Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58043

⸱

26 juni 2018

 ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Embryology, University Medical Centre Göttingen

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Samenvatting

Bij actieve presynaptische zenuw terminals ondergaan synaptische vesikels cycli van exo- en endocytose. Tijdens de recycling, worden de luminal domeinen van SV transmembraan eiwitten op het celoppervlak blootgesteld. Een van deze proteïnen is Synaptotagmin-1 (Syt1). Een antilichaam gericht tegen het luminal domein van Syt1, eenmaal is toegevoegd aan het kweekmedium, wordt tijdens de exo-endocytotic cyclus in beslag genomen. Deze opname is evenredig aan het bedrag van SV recycling en kan worden gekwantificeerd door immunofluorescentie. Hier combineren we Syt1 antilichaam opname met dubbele transfectie van gekweekte hippocampal neuronen. Hierdoor is ons (1) lokaliseren presynaptische sites die zijn gebaseerd op expressie van recombinante presynaptische markering Synaptophysin, (2) het bepalen van hun functionaliteit met behulp van Syt1 opname en (3) karakteriseren de doelgerichtheid en de gevolgen van een proteïne van belang, GFP-Rogdi.

Inleiding

Bestuderen van synaptic vesikel recycling is belangrijk bij het bepalen hoe presynaptische eigenschappen, tijdens de Synaptische plasticiteit of in reactie op verstoring van synaptische functie wijzigen. Synaptotagmin-1 (Syt1) bestuderen biedt antilichaam opname een methode voor het meten van de hoeveelheid SV recycling. Syt1 is een SV-geassocieerde proteïne dat fungeert als een Ca2 + sensor en is noodzakelijk voor de exocytotic release van de neurotransmitter1,2. Het is een transmembraan eiwit met een C-terminal cytoplasmatische domein buiten de SV en een N-terminal luminal domein binnen de SV-3. Tijdens exocytose, wordt het luminal domein van Syt1 blootgesteld aan het externe medium. We toevoegen naar deze externe medium, antilichamen gericht tegen de cytoplasmatische domein, waardoor het geëigd tijdens endocytose maken wordt. Deze antilichamen kunnen dat hetzij vooraf geconjugeerd met fluorophores of immunostained met secundaire antilichamen4,,5,,6,7. De intensiteit van de fluorescentie van de resulterende immunosignal is evenredig aan het bedrag van SV recycling. Deze benadering kan worden gebruikt om te bepalen zowel de constitutieve en de depolarisatie-geïnduceerde SV recycling6,8.

Syt1 opname testen kunnen worden uitgevoerd na virus-gemedieerde genoverdracht op vrijwel alle cellen in de schotel of na sparse transfectie van een klein aantal cellen. Onze methode combineert de bepaling met sparse dubbele transfectie van primaire hippocampal neuronen met calciumfosfaat9. We gebruiken een recombinant marker eiwit bekend te accumuleren op presynapses, fluorescently tagged Synaptophysin, zoek presynaptische terminals en overexpress onze proteïne van belang, Rogdi. Daardoor kunnen we om te testen of Rogdi doelstellingen functionele synapses en treft SV recycling. Het gen Rogdi codering was het oorspronkelijk geïdentificeerd in een scherm voor Drosophila mutanten gekenmerkt door verminderde geheugen10. Mutaties in het Rogdi-gen veroorzaken bij de mens, een zeldzame en verwoestende ziekte heet het syndroom van Kohlschütter-Tönz. Patiënten lijden aan tandheelkundige glazuur misvormingen, pharmacoresistant epilepsie en psychomotorische vertraging; de subcellular localisatie van het gen product bleef echter ongrijpbare11. Aldus, is de bepaling van de opname Syt1 vastgestelde belangrijkste bewijs voor de lokalisatie van GFP-gelabeld Rogdi bij functionele synapsen9.

Deze opname-techniek heeft meerdere voordelen. Eerst, SV recycling waarneembaar zowel in real-time als door het uitvoeren van levende imaging7,12, en na fixatie6,9 door het meten van de intensiteit van de fluorescentie van het label van de fluorescentie Syt1. Bovendien hebben verschillende varianten van Syt1 antilichamen ontwikkeld. Er zijn niet-gelabelde varianten die kunnen gelabeld zijn met een secundair antilichaam dat een standaard immunokleuring protocol na fixatie, en vooraf geconjugeerd varianten met een reeds bevestigd etiket van fluorescentie. Tenslotte is de fluorescentie antilichamen gebaseerde voordelige als gevolg van de grote selectie van verkrijgbare secundaire of geconjugeerd kleurstoffen die kunnen worden gebruikt.

