Methodenartikel

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

DOI:

10.3791/58110

⸱

17 oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Medical Virology and Viral Diseases, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 4Research Network of Immunity and Health (RNIH), Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, 5Laboratory Animal Center, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 6CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Zika-virus (ZIKV) kan leiden tot ontsteking in immunoprivileged organen (bijvoorbeeldde hersenen en de testis), leidt tot het syndroom van Guillain-Barré en beschadiging van de teelballen. Tijdens een infectie met het ZIKV, immune cellen gebleken om te infiltreren in de weefsels. De cellulaire mechanismen waarmee de bescherming en/of immunopathogenese van deze immuuncellen worden gedefinieerd tijdens een ZIKV infectie zijn echter nog steeds grotendeels onbekend. Hierin beschrijven we methoden voor het evalueren van de virus-specifieke T-cel-functionaliteit in deze organen van de immunoprivileged van ZIKV-geïnfecteerde muizen. Deze methoden omvatten een) een ZIKV infectie en vaccin inoculatie in Ifnar1- / - muizen; b) histopathologie en immunofluorescentie immunohistochemistry testen om te ontdekken van het virusinfectie en ontsteking in de hersenen, de testes, en de milt; c) de voorbereiding van een tetrameer van ZIKV afkomstige T-cel epitopen; d) het opsporen van ZIKV-specifieke T-cellen in de monocyten geïsoleerd van de hersenen, de testes, en de milt. Met behulp van deze benaderingen, het is mogelijk te detecteren de antigeen-specifieke T-cellen die hebben geïnfiltreerd in de organen van de immunoprivileged en te evalueren van de functies van deze T-cellen tijdens de infectie: potentiële immuun bescherming via virus goedkeuring en / of immunopathogenese verergert de ontsteking. Deze bevindingen kunnen ook bijdragen tot het verduidelijken van de bijdrage van T-cellen ten gevolge van de immunisatie tegen ZIKV.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ZIKV is een door muggen overgebrachte flavivirus die werd voor het eerst geïsoleerd in 1947 in Oeganda van een koorts resusaap. Onlangs, is de ZIKV geworden een noodsituatie voor de volksgezondheid, als gevolg van de snelle verspreiding ervan in Amerika en haar onverwachte link naar microcefalie en Guillain-Barré syndroom,1,,2,3. Van epidemiologische gegevens, wordt de ZIKV verdacht als de oorzaak van het syndroom van Guillain-Barré in ongeveer 1 per 4.000 geïnfecteerde volwassenen4. Bovendien, een correlatie tussen de ZIKV en teelballen infectie of materiële schade in de muismodel is aangetoond, wat suggereert dat de ZIKV-infectie, onder bepaalde omstandigheden kan het omzeilen van de barrière van de bloed-testis en uiteindelijk tot mannelijke onvruchtbaarheid5 leiden . Deze bevindingen benadrukken het belang van het volledig begrijpen van de inductie van beschermende of pathologische immuunresponsen tijdens een ZIKV infectie.

Moet nog veel worden geleerd over de cellulaire immuunresponsen aan de ZIKV. CD4+ en CD8+ T-cel reacties op de Eiwitmantel, envelop en nonstructural eiwit 1 (NS1) zijn waargenomen in ZIKV-besmette apen en mensen6,7,8. Bij muizen, verschillende studies hebben aangegeven dat CD8+ T cellen een beschermende rol bij het beheersen van de ZIKV replicatie9,10,11. Bovenal Jurado et al. aangetoond dat een ZIKV infectie in de verdeling van de bloed - hersenbarrière en gerelateerde infiltratie van CD8 resulteert+ effector T cellen in de testes van Ifnar1- / - muizen. Bovendien, ze bleek dat CD8+ T cellen aanzetten tot ZIKV-geassocieerde verlamming en lijken een rol te spelen in de neonatale hersenen Immunopathologie. In een eerdere studie, wij bereid de ZIKV-E294-302 tetrameer en toonde dat ZIKV-specifieke CD8+ T cellen bestaan in de hersenen en ruggemerg koorden van ZIKV-besmet Ifnar1- / - muizen, die kunnen belangrijke gevolgen voor het ontwerp hebben en ontwikkeling van ZIKV vaccins10.

