Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Behoud van de biologische culturen en meten van de genexpressie in Aphis Oleanderpijlstaart: een Non-modelsysteem voor Plant-insect interacties

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58044

⸱

31 augustus 2018

 ,  , 
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

In dit artikel

Samenvatting

De bladluis Aphis Oleanderpijlstaart koloniseert op zeer verdedigd planten uit de familie van de onderfamilie (Apocyanaceae) en biedt tal van mogelijkheden om te studeren plant-insect interacties. Hier presenteren we een reeks van protocollen voor het onderhoud van de installaties en de bladluis culturen, en de generatie en de analyse van moleculaire en - dienst gegevens voor A. Oleanderpijlstaart.

Samenvatting

Bladluizen zijn uitstekende experimentele modellen voor een verscheidenheid van biologische vragen variërend van de evolutie van symbiose en de ontwikkeling van polyphenisms tot vragen rond insect interacties met hun waardplanten. Genomic middelen zijn beschikbaar voor verschillende soorten van de bladluis, en met vooruitgang in de volgorde van de volgende generatie, transcriptomic studies worden uitgebreid tot niet-modelorganismen dat het gebrek aan genomen. Bovendien kunnen de bladluis culturen worden verzameld uit het veld en gekweekt in het laboratorium voor het gebruik in organisch en moleculaire experimenten om de kloof tussen ecologische en genetische studies. Laatst, veel bladluizen kunnen worden gehandhaafd in het laboratorium op hun voorkeur gastheerplanten in eeuwigdurende, parthenogenic levenscycli waardoor vergelijkingen aardlingen reproduceren genotypen. Aphis Oleanderpijlstaart, de Kroontjeskruid-oleander bladluis, biedt een dergelijk model om te studeren insect interacties met giftige planten met behulp van zowel organisch als moleculaire experimenten. Methoden voor het genereren en het onderhoud van de installaties en de bladluis culturen in de serre en laboratorium, DNA en RNA extracties, microsatelliet analyse, DOVO transcriptome assemblage en aantekening, transcriptome differentiële expressie analyse en qPCR verificatie van differentially uitgedrukte genen zijn geschetst en hier besproken.

Inleiding

Bladluizen zijn kleine, hemimetabolous insecten die op uiteenlopende plantenfamilies wereldwijd koloniseren. Ze zijn meest onderscheidende voor verschillende functies, met name complexe productlevenscyclus met cyclische parthenogenese en discrete polyphenisms, en hun obligate voeding symbiose met bacteriën of de gist endosymbionten die voedingsstoffen ontbreekt te verstrekken hun dieet van plant sap1. Terwijl de meeste bladluizen gastheer plant specialisten zijn, sommige soorten generalist zijn belangrijk gewas plagen, toebrengen van aanzienlijke economische schade op gewassen hetzij rechtstreeks of via de ziektekiemen en virussen zij2vector. De publicatie van het eerste bladluis genoom in 2010, de erwt bladluis Acyrthosiphon pisum3, een belangrijke mijlpaal in de studie van biologie van de bladluis gemarkeerd omdat daarin de genomic middelen voorzien in aanpak vragen over het insect aanpassingen aan de herbivore leefstijlen, waaronder bronnen die tot een beter beheer strategieën4 leiden kunnen. Sinds die tijd, hebben extra genomic middelen opgebouwd met de publicatie van een geannoteerde genoom voor de soja bladluis Aphis glycines5en -openbaar hele genoom bronnen voor een andere drie-bladluis soort (groene cerasi (black cherry bladluis), Groene perzikluis (perzik-aardappel bladluis), Rhopalosiphum padi (gewone vogelkers-haver bladluis)6. Waardevolle DOVO transcriptomic bronnen zijn beschikbaar alsook voor een aantal andere soorten bladluis (e.g.,Aphis gossypii (katoen bladluis)7, Sitobion avenae (graan bladluis)8, Cinara pinitabulaeformis (pine bladluis)9, Aphis Oleanderpijlstaart (Kroontjeskruid-oleander bladluis)10).