Wanneer vaststelling en immunokleuring de neuronen, het is ook mogelijk om de vlek voor extra eiwitten en colocalization analyses uit te voeren. Dit kan helpen bepalen waar zij zich bevinden met betrekking tot recycling SVs. De intensiteit van de fluorescentie-label is de directe maat voor de hoeveelheid SV recycling. Bovendien, label de antilichamen selectief Syt1-bevattende structuren, wat resulteert in hoge specificiteit en weinig achtergrond fluorescentie4. Stimulatie van de verschillende protocollen kunnen ook worden gebruikt, zoals de depolarisatie buffers of elektrische stimulatie protocollen9,12,13,14. Basale SV recycling kan echter worden gemeten zonder het stimuleren van de neuronale culturen15.

Onze werkwijze richt zich specifiek Syt1 antilichaam opname in neuronen met secundair antilichaam immunolabeling dubbel-transfected na fixatie. Echter, verwijzen we naar alle routinematig gebruikte varianten van de bepaling in onze discussie kijkers de gelegenheid te geven zich aan te passen van het protocol aan specifieke behoeften.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Geen studies met levende dieren werden uitgevoerd. Experimenten met dieren om te verkrijgen van cel culturen werden goedgekeurd door de autoriteiten van de plaatselijke dierenbescherming (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) onder de goedkeuring euthanized nummer T10/30. De experimenten werden uitgevoerd met de goedgekeurde protocollen.

1. primaire Hippocampal celkweek

  1. Bereiden de gedissocieerde celcultuur van de rat hippocampus van embryonale dag 1916,17. Plaat van de cellen op 12 mm coverslips bekleed met polyethyleneimine (PEI) in 24-well gerechten bij een dichtheid van 50.000-60.000 cellen per putje. Controleer de dichtheid met behulp van een cel tellen kamer en fase contrast optiek.
  2. Cultuur de neuronen voor 3 dagen (dag in vitro (DIV) 3) in een 24-well plaat in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
  3. Beoordelen van de coverslips voor indicatoren van cell gezondheid met doorvallend licht microscopie (bijvoorbeeld fase contrast optiek bij een vergroting van 10-20 X). Controleer of de volgende indicatoren van een goede gezondheid: een duidelijke fase contrast halo, neurites zonder beaded structuren, en geen soma clustering of neurite bundelen.

2. de Transfectie

Opmerking: Het volgende protocol verwijst naar een dubbele-transfectie voor 3 putten. Het protocol werkt echter best wanneer er voldoende voor 4 putten bedragen worden opgesteld.