In reactie op de dringende noodzaak van vaccinatie om ZIKV infecties te voorkomen, zijn verschillende vaccins in de preklinische fase van ontwikkeling, met inbegrip van RNA vaccins recombinante vector-gebaseerde vaccins en gezuiverde eiwit subunit vaccins. Het plasmide-DNA-vaccin is in fase 1 klinische proeven12. De beoordeling van de veiligheid en werkzaamheid van vaccins ZIKV is daarom belangrijk. Een voordeel van de vaccins is hun vermogen om te ontlokken specifieke T-cel-reacties, die van belang voor de bescherming tegen de ZIKV zijn kunnen. Met behulp van T-cel ZIKV afkomstige epitoop-gerelateerde tetramers, de T-cel-immunoreactivity geïnduceerd door een adenovirus vector-gebaseerde ZIKV vaccin kon worden opgespoord in de geïmmuniseerde muizen, en zowel M en E glycoproteïnen werden getoond voor het opwekken van robuuste antigeen-specifieke CD8+ T-cel immunoreactivity13.

Tijdens een virusinfectie is de erkenning van peptide antigenen gepresenteerd door grote histocompatibility complex (MHC) moleculen aan de T-cel receptor (TCR) een belangrijk T-cel-gemedieerde mechanisme voor de bescherming van de host-14. Op basis van deze theorie, is tetrameer technologie een uniek instrument voor het ophelderen van de rollen die antigeen-specifieke T-cellen spelen bij het reguleren van de immuunrespons op15. Dit protocol beschrijft de oprichting van het model van de Ifnar1- / - de muis voor ZIKV infecties en de opsporing van reactieve T-cellen in de milt, hersenen en testes van de muizen met behulp van tetrameer technologie. Bovendien, we gewend de ZIKV-E294-302 tetrameer opsporen en evalueren van T-cel immunoreactivity opgewekt door een vaccin (AdC7-M/E) van de ZIKV in de geïmmuniseerde muizen. Deze studie biedt een leidraad voor het onderzoeken van T-cel reacties in immunoprivileged organen en ziet u een overzicht van de mogelijke toepassingen in de placenta of de foetale hersenen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierproeven ten behoeve van gasten werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van het nationale Instituut voor virale Disease Control and Prevention, China CDC. Alle experimenten werden uitgevoerd na de institutionele Animal Care en de dierlijke protocollen gebruik Comité is goedgekeurd.

1. de virusinfectie

  1. Houd volwassene (6 tot 8 weken oude) Ifnar1- / - (50% mannen en 50% vrouwelijke) muizen in speciale pathogenen vrije (SPF) standaardvoorwaarden, en hen in staat stellen regelmatig toegang tot voedsel en water.
  2. De Ifnar1- / - muizen met de ZIKV via een retro-orbitaal inoculatie van 100 µL ZIKV in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer met 1 x 104 focus-vormende eenheden (FFUs) van het virus te infecteren. Ook voorzien van controle muizen een gelijk volume van PBS.
    Let op: De muizen onder ABSL2 omstandigheden infecteren en uitvoeren van deze procedures met virus-geïnfecteerde muizen in de bioveiligheid kabinet.
  3. Controleer het gewicht en de klinische symptomen (tremoren, gespreide maart, bilaterale slappe hind-limb) van de muizen dagelijks gedurende 15 dagen.

2. immunisatie met het ZIKV-vaccin

  1. Gebruik Ifnar1- / - (50% mannen en 50% vrouwelijke) muizen tussen 6 en 8 weken leeftijd. Houd de muizen in standaardomstandigheden SPF van 18 – 29 ° C en een 12 h licht/donker cyclus met toegang tot voedsel en water.
  2. De Ifnar1- / - muizen met het ZIKV-vaccin immuniseren: injecteren 100 µL van AdC7-M/E [4 x 1010 (virusdeeltjes)] in PBS buffer via een intramusculaire injectie (het i.m. route) met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 23-G naald.
  3. Ook injecteren controle muizen met een gelijk volume van PBS.

3. isolatie van de monocyten van de milt

Opmerking: De isolatie van de monocyten van de milt is zoals eerder vermeld16beschreven.

