de manager ROI. Ervoor zorgen dat de id's zijn uitgeschakeld en alle deeltjes zal alle in een zip-bestand kunnen worden opgeslagen. Gebruik een gedetailleerde naam zoals [de naam van de experimentele groep] [naam van het Specimen] _ _ [Experiment datum] _ [Kanalen] _ [z-plane(s)] [Filter met parameters] _ _ [H_Watershed parameters] _ [structuren].

6. hoeveelheid, ruimte, en kwantificering van de intensiteit en analyse

  1. Open de onbewerkte afbeelding gegenereerd en opgeslagen in stap 4.2. Ga naar het kanaal dat wordt gebruikt voor het vastleggen van de structuren van belang.
    Opmerking: Het is cruciaal voor het nemen van metingen van de intensiteit van de onbewerkte afbeelding (vóór het voorbewerken) als het toepassen van filters in stap 5.1 wijzigingen de pixelwaarden.
  2. Open de deeltjes verkregen functie extractie in stap 5.3 en selecteer 'Alles weergeven' van de Manager van de ROI.
    Opmerking: Deze actie zal een overzicht van elk deeltje op de "ROI Manager" op het beeld overlay en moet overeenkomen met de randen van de structuren van belang (Figuur 1, functie extractie).
  3. Instellen van de gewenste afmetingen door te klikken op "Analyze | Instellen van metingen".
    Opmerking: Het gebied, de intensiteit en de dichtheid van de deeltjes kunnen worden gemeten door "ruimte" en "geïntegreerde dichtheid" te kiezen. Als geïntegreerde dichtheid is geselecteerd, Fiji zal produceren twee waarden: 'Geïntegreerde dichtheid' berekend als het product van het gebied en de gemiddelde grijswaarde en 'Raw geïntegreerde dichtheid' gemeten als de som van pixelwaarden. Dichtheid van de fluorescente proteïne in de deeltjes wordt berekend als de som van pixelwaarden gedeeld door het gebied. Het aantal deeltjes gegenereerd in stap 5.3 geeft de hoeveelheid deeltjes binnen het weefsel dat ROI gedefinieerd in stap 4.4.
  4. Kies in het menu ROI Manager "Maatregel". De resultaten worden uitgedrukt in gekalibreerde eenheden, zolang de metingen zijn ontleend aan bestanden in Fiji afgeleid naar de denkbaar software. De resultaten uit het resultatenvenster kopiëren en plakken in spreadsheet-software voor de compilatie en verdere berekeningen.

7. Ratiometric kwantificering en Data-analyse

  1. Voer stap 6.1 en 6.2 openen deeltje-id op de eerste ruwe kanaal van belang.
  2. Instellen van de gewenste afmetingen door te klikken op "Analyze | Instellen van metingen".
    Opmerking: De gemiddelde intensiteit per deeltje kan worden gemeten door te kiezen voor "Betekenen Gray waarde".
  3. Van de Manager van de ROI Selecteer "Maatregel". Gegevens uit resultatenvenster kopiëren en plakken in spreadsheet-software.
  4. De "C" scrollbar naar het tweede rauwe kanaal van belang, GFP in dit voorbeeld (figuur 4A), en herhaal stap 7.2. en 7.3.
    Opmerking: De deeltjes opgeslagen in stap 5.3 standaard het kanaal en het segment waaruit het is gegenereerd. Oppassen deeltjes worden toegepast op het juiste kanaal van belang.
  5. Berekenen van de verhouding van de intensiteit van een kanaal aan de intensiteit van de tweede voor elk deeltje in de spreadsheet-software.
  6. Gebruik een scatterplot visualiseren en ratiometric gegevens van fluorophores die vertonen van afzonderlijke wijzigingen weerspiegelend van onderliggende biologische processen te kwantificeren.
    1. Genereer een scatterplot in de grafische software.
      Opmerking: Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een structuur van belang waar de intensiteit van de eerste fluorophore van belang is de waarde"x" en de intensiteit van de tweede fluorophore is de "y-waarde" gemeten vanaf elk deeltje.
    2. Drempels voor elk fluorophore te definiëren van de kwadranten gating instellen
  7. Lijn-profiel gebruiken om te visualiseren fluorophore intensiteit over een structuur van belang.
    1. Selecteer een ROI gegenereerd in stap 5.3 en gebruik het lineaire gereedschap op de werkbalk om te tekenen van een rechte lijn door de ROI. Voeg de regel ROI naar de Manager van de ROI.
    2. Voor elk kanaal van belang, met de regel ROI actief is, selecteert u "Analyze | Plot van profiel".
      Opmerking: De plot profiel functie genereert een histogram plot en een tabel met de waarden van de intensiteit langs de lijn. Resultaten gemeten vanaf elk kanaal en plakken in spreadsheet-software voor het genereren van een perceel met beide kanalen langs de lijn kopiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kwantificering van het aantal, het gebied en de intensiteit van fluorescently tagged mutant Htt aggregaten in de Drosophila optic kwab