  1. Bereiden van 500 mL voor Transfectie buffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM nb2HPO4, 15 mM glucose, 42 mM HEPES) in een erlenmeyer.
    1. Los 8,0 g NaCl, KCl 0,37 g, 0.095 g nb2HPO4, 1,35 g van glucose, en 5.0 g HEPES in 400 mL gedestilleerd water in een erlenmeyer.
    2. Breng de pH op 6,95 met 1 M NaOH met behulp van een pH-meter.
    3. Regel het volume met gedestilleerd water tot 500 mL en controleer de pH met behulp van een pH-meter.
    4. 20-30 mL aliquots van transfectie buffer met de volgende pH-waarden maken door pipetting 1 M NaOH aan de transfectie buffer: 6,96 6.97 6,98, 6.99, 7,00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7,06, 7,07, 7,08, 7.09, 7.11.
      Opmerking: De pH van de buffer van de transfectie is cruciaal voor de doeltreffendheid van de transfectie.
    5. Om te testen welke transfectie buffer leidt tot het hoogste aantal transfected cellen, testen van elke waarde van de pH van 6,96 aan 7.11. Gebruik de methode van de transfectie beschreven in 2.2-2.11 en een gevalideerde plasmide GFP uitdrukken. Bepaal het aantal transfected cellen per dekglaasje aan voor elke transfectie buffer pH waarde om te beoordelen welke buffer het beste werkt.
    6. Aliquot de buffer met de hoogste efficiëntie van de transfectie in 2 mL microcentrifuge buizen bevriezen en opslaan van de buizen bij-20 ° C.
  2. Vooraf warme de verlaagde serum medium, cel kweekmedium en gedestilleerd water tot 37 ° C in het waterbad.
  3. De transfectie mix in een tube van 1,5 mL microcentrifuge voor te bereiden. Werken onder de motorkap van de laminaire flow om steriele arbeidsomstandigheden.
    1. Mix 7.5 µL van 2 M calciumchloride met 4 µg voor elke endotoxine-gratis DNA (Synaptophysin-mOrange en mGFP/GFP-Rogdi). Voeg water tot een totaal volume van 60 mL in de tube van een 1,5 mL microcentrifuge.
    2. Voeg 60 mL buffer van de Transfectie aan de mix. Voor de beste resultaten, voeg de transfectie buffer ontkleuring terwijl het schudden van de DNA-mix zachtjes op de vortex.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten. Vermijd de incubatie buis schudden tijdens de incubatietijd door het plaatsen van de buis naast de laminaire flow kap.
  4. Onder de motorkap van laminaire flow, verwijder het kweekmedium cel ("geconditioneerde medium") de putjes met behulp van een pipet 1000 mL en bewaar het in een aparte container in de incubator.
  5. Voeg 500 mL van verminderde serum medium toe aan elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 tot de 20 minuten incubatie periode (stap 2.3.3).
  6. Voeg 30 mL voor Transfectie mix aan elk putje door pipetteren enkele druppels. Gooi het residu aan de onderkant van de buis.
  7. Nadat alle de putjes zijn geleverd met transfectie mix, schud zachtjes de 24-well plaat zodat de verdeling van de transfectie mix in het medium.
  8. Incubeer de putjes gedurende 60 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
  9. Verwijderen en verwijderen van de transfectie mix en driemaal wassen met cel kweekmedium. 1 mL van cel kweekmedium aan elk putje en hen Incubeer gedurende 30 seconden bij RT. verwijderen 750 mL van medium en voeg toe de dezelfde hoeveelheid verse medium. Herhaal dit drie keer.
    Opmerking: De wassen stap is essentieel. Houd de tijd die elk goed geen medium minimaal heeft (dwz., verwijderen en vervangen van goed-door-well) en het medium wassen voorzichtig toe te voegen.
  10. Verwijderen en verwijderen van het kweekmedium cel en voeg 450 mL van de geconditioneerde middellange goed-door-put.
  11. Laat de neuronen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 DIV 10 volwassen.

3. stimulatie en Syt1 opname

Opmerking: Het volgende protocol geldt de opname 3 putjes. Voor de depolarisatie van een ander nummer van putten, de bedragen dienovereenkomstig aanpassen.

  1. Bereiden 10 x depolarisatie buffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM glucose, 200 mM HEPES, pH 7.4) in een conische kolf van 50 mL.
    Opmerking: Depolarisatie buffer kan worden bewaard bij 4 ° C voor enkele weken. Als een niet-depolarizing oplossing ook gebruikt wordt, bereiden een 10 x Tyrode de oplossing bestaande uit 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glucose, 200 mM HEPES pH 7.4 te vergelijken stimulatie-geïnduceerde recycling met spontane recycling. Na verdunning 1 x, voeg 1 µM van tetrodotoxine vóór gebruik te blokkeren actiepotentiaal generatie.
    1. Los 1.87 g NaCl, KCl, 0,1 g MgCl2-6 H20, 0.15 g CaCl2-2 H2O en 3,0 g glucose-1 H2O en 2,38 g. van HEPES in 50 mL gedestilleerd water in een erlenmeyer 2.61 g. Breng de pH met NaOH en steriele-filter de oplossing. De buffer 1:10 verdunnen in gedestilleerd water tot een concentratie van 1 x.
  2. Voorbereiden op 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS (pH 7.4) fixatie na stimulatie.
    1. Voor 500 mL 4% PFA in 1 x PBS, los 20 g paraformaldehyde in 450 mL gedestilleerd H2O.
      Opmerking: Verwarming van de oplossing kan versnellen oplost, maar doen niet Verwarm de oplossing meer dan 70 ° C, zoals de PFA kan desintegreren.
      Let op: PFA is teratogene, toxische en potentieel kankerverwekkend. Draag handschoenen bij het werken met PFA, werken onder de zuurkast en vermijden van inname.
    2. Laat de oplossing afkoelen aan RT en voeg 50 mL van de 10 x PBS stamoplossing. Breng de pH op 7.4 met NaOH/HCl met behulp van een pH-meter.
  3. Vooraf warm 600 mL 1 x depolarisatie buffer en 10 mL cel kweekmedium tot 37 ° C in het waterbad.
  4. Voeg 1 mL muis anti-Syt1 antistof (kloon 604.2) naar de 1 x depolarisatie buffer en vortex gedurende 10 seconden.
  5. Verwijderen en verwijderen van de cel cultuurmedium van de cellen. Voeg 200 mL van het mengsel van de depolarisatie-antilichaam elk goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 in de incubator.
  6. Verwijderen en verwijderen van de depolarisatie-antilichaam-mix en driemaal wassen met cel kweekmedium. 1 mL van cel kweekmedium aan elk putje en incubeer gedurende 30 seconden bij RT. verwijderen 750 mL van medium en voeg toe de dezelfde hoeveelheid verse medium. Herhaal dit drie keer.
  7. Verwijderen en verwijderen van het kweekmedium cel en voeg 300 mL 4% PFA in 1 x PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
  8. Wassen drie keer, gedurende 5 minuten met 1 x PBS.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. immunocytochemie