  1. Anesthetize de geïmmuniseerde en ZIKV-geïnfecteerde muizen 7 d na inoculatie, met behulp van een 5% Isofluraan concentrationin 100% zuurstof (met een debiet van 1 L/min). De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren. Dan, dompel onmiddellijk de hele muis in 75% ethanol.
    Let op: vanaf deze stap verder, moeten alle experimentele procedures aseptisch worden uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid.
  2. Gebruik van naalden, fix de ledematen van de muizen (euthanized, eerder besmet/geïmmuniseerd) op de plaat schuim met de buik naar boven.
  3. Snijden de huid langs de buik middellijn aan de thorax met een steriel scalpel, snijd de buikspieren aan te spannen met een schaar, bloot de buikholte en voorzichtig het verwijderen van de lever.
    Opmerking: De lange, donker-rode orgel aan de linkerkant van de maag is de milt.
  4. Verwijderen van de milt, spoel het 3 x in PBS verwijderen van alle bloed en plaatst u deze in 1,5 mL ijskoud Roswell Park Memorial Instituut voedingsbodem (RPMI). Houd de milt op ijs.
  5. Voor het genereren van een eencellige opschorting van de milt, de organ(s) plaats op een steriele 40 µm-mesh cel zeef bovenop een tube van 50 mL en voeg toe 2 mL ijskoud RPMI gemiddeld met 10% foetale runderserum (FBS). Met behulp van de zuiger van een injectiespuit 5 mL, mechanisch Prak de organ(s) en medium toe te voegen totdat het orgel volledig grond door middel van de Maas is.
  6. De celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL en Centrifugeer het bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  7. Resuspendeer de cellen met 5 mL van een rode bloedcellen (RBC) lysis buffer (NH4Cl nb2EDTA en KHCO3; Zie de Tabel van materialen) en de reactie van de lysis bij kamertemperatuur gedurende 5-6 minuten uit te broeden.
  8. Stop de lysis van de RBC met 10 mL van ijskoude RPMI/FBS medium samen en centrifugeer de buis bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  9. Resuspendeer de cellen met 10 mL van volledige RPMI medium (RPMI met 10% vol/vol FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine). 10 µL van de celsuspensie overbrengen naar een klein buisje, meng het met 10 µL van 0,4% wt/vol trypan blauw, en tellen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.

4. isolatie van monocyten uit de hersenen en de teelballen

  1. Anesthetize de ZIKV-besmette mannelijke muizen 7 d na inoculatie, met behulp van 100% zuurstof van de isofluranein van de 5% (met een debiet van 1 L/min). De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren. Dan, dompel onmiddellijk de hele muis in 75% ethanol.
    Let op: Vanaf deze stap, alle experimentele procedures moeten worden uitgevoerd aseptisch in een kabinet bioveiligheid. Het isolement van monocyten uit de hersenen en de teelballen wordt beschreven, zoals eerder vermeld17.
  2. Immobiliseren een (euthanized, eerder geïnfecteerd) mannelijke muis in de vatbaar positie op een snijplank.
  3. Beveiligen van de hoofdhuid met een rechte 1 x 2 tanden pincet en Iris schaar gebruik te maken van een incisie middellijn op de hoofdhuid om bloot van de schedel.
  4. Klem de twee zijkanten van de banen met scherpe pincet en monteren van de hersenen. Plaats een tip van scherpe Iris schaar in het achterhoofdsgat en snijd lateraal in de schedel. Herhaal deze stap voor de andere kant.
  5. Gebruik scherpe Iris schaar aan zorgvuldig gesneden uit de dezelfde Holte, omhoog de middellijn, richting de neus. Proberen te houden van het einde van de schaar zo oppervlakkig mogelijk te voorkomen verwonden van de hersenen.
  6. Opheffing van de hersenen met een tang en gebruik scherpe Iris schaar zorgvuldig ontleden de craniale zenuwvezels. Verwijder de hersenen met een tang en plaats het in een tube van 15 mL met 5 mL van ijskoude RPMI/10% FBS medium.
  7. Pak de buikhuid met een tang en scherpe Iris schaar gebruik te maken van een longitudinale incisie door de omhulling en de buikwand en bloot de onderste deel van de buik. Duw de teelballen tot de incisie. Zachtjes trekken de vetlaag met een pincet en een bolvormige testis aan beide kanten bloot.
  8. Gebruik scherpe Iris schaar om zorgvuldig ontleden de vetlaag en de bijbal. Plaats de teelballen in een tube van 15 mL met 5 mL van ijskoude RPMI/10% FBS medium met een tang.
  9. Voor het genereren van een eencellige schorsing van de hersenen of de teelballen, het orgel plaats op een steriele cel zeef met een maaswijdte van 100 µm bovenop een tube van 50 mL en voeg toe 2 mL ijskoud RPMI/10% FBS medium. Met behulp van de zuiger van een injectiespuit 5 mL, pureer het orgel en medium toevoegen totdat het orgel volledig grond door middel van de Maas is.
  10. De celsuspensie overbrengen in een tube van 15 mL en Centrifugeer het bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  11. Resuspendeer de cellen met 5 mL 30% dichtheid kleurovergang voedingsbodem en, vervolgens, heel langzaam aan 2 mL voor 70% dichtheid kleurovergang medium in een tube van 15 mL toevoegen.
  12. Schakel de rem en centrifugeer de buizen bij 4 ° C bij 800 x g gedurende 30 min. verkrijgen de lymfocyten van de middelste laag.
  13. De interfase overbrengen in een verse buis 15 mL, voeg toe 10 mL van koude RPMI/10% FBS medium en centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  14. Resuspendeer de cellen met 10 mL van ijskoude RPMI/FBS medium samen en centrifugeer ze bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  15. Resuspendeer de cellen met 10 mL van volledige RPMI medium en het aantal cellen zoals in stap 3.9.

