Methodenartikel

De identificatie van de Zeeprik feromonen met behulp van de Bioassay-geleide fractionering

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

17 juli 2018

 ,  , 
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te isoleren en karakteriseren van de structuur, olfactorische potentie en gedragsmatige reactie van vermeende feromoon verbindingen van zee prikvissen.

Samenvatting

Bioassay-geleide fractionering is een iteratieve aanpak die gebruikmaakt van de resultaten van fysiologische en gedragsmatige bioassays te begeleiden van de isolatie en identificatie van de verbinding van een actieve feromoon. Deze methode heeft geleid tot de succesvolle karakterisering van de chemische signalen die functie als feromonen in een groot aantal diersoorten. Zee prikvissen vertrouwen op olfaction te detecteren van de feromonen die gedrags- of fysiologische reacties bemiddelen. Wij gebruiken deze kennis van de biologie van de vis te poneren functies van vermeende feromonen en begeleiden van de isolatie en identificatie van actieve feromoon onderdelen. Chromatografie wordt gebruikt om te extraheren, concentreren en scheiden stoffen uit de geconditioneerde water. Electro-olfactogram (EOG) opnames zijn uitgevoerd om te bepalen welke fracties olfactorische reacties uitlokken. Twee-keuze doolhof gedrags testen worden vervolgens gebruikt om te bepalen als een van de geurige breuken ook gedragsgestoorde actief zijn en een voorkeur veroorzaken. Spectrometrische en spectroscopische methoden bieden het moleculaire gewicht en de structurele informatie om te helpen met de opheldering van de structuur. De topicale van de zuivere verbindingen is bevestigd met EOG en gedrags vitrotests. De gedrags reacties waargenomen in de doolhof moeten uiteindelijk worden gevalideerd in een instelling van het veld om te bevestigen hun functie in de instelling van een natuurlijke stream. Deze bioassays spelen een dubbelrol te 1) begeleiden het proces en 2) bevestigen en de topicale van geïsoleerde onderdelen nader te definiëren. Wij rapporteren hier, de representatieve resultaten van een Zeeprik feromoon identificatie die het nut van de bioassay-geleide fractionering aanpak illustreren. De identificatie van de Zeeprik feromonen is vooral belangrijk omdat een modulatie van haar feromoon communicatiesysteem onder de is controle van de invasieve Zeeprik in de Laurentian grote meren overwogen opties. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast om het karakteriseren van de chemische communicatie in een breed scala van taxa en licht werpen op waterbasis chemische ecologie.

Inleiding

Feromonen zijn specifieke chemische signalen vrijgegeven door personen die hen helpen bij het lokaliseren van voedselbronnen, opsporen van roofdieren en bemiddelen van sociale interacties van soortgenoten1. Feromoon communicatie bij insecten geweest goed bestudeerde2; echter, de identificatie van chemische en biologische functie van aquatische gewervelde feromonen zijn niet bestudeerd zo uitgebreid. Kennis van de identiteit en de functie van de feromonen vrijgegeven kunnen worden toegepast om het herstel van bedreigde soorten3,4 of besturingselement pest soorten5,6. De toepassing van deze technieken vereist de isolatie en de karakterisering van de componenten van bioactieve feromoon.

Feromoon identificatie is een tak van de Scheikunde natuurproduct. Vooruitgang in feromoon onderzoek gedeeltelijk beperkt vanwege de aard van de feromoon moleculen zichzelf gebleven. Feromonen zijn vaak instabiel en uitgebracht in kleine hoeveelheden, en slechts een paar bemonsteringstechnieken bestaan om minieme hoeveelheden van vluchtige7,,8 of9van de in water oplosbare verbindingen te detecteren. Benaderingen voor het identificeren van feromonen omvatten 1) een gerichte screening van bekende verbindingen, metabolomica 2) en 3) bioassay-geleide fractionering. Een gerichte screening van bekende stoffen getest verkrijgbare metabole bijproducten van fysiologische processen in hypothetische om te functioneren als feromonen. Deze aanpak beperkt omdat onderzoekers alleen bekende en beschikbare verbindingen kunnen testen. Echter, het heeft geleid tot de succesvolle identificatie van geslachtshormonen in goudvis die functie als feromonen10,11,12. Metabolomica is een tweede feromoon identificatie benadering die potentiële klein molecuul stofwisselingsproducten in een biologisch systeem13onderscheidt. Een vergelijking van de metabolische profielen van twee groepen (dat wil zeggen, een actieve versus een inactieve uittreksel) de identificatie van een potentiële metabole profiel mogelijk maakt van die de metaboliet is gezuiverd is, wat de structuur is opgehelderd, en de topicale is bevestigd14. Additieve of synergetische effecten van complexe formuleringen van bepaalde mengsels zijn meer kans om te worden gedetecteerd met metabolomica omdat metabolieten worden beschouwd samen in plaats van als een reeks van breuken13. Echter de uitvoeringvan metabolomica is afhankelijk van de beschikbaarheid van synthetische verwijzingen omdat de resulterende gegevens doen niet de opheldering van nieuwe structuren vergemakkelijken.