Bladluizen heb ook blijvende bijdragen aan ons begrip van de plant-insect interacties en de ecologie van het leven op planten11. Een gebied waar de bladluizen bijzonder belangrijke bijdrage hebben geleverd is in ons begrip van de chemische ecologie van de gastheer plant interacties. Plantenetende insecten uiten diverse aanpassingen voordeel voor overwinnen plant verdediging, en sommige zelfs plant verdediging voor hun eigen coöpteren12,13,14. Bijvoorbeeld, is de Kroontjeskruid-oleander bladluis, Aphis Oleanderpijlstaart, een fel geel, invasieve bladluis gevonden in gematigde en tropische gebieden wereldwijd die op planten uit de familie Kroontjeskruid (maagdenpalmfamilie koloniseert). Planten uit de familie maagdenpalmfamilie geëvolueerd verschillende chemische verdediging, met inbegrip van melkachtig latex en cardiale glycosiden bekend als cardenolides, die de vervoerder catie Na, K-ATPase binden en doeltreffend afschrikmiddel dienen tot generalist herbivoren15, 16. Kroontjeskruid specialisten express verschillende modi bestandheid tegen cardenolides en sommige selectief of passief accumuleren of wijzigen van cardenolides in hun weefsels als een middel om af te schrikken van predatie of voor andere voordelen17. A. Oleanderpijlstaart wordt gedacht aan het sekwestreren cardenolides op deze manier, hoewel de mechanismen en functionele voordelen onduidelijk10,18 blijven.

Gezien de genomic middelen bij de hand, geeft A. Oleanderpijlstaart een uitstekend experimenteel model voor de studie van de moleculaire en genetische mechanismen die betrokken zijn bij de chemo-ecologische interacties tussen toxische gastheerplanten en hun specialist herbivoren. Het is vermeldenswaard dat, terwijl enkele van de vroegste studies van A. Oleanderpijlstaart gericht op reductie van cardenolides19, sinds die tijd, studies van A. Oleanderpijlstaart inzicht in een breed scala van evolutionaire en ecologische aangelegenheden verstrekt hebben, met inbegrip van de genetische structuur van invasieve insecten20 en de wisselwerking tussen de verordening van onderop en de top-down op de herbivoor dichtheid21. A. Oleanderpijlstaart is dus een goede kandidaat als een experimenteel model voor een bijzonder breed scala van studies van de plant-insect interacties. Kritiek voor het succes van een studie met A. Oleanderpijlstaart is de zorgvuldige cultuur van bladluis populaties, waarin de cultuur van planten waarvan de bladluizen afhankelijk zijn, evenals een efficiënte generatie van hoge kwaliteit - dienst gegevens. Ons doel is om te leiden de lezer door beide. Hieronder zijn methoden voor het genereren en het onderhoud van de installaties en bladluis culturen in de broeikasgassen en laboratorium, DNA en RNA extracties, microsatelliet analyse, DOVO transcriptome vergadering en aantekening, transcriptome differentiële expressie analyse en qPCR verificatie van differentially uitgedrukte genen. Terwijl deze methoden zijn geschreven voor A. Oleanderpijlstaart, kunnen het algemene kweken, extractie en analyse methoden vergroot worden tot een verscheidenheid van soorten van de bladluis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. plant culturen