5. tetrameer voorbereiding

  1. Construct plasmiden uiting geven aan de extracellulaire domeinen van H-2Db met een site biotinyleerd tag op de C-terminus van het domein van de α3 en de β-2m met behulp van de vector pET28a met een NdeI en XohI beperking site18.
  2. Express en integratie organen van H-2Db en β2m zoals eerder beschreven20te bereiden.
  3. Renature en te zuiveren van de MHC/peptide complex H-2Db-E294-302.
    1. 200 mL van een refolding oplossing [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA-nb, 5 mM GSG en 0,5 mM GSSG] voor te bereiden. Toevoegen van proteaseinhibitors: 2 mL phenylmethylsulphonyl-fluoride (PMSF, voorraad 100 mM), 100 µL pepstatin (voorraad 2 mg/mL) en 100 µL leupeptin (voorraad 2 mg/mL). Koel de buffer bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    2. H-2Db, β2m en peptide toevoegen aan de refolding oplossing.
      1. 500 µL van β2m opgelost in een guanidine (30 mg/mL stockoplossing) met behulp van een spuit te injecteren. Hiervoor gebruik van een 23 G naald met een 5 mL-spuit en injecteren de β-2m in de refolding oplossing druppel voor druppel. Bewaar de oplossing voortdurend en langzaam roeren bij 150 t/min bij 4 ° C.
      2. Nadat β2m is ontbonden in de refolding oplossing, oplossen van 2 mg E294-302 peptide in 200 µL van DMSO en snel injecteren het in de refolding oplossing met behulp van een precisiepipet. Roer de oplossing langzaam bij 150 t/min bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
      3. Injecteren van 1,5 mL H-2Db opgelost in een guanidine. Houd de roer bar roterende bij 150 t/min voor het uiteinde van de H-2Db bij 4 ° C gedurende 8-10 h.
        Opmerking: De oplossing werd geplaatst in een gesloten doos in een koude kamer.
    3. Het refolded eiwit in een hydrofoor kamer met een 10 kDa membraan concentreren. Wisselen van de buffer [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] aan de kamer en het tot een eindvolume van 30-50 mL concentreren.
    4. Breng de refolding oplossing over in een centrifugebuis en draai het bij 2.500 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
    5. Het supernatant zorgvuldig overbrengen in een 10 kDa centrifugaal filteren en concentreren het verder tot een eindvolume van 500 µL bij 2.500 x g gedurende 30 min.
    6. Het supernatant overbrengen in een verse buis en draai het bij 12.000 x g gedurende 15 min. zuiveren het eiwit met de S200 10/300 GL gel filtration chromatografie.
    7. Verzamelen van de MHC complex piek en het tot een eindvolume van 350 µL concentreren.
  4. Voor het genereren van een 500-µL reactie volume voor biotinylation, voeg de regenten in de volgende volgorde: 100 µL van oplossing A [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µL van oplossing B (100 mM 100 mM MgOAc, ATP, 200 µΜ Biotine), 100 µL van extra d-biotine (500 µΜ Biotine) , 20 µL van BirA enzym (60 µg), 0,5 µL van pepstatin (2 mg/mL) en 0,5 µL van leupeptin (2 mg/mL). Incubeer de reactiebuis 's nachts bij 4 ° C.
    Let op: Niet elke EDTA toevoegt aan de reactie van de biotinylating.
  5. Zuiveren van de MHC met behulp van een S200 10/300 GL gel filtratie kolom te verwijderen elke extra biotine.
  6. Het bepalen van de efficiëntie van de biotinylating met een streptavidine-shift assay18.
    1. Drie monsters, A, B en C, op het ijs gedurende 30 minuten te bereiden. Dan, het analyseren van de resultaten met een 10% SDS-pagina. Monster A bestaat uit 8 µL van biotinyleerd MHC moleculen en 2 µL van exchange buffer, monster B van 8 µL van biotinyleerd MHC moleculen en 2 µL van daar (20 mg/mL), en steekproef C van 2 µL van daar (20 mg/mL) en 8 µL uitwisseling buffer.
      Let op: Het monster niet koken.
  7. Multimeren van de biotinyleerd MHC moleculen vormen.
    1. Produceren tetrameer door het mengen van de biotinyleerd E294-302 peptide-H2Db complex met phycoerythrin-label daar op een molverhouding 1:5 om een volledige binding van alle de biotinyleerd MHC moleculen.
    2. Berekent het bedrag van daar-conjugaat die nodig zijn voor tetramerization.
      1. Bepalen van de mol de complexen van de MHC/peptide boekhouding voor de eiwitconcentratie en de molaire gewicht (voorbeeld: 1,8 mg totaal eiwit = 40 nmol).
      2. Berekenen van de mollen voor de daar-conjugate nodig door de mol de MHC/peptide delen door 5 (voorbeeld: 40/5 = 8 nmol van daar-conjugate).
      3. Berekenen van de hoeveelheid streptavidine nodig (in µg) afhankelijk van de streptavidine-geconjugeerde (voorbeeld: streptavidine-PE [300.000 g/M] → 8 nmol nodig = 2.400 g).
    3. Verdeel daar-phycoerythrin in 10 monsters. Elk monster toevoegen aan een buis met de biotinyleerd E294-302 peptide-H2Db complex, met een tussenpoos van 20 min. Na het laden van het laatste monster, de reactiebuis bij 4 ° C's nachts in het donker uit te broeden.
  8. Toepassing van de multimerized reagentia in een buis van 100 kDa spin en concentreren door centrifugeren bij 2.000 x g bij 4 ° C tot een volume van < 100 µL.
  9. Verdun het monster in de buis van de spin tot 4 mL met behulp van PBS (pH 8.0) en opnieuw te concentreren < 100 µL.
  10. Herhaal de buffer uitwisseling stap in PBS (pH 8.0) 4 x.
  11. Opvullen van het totale volume opnieuw tot 500 µL met PBS (pH 8.0). Het concentreren van het monster tot een verwachte concentratie van 2-2,5 mg/mL bij 2.000 x g bij 4 ° C. Opslaan van het monster in het donker bij 4 ° C.