Om te onderzoeken misfolded eiwit samenvoeging in het centrale zenuwstelsel van een Drosophila model van de ziekte van Huntington, RFP-gelabeld mutant menselijke Htt met een niet-pathologische (UAS-RFP-hHttQ15) of pathologische uitbreiding ( UAS-RFP-hHttQ138) en m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier geschetste protocol kan worden gebruikt om krachtig en reproducibly kwantificeren cel biologische processen gevisualiseerd door fluorescentie gebaseerde imaging. Biologische context en technische beperkingen moeten zorgvuldig worden overwogen bij de proefopzet. Fluorescerende markers van subcellular structuren van belang, of immunohistochemische, kleurstof gebaseerde of genetisch uitgedrukt, moet worden onderscheiden boven achtergrond door morfologie en intensiteit. De UAS/GAL4 -systeem wordt veel gebrui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de Sheila en David Fuente neuropatische pijn onderzoek programma Graduate Fellowship (naar J.M.B.), de Lois Pope LIFE Fellows Program (aan cl, Y.Z., en J.M.B.), de Snyder-Robinson Foundation predoctoraal Fellowship (naar cl), de Dr. John T . Macdonald Stichting (CL), contracten, subsidies van de National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 en R56NS095893 (voor R.G.Z.), en door Taishan geleerde Project (provincie Shandong, Volksrepubliek China) (R.G.Z.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer KitDow Corning CorporationPF184250Dissectiebak
Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriologische Petri-schaalCorning351008Dissectiebak
Dumont #5 PincetFine Science Tools11251-20Dissectietool
NatriumchlorideSigmaS3014PBS-oplossing
Natriumfosfaat Dibasisch SigmaS5136PBS-oplossing
Kaliumfosfaat MonobasischSigmaP5655PBS-oplossing
Triton X-100SigmaT9284Was- en antilichaam incubatieoplossing. 
37% FormaldehydeVWR10790-710Fixatie
Weggeef microcentrifugebuisjes (0,5mL, blauw)VWR89000-022Fixatie, wassen en antilichaam incubatie. 
Vlakke en matte Micro Slides (25×75mm)VWR48312-004Glijbanen voor confocale beeldvorming
Micro Dekglasjes, rechthoekig (22×40mm)VWR48393-172Glijbanen voor confocale beeldvorming
RubbercementSlime1051-AMonteren
VECTASHIELD Antifade Montage MediumVector Laboratories, Inc.H-1000Monteren
Scotch Magic 810 Onzichtbaar Plakband (19mm×25.4m)3M Company810Monteren
Normaal GeitenserumThermo Fisher ScientificPCN5000Antilichaam incubatie
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher ScientificD1306Kleurstof voor nucleïnezuur. Oplossen in gedeïoniseerd water om een stockoplossing van 5 mg/mL te maken en bewaren bij -80°C. Verdun tot een werkconcentratie van 10-20 μg/mL in PBTx.
3,5X-90X Stereo Zoom Inspectie Industriële MicroscoopAmScopeSM-1BNZDissectiescoop. Uitgerust met 6W LED Dual Gooseneck Verlichter
ImageJ/FijiNIHv1.51uMet SCF_MPI_CBG plugins (versie 1.1.2)
FV1000-IX81 Confocale-laser Scanning MicroscoopOlympus
Recombinant ConstructBloomington Drosophila Stock CenterBL37749

Referenties

  1. Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
  2. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  3. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671(2012).
  4. Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
  5. Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
  6. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
  7. DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
  8. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
  10. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  11. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
  12. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
  13. Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057(2015).
  14. Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887(2008).
  15. Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).
  16. Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
  17. Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
  18. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  19. Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
  20. Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
  21. Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
  22. Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
  23. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Neurodegeneratie bij Drosophilafluorescentie-imagingImageJ-analyseeiwitaggregatenautofagiefluxsemi-geautomatiseerde segmentatieoptische lobHuntingtine-eiwitAtg8-reporterfluorescentiemarkering
Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.