  1. Zaden aanschaffen bij een commerciële leverancier of verzamelen van volwassen planten in het veld.
    Opmerking: Dit protocol is geschikt voor de meeste commercieel beschikbare Kroontjeskruid soorten (bijvoorbeeld Asclepias incarnata, A. curassavica, A. syriaca, Gomphocarpus physocarpus). Sommige zaden wellicht worden koude-gelaagde en instructies van de leverancier van het zaad moeten worden gecontroleerd.
  2. Plant de zaden in een fijne kiemende bodem (60-70% fijne veenmos, perliet, vermiculiet, kalksteen).
    1. Vul een lade standaard zaailing met kiemkracht mix bodem; ervoor te zorgen dat de bodem de top van de putten bereikt. Controleer in elk putje, een kuiltje maken een gat in de bodem over een 3 cm diep.
    2. Plaats een zaad in elk gat en water zeer goed met een gieter zodat de bodem heeft betrekking op de zaden en is verzadigd.
    3. Groeien van zaden in een kas (zie voorwaarden hieronder, 1.5). Regelmatig water dagelijks om elk-ander-dag; genoeg om het bodemvocht naar een matig niveau.
  3. Wanneer de zaailingen hebben hun eerste set van volledige bladeren gegroeid, opnieuw pot zaailingen in een algemene potgrond mengen (50 – 60% veenmos, schors en kalksteen) (Figuur 1).
    1. Gebruik 4-inch ronde potten die bij een strakke verbinding met het kopje kooien passen. Vul met algemene potgrond tot ongeveer 5 cm onder de rand.
    2. Maak een gat in de bodem diep genoeg om de onderkant van de pot.
    3. Met de hand, de volwassen zaailing uit de put schep voorzichtig en plaats het diep in het gat in de pot van 4 inch. Dekken de zaailing met de bodem. Water erg goed.
    4. Planten groeien in de serre en het water regelmatig, dagelijks naar elke andere dag; genoeg om te handhaven matig bodemvocht.
  4. Broeikasgassen voorwaarden.
    1. Stel de broeikasgassen thermostaten om overdag temperaturen tussen 18-28 ° C en 's nachts temperaturen tussen 16-22 ° C met behulp van de instructies van de fabrikant.
    2. Tijdens de wintermaanden wanneer de dagen korter zijn, een aanvulling op het daglicht met 600 W hogedruk natrium lampen (12 h, 8 am-8 pm).
  5. Controle van ongewenste ongedierte (bijvoorbeeld, trips, bladluizen) met een naalden biologische zeepoplossing, echter, het gebruik van deze producten met de nodige voorzichtigheid.
    1. De zeepoplossing volgens de aanbevelingen van de fabrikant te maken en toe te passen met behulp van een spuitfles.
    2. Laat de zeep op de planten voor 4-24 h. Spoel zachtjes de planten met water te verwijderen van de zeep 4-24 h na toepassing en spoel ze met water een tweede tijd vóór gebruik met laboratorium bladluis culturen.
  6. Cultuur de gemiddelde bladluis bevolking op planten die ten minste 3-4 sets van volledige bladeren gegroeid en ten minste 10 cm hoog (Figuur 1B).

2. bladluis culturen

  1. De bevolking van de bladluis laboratorium starten vanuit een bestaande lab isoclonal bevolking of starten vanaf het veld-verzameld bladluizen volgens de aanwijzingen hieronder.
    1. Wanneer een laboratorium bevolking vanaf een bestaande lab isoclonal bevolking, overbrengen bladluizen zoals beschreven in 2.3.1–2.3.3.
  2. Wanneer starten de nieuwe isoclonal, veld-verzameld bladluis populaties en plaats van een enkele, weergeven, volwassen bladluis op een geschikte waardplant, zoals vermeld in stap 1.6.
    Opmerking: Populaties kunnen gestart worden vanaf gevleugelde (mond) of ongevleugelde (apterous) volwassenen.
    1. Handmatig controleren planten uit de kas voor ongewenste ongedierte voorafgaand aan het gebruik met laboratorium bladluizen. Bevriezen van alle planten met ongewenste bladluizen. Indien gewenst, gebruik een ethanol vacuüm kolf trips of ander ongedierte te verwijderen.
      Opmerking: Zorg ervoor dat planten die zijn behandeld met zeep vóór gebruik zoals beschreven in stap 1.5.2 afspoelen.
    2. Veilig overbrengen een enkele volwassen bladluis met behulp van een penseel of een mond pipet gemaakt met ID 3/16" x 1/4" OD kunststof buis, een 1.000 µL pipette uiteinde en een 2,00 µL pipette uiteinde(Figuur 2).
    3. Veilig planten met bladluizen te bedekken met een cup kooi gemaakt met een plastic beker met de bovenkant afgesneden, bedekt met een fijn gaas en beveiligd met tape (Figuur 2B).
    4. Bladluis-aangetaste planten te plaatsen in een lade en bewaar op een gecontroleerde milieu kamer (16 L: 8D, 22 ° C, luchtvochtigheid van 70%).
  3. Om te behouden de voorraad bevolking, door bladluizen te overbrengen in frisse, nieuwe planten wekelijks (2.2.1–2.2.3).
    1. Veilig overdragen 1 – 3 2nd of 3rd instar nimfen en 1 volwassene leeftijd bladluizen met behulp van een precisiepipet mond (cijfers 2A, 3).
      Opmerking: Voorraden worden beste onderhouden door de overdracht van de ongevleugelde individuen.
    2. Veilig bladluis-aangetaste planten met een cup kooi gemaakt met een plastic beker met de bovenkant afgesneden, bedekken, bedekt met een fijn gaas en beveiligd met tape.
    3. Plaats van planten in een lade en bladluizen droog in een milieu kamer (16 L: 8D, 22 ° C, luchtvochtigheid van 70%).
    4. Als alternatief, als gewenst en als de waardplant van fatsoenlijke kwaliteit is, een ethanol vacuüm kolf gebruikt om de bevolking verlaten reproduceren van slechts één volwassen en twee tot drie 2e of 3e instar nimfen.
  4. Om te maken dezelfde bevolking voor het gebruik in experimenten, plaatst u maximaal 5 volwassenen (bij voorkeur ongevleugelde) uit voorraad populatie op een nieuwe waardplant.
    1. Verwijder de volwassenen 24 h later.
    2. Ongeveer 5-7 dagen later, plaatsen zodra de F1 nakomelingen hebben gerijpt naar volwassenheid, maximaal 5 ongevleugelde F1 volwassenen op een nieuwe waardplant. Verwijder de volwassenen 24 h later.
    3. Zodra de F2 bevolking heeft gerijpt naar volwassenheid, is deze populatie klaar om te worden gebruikt in experimenten.
      Opmerking: Dit proces zorgt ervoor dat de experimentele bevolking ongeveer is dezelfde leeftijd en van ongeveer dezelfde leeftijd moeders zijn geboren.
  5. Bevestig de genotypische verschillen tussen veld-gevangen isoclonal lijnen met behulp van microsatelliet genotypering (hieronder beschreven, afdelingen 3 & 4).