6. Stroom Cytometry

  1. Incubeer de schorsingen van de cel (uit stap 3.9 en/of stap 4.15) bij 4 ° C met 0,1 µL van anti-RattenUitrustingen CD16/CD32 Fc-Receptor blokkerende reagens per 20 µL (verdunning factor 1:200) gedurende 10 minuten, om te voorkomen dat een aspecifieke bindend.
  2. Centrifugeer de tetrameer buis bij 20.000 x g gedurende ten minste 15 min bij 4 ° C.
  3. 20 µL van de celsuspensie elk goed aan een 96-Wells platecontaining 1 x 106 cellen toevoegen.
  4. Een voldoende volume van de E294-302 tetrameer mix om alle experimentele buizen vlek voor te bereiden. Een overmaat van 15% van het totale volume van deze mix aan account voorbereiden pipetting fouten. Verdun de E294-302 tetramers (2 mg/mL, 1 µL/test) in FACS buffer (PBS, 0,5% FBS) zodat 20 µL van de E294-302 tetrameer mix is toegevoegd aan elke test.
  5. Voeg 20 µL van de E294-302 tetrameer mix aan de 96-wells-plaat. Aan het eind van deze stap moet het eindvolume in elk putje 40 µL.Incubate de plaat in het donker op kamer temp gedurende 30 minuten.
  6. Primaire antilichamen (FITC-geconjugeerd of APC-geconjugeerde anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-geconjugeerde anti-CD8 (0,2 mg/mL)) op 1 µL/test aan de celsuspensie toevoegen en vervolgens na het bebroeden bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
  7. Wassen van de cellen 2 x met 2 mL FACS buffer en centrifuge hen bij 600 x g gedurende 5 min. zorgvuldig gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen met 200 µL van FACS buffer.
  8. Bewaren de monsters tijdelijk bij 4 ° C in het donker tot de stroom cytometrische analyse.
  9. Gebruik de volgende gating strategie voor de flow cytometrische analyse.
    1. Maak een poort op diagonaal geclusterde onderhemden door het uitzetten van een voorwaartse scatter (FSC) versus kant scatter (SSC) gebied.
    2. Vervolgens poort op CD3+ cellen door kant scatter (SSC) versus CD3; vervolgens poort op CD3+ CD8+ cellen; tot slot schetsen CD8+ tetrameer+ cellen19.