Bioassay-geleide fractionering is een geïntegreerde, iteratieve aanpak dat twee velden omvat: Scheikunde en biologie. Deze aanpak maakt gebruik van de resultaten van fysiologische en gedragsmatige bioassays te begeleiden van de isolatie en identificatie van de verbinding van een actieve feromoon. Een ruwe extract is gefractioneerde door een chemische eigenschap (d.w.z.moleculaire grootte, polariteit, etc.) en getest met electro-olfactogram (EOG) opnames en/of in een bioassay. De bioactieve componenten worden gescreend uit herhaalt u deze stap voor fractionering en EOGs en/of bioassays. De structuren van zuivere actieve verbindingen zijn toegelicht door spectrometrische en spectroscopische methoden, waarmee het moleculaire gewicht en structurele informatie tot een sjabloon van de stof te worden gesynthetiseerd. Bioassay-geleide fractionering kan opleveren divers metabolieten en potentieel nieuwe feromonen met unieke chemische skeletten die zijn waarschijnlijk niet kan worden voorspeld uit de biosynthetic trajecten.

Hier beschrijven we de bioassay-geleide fractionering-protocol dat wordt gebruikt om te isoleren en karakteriseren de topicale van mannelijke Zeeprik seks feromoon verbindingen. De Zeeprik (Petromyzon marinus) is een ideale gewervelde model aan de studie van feromoon communicatie omdat deze vissen sterk afhankelijk zijn van de olfactorische detectie van chemische signalen te bemiddelen hun anadrome levensgeschiedenis bestaat uit drie verschillende fasen: larven, jeugdige en volwassene. Zeeprik larven ingraven in het sediment van zoetwater stromen, een drastische metamorfose ondergaan en transformeren in jonge exemplaren die naar een meer of Oceaan migreren, waar ze talloze vis parasitize. Na het loskoppelen van de host-vis, migreren de volwassenen terug in de paaitijd stromen, geleid door de grote afstanden trekkende feromonen vrijgegeven door stream-ingezeten larven15,16,17,18,19 . Volwassen mannetjes opstijgen naar de paaigronden, release een multi-component seks feromoon voor het aantrekken van stuurlieden, met tussenpozen paaien voor ongeveer een week en dan sterven15,20. De identificatie van de Zeeprik feromonen is belangrijk omdat een modulatie van het feromoon communicatiesysteem onder de is controle van de invasieve zee prikvissen in de Laurentian GREATLAKES21overwogen opties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 en 02/17-031-00).

1. verzameling en extractie van de Zeeprik geconditioneerd Water

  1. Plaats seksueel volwassen mannelijke zee prikvissen (15-30 dieren) in een tank geleverd met 250 L belucht Lake Huron water onderhouden bij 16-18 ° C.
  2. Het verzamelen van de man-geconditioneerd water gedurende elke nacht van juni tot juli.
    Opmerking: zee prikvissen sterven natuurlijk na het kuit schieten. Als een vis dit punt in zijn leven nadert, vervangen door een verse rijpe man.
  3. Pak het geconditioneerde water door vaste fase extractie.
    1. Geniet van de hars in methanol gedurende 4 uur vóór het laden in een kolom. Laden van de hars in de kolom, dan pomp 10 L water door de kolom te elimineren van het organische oplosmiddel.
    2. Passeren de geconditioneerde water uit de tank houden de vis via het pompsysteem naar de top van de kolom. Het water passeert een bed van 2 kg van matig polar polymere ionenwisseling hars (bv., Amberlite XAD-7 HP hars), een reeks van vier 2,5 L capaciteit glas kolommen. Handhaven van belasting snelheden tussen 400 en 600 mL/6 min. elueer de metabolieten met 10 L methanol onmiddellijk gevolgd door 5 L aceton.
      Let op: Deze stap maakt gebruik van methanol en aceton. Beide zijn brandbaar en giftig.
      Opmerking: De gepoolde resterende kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot verder verwerkt.
  4. Het activeren van de kolom na 1 week van verrijking door wassen met water (ongeveer 10 L).
  5. Verwijder het organische oplosmiddel (het mengsel van methanol en water) en de oogst van het extract door hiervoor verdamping voor 5 h onder verlaagde druk (onder 300 mbar) op 40 ° C. Het water residu concentreren door bevriezing droger lyofilisatie gedurende 48 uur bij-20 ° C tot droog.