3. DNA-extractie

  1. Voorbereiding
    1. Steriele technieken gebruiken om te bereiden 1 L lysis buffer (0,1 M NaCl, 0,2 M sacharose, 0,1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA 0,05% SDS).
    2. Warm het blok van de verwarming of water bad tot 65 ° C.
  2. Weefsel homogenisering en lysis
    1. Plaats de bladluis in de buurt van de onderkant van een steriele, 1,5 mL microcentrifuge buis.
    2. Plaats de steriele stamper in de buis met de bladluis en de onderkant van de buis in vloeibare stikstof onder te dompelen.
      Opmerking: Optimale weefsel desintegratie wordt bereikt wanneer de bladluis is gepositioneerd tussen de stamper en de kant van de buis.
    3. Het malen van de bladluis met de stamper aanvankelijk lyse cellen.
    4. Gebruik voor een enkele volwassen bladluis, 200 µL (gesplitst in 2 x 100 µL aliquots) van de lysis-buffermengsel. Voeg het eerste monster om te slijpen en resuspendeer de geplette bladluis totdat het monster zichtbaar is uiteengevallen, dan gebruik het tweede monster te spoelen uit de stamper.
    5. Incubeer de geplette bladluizen in lysis-buffermengsel bij 65 ° C in het water bad of warmte blok voor 30 min.
  3. DNA neerslag
    1. Terwijl de buis warm is, voeg 14 µL van 8 M KOAc. Omkeren van de buis te mengen. Bewaar het monster op het ijs gedurende 30 minuten.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot 24 h.
    2. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Het supernatant overbrengen in nieuwe 1,5 mL-buis met een pipet. Wees voorzichtig niet te verwijderen om het even welk van het Ingehuld puin.
    3. Ter verbetering van DNA pellet visualisatie, voegt u 2 µL glycogeen (20 µg/mL) toe aan het supernatant. Als de grootte van de steekproef groot genoeg is, weglaten deze stap.
    4. 200 µL van koude 100% moleculaire-grade ethanol toevoegen aan het supernatant. Omkeren buizen om te mengen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot 24 h.
    5. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen van ethanol door pipetteren.
  4. DNA wassen en elutie
    1. Voeg 200 µL van koude 70% moleculaire-grade ethanol. Vervolgens flick de buis te resuspendeer de pellet te wassen.
    2. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 5 min. Terwijl het visualiseren van de pellet, verwijder voorzichtig de ethanol door pipetteren en het toevoegen van 200 µL van koude 100% moleculaire-grade ethanol.
    3. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 5 min. Tijdens het visualiseren van de pellet, verwijder voorzichtig ethanol door pipetteren.
      Let op: Herhaal de 100-70-100 ethanol wassen indien nodig.
    4. Lucht drogen de pellets voor 5 – 10 min met de aanleg van de buis horizontaal geopend op een papieren zakdoekje.
    5. Resuspendeer de pellet DNA in 80 µL voor lage TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA).
    6. Kwantificeren van de geresuspendeerde DNA met een spectrofotometer.
    7. Bewaren bij 4 ° C.