  1. 50 mL blokkeerbuffer voor te bereiden.
    Opmerking: Blokkeerbuffer kan worden bewaard bij-20 ° C voor enkele maanden.
    1. Los 2,5 g van sacharose en 1 g bovien serumalbumine (BSA) in 5 mL 10 x PBS stamoplossing. Voeg 1,5 mL 10% wasmiddel stamoplossing. Roer de oplossing totdat alle onderdelen goed hebben opgelost en gedestilleerd H2O toevoegen tot het bereiken van een eindvolume van 50 mL. Aliquot de oplossing en het bevriezen van de aliquots voor opslag.
  2. Verdun het antilichaam van het secundaire, fluorophore-combinatie (gericht tegen de primaire Syt1-antilichaam-soorten) in 200 mL blokkeerbuffer in elk putje bij een verdunning van 1:1000.
  3. Verwijderen en verwijderen van de PBS 1 x van elk putje met een dekglaasje aan.
  4. Voeg 200 mL van het blokkeren van de buffer-antilichaam mix aan elk putje en incubeer gedurende 60 minuten op RT.
    Let op: Omdat de secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn, alle stappen vooruit moeten worden uitgevoerd in het donker.
  5. Na incubatie, door de cellen te wassen drie keer, gedurende 5 minuten met 1 mL 1 x PBS.
  6. De coverslips op Microscoop dia insluiten met het insluiten medium.
    1. Voeg een 7 mL druppel medium op het microscoopglaasje te embedding. Verwijder het dekglaasje aan uit de 24-well plaat door tillen met een spuit en het grijpen met een tang.
      Let op: Cellen op het oppervlak van het dekglaasje aan zijn gemakkelijk beschadigd, waardoor deze pincet moeten met zorg worden behandeld.
    2. Dompel het dekglaasje aan in gedestilleerd water te verwijderen van de PBS en droog het zorgvuldig door het aanraken van een van de randen tot een zacht weefsel.
    3. Spiegelen het dekglaasje aan op de insluiten middellange druppel, zodat de uitvoering van de cellen van het microscoopglaasje zijde, waardoor de cellen te embedding in het insluiten medium.
  7. Laat de dia's te drogen onder de motorkap voor 1-2 h (dek ze Voorkom blootstelling aan licht) en bewaar ze in een Microscoop dia doos bij 4 ° C.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

5. de microscopische analyse

  1. Nadat de coverslips droog is, plaats ze onder de microscoop met de doelstelling en de camera.
  2. De belichtingstijd voor elk kanaal zodanig aanpassen dat enkele pixels zijn overbelicht om ervoor te zorgen maximale verspreiding van grijze waarden.
    Opmerking: Hoewel de belichtingstijd tussen de kanalen variëren kan, moet het constant voor één kanaal om vergelijkbaarheid tussen de coverslips.
  3. Verwerven van meerkanaals beelden voor 10 regio's van belang (ROIs) per dekglaasje aan. Controleer de ROI bevat axonale processen van een transfected neuron door het controleren van GFP-fluorescentie, die moet worden punctate.