2. isolatie van breuk zwembaden met chromatografie

  1. Geniet van de silicagel (230-400 mesh) in de beginfase van de mobiele voor 30 min. overdracht de gel met het oplosmiddel (schorsing) aan een kolom van het glas. Open de klep van de kolom om de mobiele fase om door te gaan. De silicagel te precipiteren en vormen een silica gel bed toestaan.
  2. Meng de extracten met silicagel (70-230 mesh) en laadt ze in de kolom vloeistofchromatografie boven het bed silicagel. Elueer hen met een gradiënt van 95% CHCl3 (chloroform) / MeOH (methanol) tot 100% MeOH, 2,5 L in totale volume. Het verzamelen van de elutievloeistof in individuele flesjes (elk 10 ml).
    Let op: De chloroform gebruikt in deze stap is een giftige reagens.
  3. Begeleiden de bundeling van de eluents naar 20 breuken door een dunne laag chromatografie (TLC) analyse.
    1. Uitvoeren van het TLC-experiment op silica gel filter vooraf gecoate platen door het monster toe te passen op de startlijn en onderdompeling van de startlijn van de plaat in de ontwikkelingslanden oplosmiddelen (Kies de polariteit van de verhouding van CHCl3 aan methanol van 100-0%) in een verzegelde glas Tank.
    2. Selecteer de ratio van de ontwikkeling van oplosmiddel te maken van alle de TLC spots met een retentie factor (Rf) variërend van 0.3 - 0.8.
    3. Nadat het ontwikkelende oplosmiddel het einde-regel bereikt, de plaat uit de tank halen en wacht 10 min. voor het oplosmiddel te verdampen.
    4. Visualiseren van de vlekken eerst onder UV-licht op 254 nm en vervolgens vlek hen door spuiten ze met een zure methanolische oplossing van 5% m (20 μL) door een chromatografie sproeier en verwarming ze bij 85 ° C gedurende 3 minuten.
      Opmerking: De kleurrijke vlekken op de TLC-plaat geven de belangrijkste component in de Fractie.
    5. Combineer het eluent naar 20 breuken op basis van de CMYK-kleur en de gelijkenis van def R van het belangrijkste onderdeel.
  4. Concentreren de breuk aan een residu door verdamping van de hiervoor onder verlaagde druk (300 mbar volgens de eigenschap van oplosmiddelen) bij 40 ° C gedurende ongeveer 30 minuten.