4. microsatelliet PCR en volgorde van bladluis genotypering

  1. Bestel de juiste F- en R inleidingen voor microsatelliet sequencing (tabel 120).
    Opmerking: Reverse primer sequenties moeten worden gewijzigd met 5'-6-FAM of 5'-5-HEX fluorescerende etiketten te maken voor multiplexed monsters voor microsatelliet sequencing.
  2. PCR met enkele bladluis DNA-monsters (beschreven in sectie 3) en fluorescently geëtiketteerde microsatelliet inleidingen uitvoeren.
    1. Meng PCR reacties volgens protocol van de fabrikant (0,2 µM elke F/R primer, 2.5 mM MgCl2, 50 – 200 ng DNA sjabloon).
    2. Gebruik de volgende instellingen thermocycler: eerste denaturatie bij 94 ° C gedurende 4 min, 35 cycli van 94 ° C voor 30 s, 58 ° C gedurende 35 s, 72 ° C gedurende 45 s, en een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
  3. PCR monsters combineren met verschillende TL tags te verminderen het aantal monsters sequenced en volgorde de microsatelliet monsters op een genotypering faciliteit.
  4. Het analyseren van de .fsa raw voorbeeldbestanden met behulp van de software van de analyse van de microsatelliet.

5. RNA extractie

  1. Verzamelen van de bladluizen monsters voor RNA extractie in 1,5 mL RNase / DNase-vrije buizen en onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof.
    Opmerking: Als de volgende stappen zijn niet onmiddellijk uitgevoerd, kunnen de monsters worden opgeslagen bij-80 ° C.
  2. Weefsel homogenisering
    1. Met de steriele stamper in de buis met bladluis, bevriezen in vloeibare stikstof voor 10-15 seconden tot het monster stop sissende. Plet de bladluis goed met de stamper, zoals beschreven in stap 3.2.
      Opmerking: Optimale weefsel desintegratie wordt bereikt wanneer de bladluis is gepositioneerd tussen de stamper en de kant van de buis.
    2. Voeg in de zuurkast, 800 µL guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie reagens toe aan het monster (1 – 5 volwassen bladluizen). Meng monsters met de stamper en de afzet van de stamper.
  3. Fase-separatie zichtbaar
    Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.
    1. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 160 µL van chloroform aan monster. Schud krachtig met de hand voor 15 s.
    2. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 15 min bij 12.000 x g bij 4 ° C.
      Opmerking: Na centrifugeren, het mengsel worden gescheiden in 3 lagen: een lagere, rode fenol-chloroformfase, een interfase en een kleurloze bovenste waterfase. Het RNA blijft uitsluitend in de waterige fase. Het volume van de waterige zullen ~ 480 µL.
  4. RNA neerslag
    1. In een zuurkast, door de waterfase te overbrengen in een frisse, RNase-gratis buis. De tussenliggende fase niet storen.
    2. Neerslaan van het RNA door toevoeging van 400 µL van isopropanol en Incubeer het monster bij-20 ° C gedurende 10 minuten.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot 24 h.
    3. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C.
  5. RNA wassen en elutie
    1. Verwijder het supernatant; Kijk voor de RNA-pellet.
    2. Wassen van de RNA-pellet met 1 mL van 75% ethanol in DEPC-behandeld water. Meng door langzaam vortexing. Centrifugeer gedurende 5 min bij 7.500 x g bij 4 ° C.
    3. Herhaal de stappen 5.5.1–5.5.2 om te helpen verwijderen van fenol contaminanten.
    4. Verwijder het supernatant en lucht drogen de pellet voor 5-10 min met buis leggen horizontaal open op een steriele bankje. Laat niet de RNA-pellet volledig drogen.
    5. Los van de RNA-pellet in 30 µL van RNase-gratis of DEPC-behandeld water. Pipetteer zachtjes op en neer om te mengen. Incubeer bij 55-60 ° C gedurende 10 à 15 min.