6. statistische analyse

  1. De beelden als .tif-bestanden exporteren. Laden van de beelden in OpenView18 door te klikken op bestand | Load image-bestand.
  2. Kies de afbeelding van de Synaptophysin-mOrange als kanaal 1, het beeld van de Rogdi-GFP/mGFP zoals 2-kanaals en het beeld van de fluorescentie Alexa647 als kanaal 3.
  3. Drempel de ROIs.
    1. Klik op analyse | Plaats gebied over puncta. Kies waarden voor drempel en Delta intensiteit zodat bij visuele inspectie, diffuse fluorescentie is uitgesloten, waardoor alleen punctate signalen naar het beeld van kanaal 1 (vertegenwoordigt Synaptophysin-mOrange fluorescentie). Houd de dezelfde drempel voor alle afbeeldingen.
  4. Deze ROIs naar de bijbehorende zender 2 (GFP-Rogdi/mGFP fluorescentie) en 3 (Syt1-fluorescentie) van elk gebied dekglaasje aan overbrengen door te klikken op nu uitvoeren.
    Opmerking: De ROIs moeten alleen worden overwogen indien de cel dubbel-transfected. Bij deze methode moet mOrange - en GFP-fluorescentie duidelijk zichtbaar zijn.
  5. Sla de gegevens in de analyse log-editor door te klikken op logboekgegevens.
  6. Open de editor log analyse op het tabblad Windows en kopieert u de waarden voor elk kanaal. De waarden voor de afzonderlijke kanalen in een werkblad plakken.
  7. Het bepalen van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie van het Syt1-kanaal op de ROI in beide transfectie voorwaarden (GFP-Rogdi en mGFP).
  8. Toepassing van passende statistische proeven zoals de Student t-test om te bepalen van verschillen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een verwacht resultaat van deze aanpak is het lokaliseren van ongeveer 50 double-transfected neuronen per dekglaasje aan bij een dichtheid van 50.000 neuronen per putje. De axon van elk neuron wordt verwacht om te laten zien van meerdere hotspots van fluorescently-tagged Synaptophysin accumulatie, clusters ofSVs aangeeft. Op functionele presynaptische sites colocalizes de recombinante Synaptophysin signaal met punctate Syt1 fluorescentie. Het gebruik van dubbele transfectie, is GFP-Rogdi ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn drie testen routinematig gebruikt bij het bestuderen van synaptic Vesikel (SV) recycling. De eerste twee omvatten het gebruik van een) fluorescerende styryl kleurstoffen zoals FM1-43 (die nemen in membranen, bij endocytose in organellen omhoog worden genomen en worden uitgebracht na exocytose); en b) fluorescently gelabeld recombinante eiwitten van SV (die op overexpressie, integreren in de eiwithoudende recycling machines). Als de bijgevoegde fluorophores hun fluorescentie afhankelijk van de pH wijzigen, kunnen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Irmgard Weiss voor deskundige technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de DFG via het Cluster of excellence voor microscopie op het nanometer bereik en moleculaire fysiologie van de hersenen (CNMPB, B1-7, T.D.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
B27Gibco17504-044
BSASigmaA7030-50g
CaCl2Sigma-AldrichC3306-100g
CoolSNAP HQ2Photometrics
dH2OInvitrogen15230
DABCOMerck8.03456.0100
donkey anti mouse Alexa 647Jackson-Immunoresearch715605151antilichaam
DMEMInvitrogen41966
DPBSGibco14190
Eppendorf tubesEppendorf30120094
multiwell 24 wellFisher Scientific087721H
buis (50 mL)Greiner Bio-One227261
FBS superiorBiochromAGS0615
GlucoseMerck1.083.421.000
HBSSInvitrogen14170
HEPESSigmaH4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)ThermoElectron Corporation
KCLSigma-AldrichP9541-500g
L-GlutaminGibco25030
MgCl2HoneywellM0250-500g
microscope slidesFisher Scientific10144633CF
Microsoft ExcelMicrosoft
Mowiol4-88Calbiochem475904
NaClBioFroxx1394KG001
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NeurobasalInvitrogen21103049
OpenView Experiment Analysis ApplicationGratis software, zie opmerkingengeschreven door Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israël
PBS (10x)Roche11666789001
OptimemInvitrogen31985
PenstrepGibco15140-122
PFASigmaP6148-1kg
safety hoodThermoElectronSerienummer 40649111
SucroseneoFroxx1104kg001
Synaptotagmin1Synaptic Systems105311muis monoklonaal; klon 604.2
Triton X-100Merck1.086.031.000
Vortex Genius 3 IKA3340001
Water bathGFL1004
Zeiss Observer. Z1 Zeiss

Referenties

  1. Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
  2. Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
  3. Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
  4. Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
  5. Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
  6. Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27(2014).
  7. Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
  8. Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
  9. Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
  10. Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
  11. Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
  12. Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
  13. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  14. Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246(2018).
  15. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
  16. Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
  17. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
  18. Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
  19. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
  20. Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
  21. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
  22. Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
  23. Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
  24. Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
  25. Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
  26. Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
  27. Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
  28. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
  29. Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
  30. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
  31. Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
  32. Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  33. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
  34. Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
  35. Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
  36. Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
  37. Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Synaptotagmine-1-opnamegekweekte hippocampale neuronendubbele transfectiesynaptofysine-mOrangeGFP-Rogdi-colokalisatieimmunofluorescentie-kwantificeringdepolarisatiebufferanti-Syt1-antilichaampresynaptische terminals
Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.