3. Electro-olfactogram (EOG) opnamen te identificeren van geurige breuken/verbindingen

  1. Trekken van borosilicaatglas haarvaten (buitendiameter: 1,5 mm, binnendiameter: 0.86 mm, lengte: 100 mm) met een micropipet trekker met het niveau van de kachel ingesteld op 65.
  2. Score en knippen van de opening aan het uiteinde van het capillair met een diamant-tipped glassnijder en vul deze met gesmolten 0,4% agar in een zoutoplossing 0,9%. De opening aan het uiteinde van het capillair moet ongeveer 10 µm in diameter.
  3. Vul de getrokken capillaire elektroden van trappen 3.1-3.2 en solid-state elektroden houders prefab met Ag/AgCl pellets (Zie Tabel van materialen) met 3 M KCl met behulp van een micropipet.
    Opmerking: Verjagen alle luchtbellen in het capillair of de elektrode-houder.
  4. Plaats de elektroden van de getrokken in de elektrode-houders.
  5. Bereiden van 100 mL 10-5 M L-arginine in houtskool-gefilterd water uit een 10-2 M L-arginine-stockoplossing in gedeïoniseerd water (opgeslagen bij 4 ° C) in een maatkolf. Breng 20 mL van de 10-5 M L-arginine naar een glazen ampul.
  6. Voorbereiden voor de concentratie-responscurve, 10 mL 10-fold verdunningen van de breuk zwembaden uit stap 2.3 in glazen flesjes. Maak frisse verdunningen dagelijks voorafgaand aan de experimenten en ze binnen een dag te gebruiken. Zet de glazen flesjes voor de werkoplossingen van L-arginine en de breuk zwembad verdunningen in een recirculatie waterbad om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur aan equilibreer tot 8 ° C.
  7. Anesthetize van de lamprei met 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222; 100 mg/L) en het immobiliseren met een intramusculaire injectie van gallamine triethiodide (3 mg/kg lichaamsgewicht, in een zoutoplossing 0,9%) met een steriele injectiespuit.
    Opmerking: Een voldoende diepte van de verdoving wordt bepaald door het observeren van geen gill-beweging, een onvermogen te handhaven een rechtop houding, en geen zuig aan de zijkanten van de tank met behulp van haar mondelinge schijf. Om te minimaliseren van eventuele bacteriële besmetting vóór en tijdens de operatie, steriele handschoenen dragen en geniet van de hulpmiddelen van de dissectie in 70% ethanol (v: v) in gedeïoniseerd water gedurende ten minste 10 minuten vóór gebruik.
  8. De narcose lamprei in een V-vormige stand oriënteren en wikkel het met een natte papieren handdoek ter voorkoming van uitdroging.
    Opmerking: Geen belemmering voor de gill-openingen.
  9. Plaats een buis van het opnieuw circuleren waaraan koolzuurgas is toegevoegd water met 50 mg/L van de MS222 in de buccale Holte, aanpassen van het debiet en zorgen ervoor dat water is verlaten via de openingen van de gill om voortdurend de bevloeiing van de kieuwen.
  10. Gebruik een steriel scalpel en pincet [onder de stereoscopische Microscoop bij een 1.25 X vergroting (Zie Tabel van materialen)] om een 5 mm2 deel van de huid op het oppervlak van de olfactorische capsule de olfactorische epitheel bloot te stellen.
  11. Spoel de odorant levering buis met gefilterde water en sluit hem aan op het ventiel gemonteerd op een micromanipulator. Plaats het capillair van odorant levering in de holte van de olfactorische epitheel met behulp van de micromanipulator voor gefilterde water naar de olfactorische epitheel ter voorkoming van uitdroging, wanneer niet beheert odorant.
  12. Monteer de opname- en referentie-elektroden op de micromanipulators. Het verlagen van de referentie-elektrode op de externe huid in de buurt van de naris. Met behulp van de stereoscopische loep (1.25 X), lager de opname elektrode nauwelijks raken het oppervlak van de olfactorische epitheel.
  13. De opname van de gasinleidbuis odorant van de achtergrond gefilterd water overbrengen aan de oplossing van de L-arginine 10-5 M.
  14. Inschakelen van de computer, versterker (ingesteld op DC-werking), filter en digitizer. De procedure voor het beheer van een 4 s één puls van odorant door het controleren van het vak van T1, instellen van T tot en met 4 met behulp van de klep driver software, program s en controleren van het vak van T2.
  15. In de data-acquisitie software (Zie Tabel of Materials), de overname modus instelt op een hoge snelheid oscilloscoop, klik op het spelpictogram en klikt u vervolgens op starten in het stuurprogramma van de klep om de pols odorant trigger.
    Opmerking: De data acquisitie software registreert automatisch de differentiële EOG reactie amplitude voor 20 s (3 s vóór, 4 s tijdens de odorant pols en 13 s daarna). Gebruik de micromanipulator om te manoeuvreren van de standpunten van de opname elektrode, referentie-elektrode of odorant afloopbuis te verhogen van de signal-to-noise verhouding met een maximale respons op de L-arginine-norm en een minimale reactie op de blanco-controle ( gefilterd water). De versterker van de grond door over te schakelen van de schakelaar van de AC / DC-versterker met GND terwijl het bewegen van de elektroden.
  16. Start de opname van de blanco-controle, L-arginine, waarna de odorant bereid in stap 3.6 van lage naar hoge concentraties met een flush 2 min van gefilterde water tussen toepassingen.
  17. Na het opnemen van reacties op alle odorant te beproeven, de versterker op de grond en zorgvuldig het intrekken van de elektroden en odorant levering capillaire buis. Na de goedgekeurde institutionele Animal Care gebruik Comité (IACUC) methoden en, aan het einde van het experiment EOG euthanaseren de narcose lamprei met een overdosis van MS222 (1 g/L).
    Opmerking: Controleer of succesvolle euthanasie door op te merken van een gebrek aan beweging gill en hartslag voor minstens 5 min, gevolgd door pithing van de hersenen.
  18. Analyseren en de gegevens met behulp van analysesoftware uitzetten. Het bepalen van de drempel van de opsporing van de reukstoffen22 te identificeren van geurige breuken die groter zijn dan de lege watercontrole reacties uitlokken. De Fractie Zwembaden die concentratie-afhankelijke olfactorische reacties die anders zijn dan de lege watercontrole worden dan getest in een gedrags test (stap 4).