6. RNAseq DOVO Transcriptome vergadering, aantekening en differentiële expressie analyse

  1. RNA monster concentratie en kwaliteit met behulp van een chip gebaseerde capillaire elektroforetische systeem analyseren.
    Opmerking: Een capillaire elektroforese chip gebaseerde systeem is de voorkeur methode van keuze dan analyseren met een spectrofotometer, omdat het een meer nauwkeurige en gevoelige maatregel van RNA concentratie en kwaliteit biedt.
    1. Als voorbeelden zijn van passende kwaliteit (≥ 250 ng totaal, RIN (RNA Integrity nummer) ≥ 5), RNA sequencing uitvoeren
      Opmerking: Belangrijker, omdat deze rangschikken gegevens zal worden gebruikt voor beide expressie profilering en DOVO transcriptome montage, meer lezen diepte zal resulteren in een hogere kwaliteit transcriptome. Voor een redelijk uitgebreide vergadering gebruikend de technologie van de sequencing van Illumina, 100 – 200 miljoen 100 bp, zou de gepaarde einde leest een aanbevolen uitgangspunt. Totale mRNA bibliotheek voorbereiding en RNA sequencing werden uitgevoerd door een sequencing faciliteit.
  2. Controleer de kwaliteit van leest met behulp van snel QC22.
  3. Combineer alle monster leest en monteren van de transcriptome DOVO met behulp Trinity23,24 (Trimmomatic kwaliteit filteren ingeschakeld).
  4. Verfijnen van de vergadering
    1. Gebruik Transdecoder25 te identificeren open lezing frames (ORFs) die een minimum van 100 aminozuren in lengte.
    2. Homologie zoekopdrachten voor de vertaalde ORFs tegen Pfam26 en UniProt27 databases die gebruikmaken van BLASTP28 en HMMER29, respectievelijk.
    3. Verwijderen van bacteriële afschriften (een vertaalde reeks waarvan beste BLAST raken was om een bacteriële gen met een bit-score van meer dan 300 en een minimale aminozuur reeks identiteit van 50%).
    4. Een complete, vertaalde ORFs die ten minste 99% identiek op het niveau van de aminozuur met behulp van CD-HIT30samenvouwen.
    5. De resterende, onvolledige ORFs die ten minste 95% identiek op het niveau van de nucleotide met behulp van CD-HIT30samenvouwen.
    6. Het toewijzen van het resterende nucleotidesequenties met unieke, soortspecifieke-id's (bijvoorbeeld, APHNE 0001).
  5. Beoordelen de volledigheid van de verfijnde vergadering, met behulp van BUSCO (http://busco.ezlab.org/) en de Arthropoda gene dataset31.
  6. Transcriptome aantekening
    1. Eerst, annoteren verfijnde transcriptome met behulp van HMMER tegen de Pfam database26,29.
    2. Ten tweede, annoteren met behulp van de BLASTP tegen de UniProt database27,28transcriptome.
    3. Ten derde, annoteren met behulp van de BLASTP tegen de codering sequenties van geselecteerde insecten met gepubliceerde, geannoteerde genoom transcriptome.
    4. Laatst, annoteren met behulp van de BLASTP tegen de erwt bladluis eiwit database alleen transcriptome.
    5. Gebruik Trinotate voor het genereren van GO aantekeningen uit UniProt toetredingen.
    6. Gebruik Trinotate om te organiseren van alle resultaten van de aantekening in een SQLite database en een aantekening rapport wilt genereren.
  7. Differentiële expressie analyse
    Opmerking: Het gebruik van verfijnde transcriptome als referentie, uitlijnen en kwantificeren van elke bibliotheek afzonderlijk.
    1. Gebruik Trimmomatic aan kwaliteit-filter en trim de oorspronkelijke Lees bestanden32.
      Opmerking: Als u deze stap uitvoert na een vergadering van de drie-eenheid, kan men in plaats daarvan de Trimmomatic output van die stap gebruiken.
    2. Lokale aanpassingen uitvoeren voor elk monster met behulp van Bowtie233.
    3. Pak de Lees graven uit elk afzonderlijk met behulp van SAMtools34monster.
    4. Berekenen van de differentiële expressie tussen de monsters van belang met behulp van DESeq2 met de standaardparameters en een parametrische passen35.