4. twee-keuze doolhof gedrags Bioassay te identificeren gedragsgestoorde actieve breuken/verbindingen

  1. Acclimatiseren van de seksueel volwassen vrouwelijke Zeeprik in de kooi van de release in de doolhof (Zie aanvullende figuur 1) voor 5 min. handhaven de stroomsnelheid van het rivierwater in de doolhof
    Opmerking: De doolhof is opgebouwd uit gelakte marine grade hout en maatregelen 6.5 m lang en 1,2 meter in breedte met een divider 2.7 m in lengte kan worden gescheiden van de doolhof in twee kanalen eind stroomopwaarts te meten. Water wordt tijdelijk omgeleid naar de doolhof. De waterdiepte op 0,19 m gehandhaafd moet worden en de snelheid moet worden gehandhaafd op 0,07 m/s ± 0,01.
  2. Laat de Zeeprik en opnemen van het gecumuleerde bedrag van de tijd die de lamprei in de experimentele doorbrengt en besturingskanaal elke met rivier water gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Als de Zeeprik mislukt de experimentele invoeren en controleren van kanaal voor ten minste 10 s tijdens deze periode van 10 min, beëindig het proces, zoals dit is een indicatie van inactiviteit of sterke kant bias.
  3. Toepassen van de test prikkel (dat wil zeggen, een vermeende feromoon op 10-12 M in 50% methanol/gedeïoniseerd water opgeloste) aan het willekeurig toegewezen experimentele kanaal en het voertuig (50% methanol/gedeïoniseerd water) voor het gebruik van het control kanaal peristaltische pompen tegen constante prijzen van 200 mL/min gedurende 5 minuten.
    Opmerking: De detectie drempel concentratie van de stimulus test zoals bepaald met de opnames van electro-olfactogram moet worden gebruikt als de beginconcentratie voor de gedrags test.
  4. De test stimulus en het voertuig voor een extra 10 min toepassen en opnemen van de cumulatieve hoeveelheid tijd de lamprei doorbrengt in de experimentele en besturingskanaal.
  5. Spoel het labyrint met water gedurende 10 minuten vóór het begin van de volgende proef. Herhaal stap 4.1-4.4 met ten minste 7 prikvissen als voldoende stimulans van de test beschikbaar is.
  6. Berekenen van een index van voorkeur22 voor elk afzonderlijk experiment en evalueren de betekenis met behulp van een Wilcoxon ondertekend-rank test.
    Opmerking: De index resulteert in een enkel getal dat kan positief of negatief. Een positieve waarde van de index van voorkeur geeft attractie, overwegende dat een negatieve waarde van de index van voorkeur indicaties afkeer. Als de index van voorkeur beduidend verschillend van nul is, wordt de breuk geacht actief.
    figure-protocol-1
    Hier,
    Bc = de tijd door de lamprei test in het besturingskanaal voorafgaand aan het verzoek van odorant,
    Be = de tijd doorgebracht in het experimenteel kanaal voorafgaand aan het verzoek van odorant,
    Eenc = de tijd doorgebracht in het besturingskanaal na de toepassing van odorant, en
    L a ge = de tijd doorgebracht in het experimenteel kanaal na de odorant toepassing.

5. de chromatografische isolatie van zuivere verbindingen van actieve breuken

  1. Herhaal stap 2.1-2.4 met de breuk zwembaden die olfactorische Reacties (stap 3 induceren) en uitlokken van gedrags Reacties (stap 4).
  2. Verder zuiveren de actieve breuken in verbindingen met grootte-uitsluiting chromatografie met behulp van een Sephadex LH-20-kolom.
    1. Voorbereiding van het monster in 0,5 mL in de beginfase van de mobiele [CHCl3- MeOH (1:1) of MeOH 100%], laden in de overeenkomstige kolom een kolom met CHCl3- MeOH (1:1) en vervolgens een MeOH (100%) en elueer hen om de opbrengst van de verbindingen.