7. qPCR verificatie van Differentially uitgedrukte genen

Opmerking: Als gebruikers zijn geïnteresseerd in differentially uitgedrukte genen uit hun RNAseq-experimenten, het volgende protocol kan worden gebruikt om te controleren of patronen van differentiële expressie.

  1. Het genereren van RNA monsters zoals beschreven hierboven (stap 5).
  2. Kwantificeren van RNA extracties uit te voeren met behulp van een spectrofotometer te controleren op de kwaliteit en de concentratie te krijgen.
  3. Synthetiseren cDNA monsters met behulp van een commercieel beschikbare kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  4. Het bepalen van de efficiency van de primer voor de genen van belang om ervoor te zorgen nauwkeurige twee-voudige PCR versterking.
    1. Op basis van de oorspronkelijke concentraties van RNA, uitvoeren seriële verdunningen (101) te verkrijgen van 3 cDNA concentraties.
    2. Met behulp van een kwantitatieve PCR master mix, meng drievoudige qPCR reacties volgens drie primer concentraties die gebruikmaakt van de fabrikant-protocol (bijvoorbeeld 100 nM, 200 nM, 300 nM) met drie serieel verdunde cDNA concentraties (bijvoorbeeld 0.1 ng/µL, 10 ng/µL, 100 ng/µL).
    3. Voor elk doel-gen, berekenen de helling (m) van de lijn die is gecreëerd met de gemiddelde Ct -waarden voor elk monster als de afhankelijke variabelen en het logboek (cDNA concentratie) als de onafhankelijke variabelen (drie punten totaal).
    4. De volgende vergelijking gebruiken voor het berekenen van de efficiëntie van de primer (E) waar m wordt de helling in 7.4.3 berekend:
      E = 10^(-1/m)
      Opmerking: Primer efficiëntie tussen 90-110% zijn geschikt voor analyses. Dit proces zorgt voor versterking van de gelijke van alle genen in de berekeningen opgenomen.
  5. De ΔΔCt -methode gebruiken met een huishouden gen te kwantificeren van de differentiële expressie van genen van belang36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Planten van culturen: Zaden duurt ongeveer twee tot vier weken, afhankelijk van het seizoen, om te groeien groot genoeg om opnieuw gepot (Figuur 1A). Opnieuw gepot zaailingen duurt nog twee tot vier weken te groeien naar een optimale grootte voor bladluis culturen (Figuur 1B).

Bladluis culturen: Volwass...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het heeft lang erkend dat de aposematic A. Oleanderpijlstaart verwerven in de patronen en mechanismen van resistentie aan de verdediging van de plant en met name chemische sekwester18,37 inzicht kunt. Een aantal van de genomic middelen opgedoken onlangs voor A. Oleanderpijlstaart10, biedt nieuwe mogelijkheden voor ecologische en functionele genomic studies die A. Oleanderpijlstaart als een model gebruiken. We sch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zouden graag bedanken Michelle Moon (Vanderbilt University) voor hulp bij fotografie. Vanderbilt University verstrekt steun aan PA en SSLB wordt ondersteund door DGE-1445197.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sun Gro Fafard Germination MixHummert International10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro MixHummert International10-0951-2
2" x 4" Round Standard PotAnderson Pots1503
DreamTaq DNA PolymeraseThermoFisher ScientificEP0701
TrizolThermoFisher Scientific15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080051
Power SYBR Green PCR Master MixThermoFisher Scientific4367659

Referenties

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313(2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180(2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524(2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31(2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BladluiskweekDNA extractieRNA extractieDe Novo TranscriptoomassemblageTranscriptoom Differentieel ExpressieanalyseqPCR verificatieMicrosatellietanalyseKassteltkweekGecontroleerde Omgevingskamer
Behoud van de biologische culturen en meten van de genexpressie in Aphis Oleanderpijlstaart: een Non-modelsysteem voor Plant-insect interacties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.