6. structuur opheldering van een zuivere stof met massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR)

  1. Los en de gezuiverde compound in de eerste mobiele fase (meestal methanol water, 1:1, v: v) van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) vormen een 10 μL oplossing voor ongeveer 1 μg/mL verdund.
    1. De monsteroplossing overbrengen HPLC flesjes en zet ze in de autosampler van HPLC. Het monster (10 μL) injecteren de electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESIMS) en de hoge resolutie electrospray ionisatie massaspectrometrie (HRESIMS) spectra met behulp van een chromatografie massaspectrometer23opnemen.
  2. De molecuulformule volgens de database in de software massaspectrometer voorspellen (Zie Tabel van materialen)24.
    1. Open het chromatogram van het geïnjecteerde monster en haar massaspectrum verkrijgen door het selecteren van de chromatografische piek.
    2. Ingang van de gemeten massa ion (m/z) waarde (4 decimalen) in elementaire samenstelling onder de Tool -module. Stel de parameter tolerantie op PPM < 5.
    3. Pas de symbool-parameters aanpassen aan de samenstelling van het element van de gemeten molecule. De software produceert een voorspelling van moleculaire formule gebaseerd op het één massa analyse.
  3. Selecteer de Halfzwaar oplosmiddelen (600 μL, CH3OH -d4 of DMSO -d6) volgens het protocol25 te ontbinden van de monsters.
    1. Volledig los van het monster in de geselecteerde Halfzwaar oplosmiddelen te vormen van een oplossing met een concentratie variërend ongeveer van 0.1 tot 10 mg/mL. Breng de oplossing van het monster in de buis van een NMR om vast te leggen van de 1D (1H, 13C) en 2D NMR [1H -1H correlatie spectroscopie (GEZELLIGE), heteronucleaire single quantum samenhang (HSQC), heteronucleaire correlatie van meerdere bond (HMBC)] spectra op een 900 MHz NMR spectrometer26.
  4. Plaats de NMR-buis met het monster binnen de spinner turbine. Gebruik de dieptemeter om dat de hoogte van de steekproef is in het midden van het meetinstrument venster. De NMR-software niet openen (Zie Tabel van materialen) en klik op de knop opheffen als u wilt wijzigen van het monster in de magneet.
    Opmerking: Houd een hand over de bovenkant van de magneet te voelen van het gas uit de bovenkant van de magneet. Op hetzelfde moment moet een fluitend geluid hoorbaar.
  5. Zachtjes leg het monster op het kussen van de lucht op de top van de magneet en druk op de knop Lift weer te dalen van het monster in de NMR-magneet.
    Opmerking: Luisteren naar het geluid van een "Klik" om aan te geven het monster in de juiste positie.
  6. Een nieuwe gegevensset maken en laden de standaardparameters aanbevolen door de NMR-instrument (Zie Tabel van materialen).
    1. Typ "lock" te beroepen op de automatische vergrendeling procedure en het oplosmiddel op de prompt pagina te selecteren.
    2. Voor "fine-tuning"-, in het deelvenster bewerken, stel de toets in de Unlock -model, de cursor in het deelvenster bewerken aanpassen en de magneet opnieuw te vergrendelen.
    3. Op de prompt Atma pagina aanpassen de parameter in het deelvenster bewerken de tuning procedure, die kan een paar minuten duren. Wacht totdat de tuning is voltooid om verder te gaan.
    4. Start de automatische shimming routine door te typen "topshim" ter naar de prompt. Wacht totdat de shimming voltooid is om verder te gaan.
    5. Type "rga" instellen automatische ontvangst van winst aanpassingen, dan type "d1" de vertraging tussen pulsen, dan type "zg" om te beginnen de verwerving, en wacht totdat de overname is voltooid instellen.
    6. Typ "ef" of "efp" te verwerken van de gegevens en typ vervolgens "apk" voor automatische afbouwen. Het verwerken van de gegevens op de NMR processing software.
  7. Het verhelderen van de chemische structuur door een interpretatie van de NMR data-analyse.
  8. Tellen de signalen van de koolstof in het 13C-NMR spectrum. Selecteer de overeenkomende molecuulformule van de voorspelde resultaat in hoge-resolutie massa spectrometrie (HR-MS).
  9. Integreren van de proton-signalen in het spectrum van 1H NMR en toewijzen van de connectiviteit van de koolstof - en proton-op basis van de signalen in het HSQC spectrum.
  10. Toewijzen van de connectiviteit van het skelet van de koolstof gebaseerd op de correlaties in 1H -1H COSY en HMBC spectrum.
  11. Voorlopig toewijzen de chemische structuur op basis van de structuur grondgedachte27. Zoek de voorlopige structuur in de databases van de chemische structuur. Vergelijk de voorlopige structuur met de analogen in verwijzingen.
  12. De relatieve configuratie met het nucleair Overhauser Effect spectroscopie (NOESY)-spectrum toewijzen.
    Opmerking: Aangezien de identiteitseigenschappen van enantiomeren weergegeven op spectrometrie en spectroscopische methoden identiek zijn, de absolute configuratie van sommige samenstellingen, vooral die met 2'-alcohol en 2'-NH2, dient te worden bepaald met een reactie van de bewerking. Na de reactie van de bewerking vergemakkelijken de verschillen aangegeven op de spectra de duidelijke toewijzing van de absolute configuraties van de meeste verbindingen28.

7. EOG en Bioassay te bevestigen van zuivere verbindingen zijn geurige en gedragsgestoorde actieve

  1. Herhaal stap 3.1-3.5.
  2. Voor de concentratie-responscurve, bereiden 10 mL 10-fold verdunningen van de zuivere verbindingen van 10-6 M - 10-13 M van een 10-3 M feromoon stamoplossing in 50% methanol/water opgeslagen bij-20 ° C op basis van het molecuulgewicht bepaald in stap 6.2. Zet de glazen flesjes met de werkoplossing van L-arginine en de zuivere verbindingen in een recirculatie waterbad om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur aan equilibreer tot 8 ° C.
  3. Herhaal stap 3.7-3.18.
  4. Herhaal stap 4.1-4.2.
  5. De zuivere verbinding op de EOG detectie drempel concentratie toepassen door het willekeurig toegewezen experimentele kanaal en het voertuig (50% methanol/gedeïoniseerd water) naar het besturingskanaal gebruik een peristaltische pomp tegen constante prijzen van 200 mL/min gedurende 5 minuten.
  6. Herhaal stap 4.4-4.6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een samenvatting van de stappen die worden beschreven in het protocol van de bioassay-geleide fractionering diagram is afgebeeld in Figuur 1. Het protocol bestaat uit stappen om te isoleren en karakteriseren van de structuur, de olfactorische potentie en de gedragsmatige activiteit van 5 putatief Zeeprik feromonen (Figuur 2). Met behulp van de massa-spectrometrische en NMR-gegevens (Figuur 3 en

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vissen leven in een chemische wereld vol van verbindingen nog worden geïdentificeerd. Bioassay-geleide fractionering heeft bewezen essentieel te identificeren en te karakteriseren van biologische actieve moleculen die vele chemische interacties, zoals waargenomen in masu zalm31, Aziatische olifanten32en zee prikvissen33, bemiddelen 34,35. Bioassay-geleide fractionering is een effe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de Amerikaanse Geological Survey Hammond Bay biologische Station voor het gebruik van de onderzoeksfaciliteiten van hun en het personeel van Wildlife Service, US Fish en visserij en oceanen Canada voor het verstrekken van zee prikvissen. Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van de Visserijcommissie van de grote meren aan Weiming Li en Ke Li.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament Warner InstrumentsG150F-4opname- en referentie-elektrode (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm)
Pipette puller instrumentNarishigePC-10trekt elektroden voor EOG's
Diamant-geslepen glazen snijderGenericsnijdt punt van elektroden voor EOG
Borosiliekaatglazen capillaire buisjesWorld Precision Instruments1B150-4reukstofafgiftebuis voor EOG
Opname-elektrodehouder E-serie rechte lichaam met Ag/AgCl pellet voor glazen capillair OD 1,5 mmWarner InstrumentsESP-M15Nopname-elektrodehouder
Referentie-elektrodehouder E-serie met handvat met  Ag/AgCl pellet  voor glazen capillair OD 1,5 mmWarner InstrumentsE45P-F15NHreferentie-elektrodehouder
1 mm pinWarner InstrumentsWC1-10om referentie- en opname-elektrodehouders te verbinden
2 mm pinWarner InstrumentsWC2-5om referentie- en opname-elektrodehouders te verbinden
AgarSigmaA1296gesmolten agar om elektroden te vullen
Kaliumchloride (KCl)SigmaP93333M KCl om elektroden en elektrodehouders te vullen
Micropipet microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5om elektroden en elektrodehouders te vullen
L-ArginineSigmaA5006positieve controlereukstof voor EOG
MethanolSigma34860
WaterbadOp maat gemaaktN/Ahoudt reukstoffen voor EOG
3-aminobenzoëzuur ethylester (MS222)Syndel USATricaine1GEOG anestheticum
Gallamine triethiodideSigmaG8134-5GEOG paralytisch middel
1 mL spuitBD Biosciences301025om paralytisch middel toe te dienen
Subcutane naald 26G 5/8BD Biosciences305115om paralytisch middel toe te dienen
RollerklemWorld Precision Instruments14043-20stelt stroomsnelheid van verdovingsmiddel in lamprey's mond in
Natriumchloride (NaCl)J.T. Baker3624-05voor bereiding van 0,9% zoutoplossing
V-vormige plastic standaard als specimen-platformOp maat gemaaktN/Ahoudt lamprey vast tijdens EOG
Kunststof gootOp maat gemaaktN/Ahoudt V-vormige plastic standaard vast tijdens EOG
Scalpelmesjes - #11Fine Science Tools10011-00voor EOG dissectie
Scalpel handvat - #3Fine Science Tools10003-12voor EOG dissectie
Rechte ultrafijne pincetFine Science Tools11252-00voor EOG dissectie, Dumont #5SF Forceps
Gebogen ultrafijne pincetFine Science Tools11370-42voor EOG dissectie, Moria MC40B
Rechte scharende schaarFine Science Tools15003-08voor EOG dissectie
StereomicroscoopZeissDiscovery V8voor EOG dissectie
VerlichtingslampZeissCL 1500 ECOvoor EOG dissectie
Kunststof buisGenericom re-circulerende EOG-opstelling en waterbaden te verbinden
ReukstofafgiftebuisOp maat gemaaktN/A
In-line filter en pakkingsetLee CompanyTCFA1201035A
MicromanipulatorsNarishigeMM-3om elektroden en reukstofafgifte capillaire buis te positioneren
Magnetische houdersKanetecMB-K
VentilaandrijvingArduinoop maat gemaaktom het openen van de klep voor reukstimulatie te regelen
Elektromagnetische klepLee CompanyLFAA1201618Hklep voor reukstimulatie
NeuroLog AC/DC versterkerDigitimer Ltd.NL106om de amplitude van het elektrische signaal te verhogen
NeuroLog DC voorversterker met headstageDigitimer Ltd.NL102Gom de amplitude van het elektrische signaal te verhogen
Laagdoorlaat 60 Hz filterDigitimer Ltd.NL125
DigitizerMolecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) met Axoscope data acquisitie softwareMolecular Devices LLCAxoScope versie 10.4
Faraday kooiOp maat gemaaktN/AElectromagnetische ruisbescherming
Tweekeuze labyrintOp maat gemaaktN/Awaterdicht marine kwaliteit multiplex bedekt met plastic voering
AfvalpompHondaWT30XK4Avult labyrint met water uit nabijgelegen rivier
Peristaltiekpomp met buisCole ParmerMasterflex 07557-00om reukstoffen in labyrint toe te dienen
Inverter generatorHondaEU1000ivoedt peristaltische pomp
UitlaatkooiOp maat gemaaktN/Agebruikt om lamprey aan labyrint te laten wennen
GaasGenericgebruikt om de afmetingen van het labyrint te beperken en waterturbulentie te minimaliseren met gaasrollen
Emmer (5 gallon)Genericom reukstoffen te mengen
DebijhouderMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000om afvoer te meten
XAD 7 HP harsDow chemical37380-43-1voor extractie van geconditioneerd water 
MethanolSigma34860voor extractie van geconditioneerd water 
WaterbadYamatoBM 200voor extractie van geconditioneerd water 
VriesdrogerLabconcoCentriVap Concentratorvoor extractie van geconditioneerd water
Chloroform

Referenties

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
  4. Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
  5. Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
  6. Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
  7. Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
  8. Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
  9. Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
  10. Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
  11. Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
  12. Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
  13. Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
  14. Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
  15. Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
  16. Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
  17. Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
  18. Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
  19. Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
  20. Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
  21. Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
  22. Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
  23. Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
  24. Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
  25. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692(2007).
  26. Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
  27. Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
  28. Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
  29. Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
  30. Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
  31. Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
  32. Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
  33. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  34. Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
  35. Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
  36. De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
  37. De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
  38. Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
  39. Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vastestofextractievloeistofchromatografieregistratie van elektro olfactogrammentwee keuze doolhofproefgrootte uitsluitingschromatografiemassaspectrometrieNMR spectroscopiechemische ecologie

Gerelateerde artikelen