7. histopathologie en immunofluorescentie Immunohistochemistry Assay

  1. Histopathologisch onderzoek assay
    1. De hersenen en de testis weefsels van de ZIKV-besmet Ifnar1- / - muizen 7 d na inoculatie verzamelen en corrigeren in 4% neutraal gebufferde formaldehyde.
      Let op: Paraformaldehyde is giftig; Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
    2. Het weefsel inbedden in paraffine.
    3. Het gedeelte van het weefsel op 5 mm met behulp van een vibratome.
    4. Vlek het weefsel met haematoxyline en eosine (H & E).
  2. Immunohistochemistry assay
    1. Deparaffinize, hydrateren en het weefsel antigeen-ophalen eerder beschreven secties, gebaseerd op procedures21.
    2. Behandel de weefselsecties met 3% H2O2 in PBS (pH 7,6) gedurende 10 minuten en blokkeren ze met 1% bovien serumalbumine (BSA) gedurende 10 minuten.
    3. Incubeer de weefselsecties met rat anti-muis CD3 antilichaam (verdunning: 1/1000) voor 8 h bij kamertemperatuur en, vervolgens, hen bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
    4. Spoel de weefsels met PBS en, vervolgens, broeden ze met 3 druppels biotinyleerd secundair antilichaam (verdunning: 1/1000) voor 2 h bij kamertemperatuur, gevolgd door 3 druppels van avidin-Biotine-peroxidase (verdunning: 1/200) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    5. Binden, met 3 druppels 30, 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (verdunning: 1/1000), zoals eerder beschreven22.
    6. Counterstain de weefselsecties met Mayers Haematoxyline.
  3. Immunofluorescentie assay
    1. De bevroren testis secties (6 mm) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur drogen.
    2. Corrigeren met ijskoude aceton gedurende 10 minuten.
    3. De secties met PBS voor 3 x wassen en blokkeren ze met een blokkeerbuffer (0,3%, 1% BSA Triton, 1 x PBS) bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    4. Incubeer de weefselsecties met primair antilichaam (Z6) (20 µg/mL) bij 4 ° C's nachts.
    5. Spoelen van de weefsels met PBS en het secundaire antilichaam (verdunningsfactor: 1/200) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    6. Wassen van de weefselsecties met PBS en counterstain hen voor kernen met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdunningsfactor: 1/1000), na instructies van de fabrikant.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naar aanleiding van deze methoden, hebben we een lymfkliertest model voor ZIKV infecties. Ifnar1- / - muizen op 6-8 weken oud waren besmet met 1 x 104 focus-vormende eenheden (FFU) van de ZIKV door retroorbital injectie. Pathologische symptomen en tekenen (Figuur 1A), alsmede veranderingen in het lichaamsgewicht (Figuur 1,B), werden waargenomen in de Ifnar1- / - muizen na een infectie met het ZIKV. De lymfkliertest hersenen toonde duidelijk oedeem en hyperemia (Figuur 1C). Ondertussen, de teelballen kromp geleidelijk (Figuur 1D). Bovendien, pathologische veranderingen en de vernietiging van weefsel werden vastgesteld in de hersenen en de teelballen(Figuur 2). Wij uitgevoerd een immunofluorescentietest assay voor het detecteren van de ZIKV in de hersenen en de teelballen (Figuur 2B). Hoge virale loads werden ontdekt in de hersenen en de testis door immunokleuring (Figuur 2B). Immunohistochemistry toonde een robuuste infiltratie van CD3+ T cellen in de hersenen van muizen na de infectie met het ZIKV (Figuur 2C).

Om te ontdekken en evalueren van ZIKV-specifieke T-cel reacties, wij bereid een muis MHC-ik H-2Db-E294-302 tetrameer. De peptide E294-302 kunnen helpen de H-2Db renature goed en leveren een hoog gehalte aan het oplosbaar MHC-ik (Figuur 3A). In de verschuiving assay, kon een hoog rendement in de biotinylation worden waargenomen (Figuur 3B). Vervolgens drie daar fluorescentie (APC, PE, en BV421) - gelabeld pMHC - ik tetramers werden geproduceerd voor het detecteren van ZIKV-specifieke T-cellen (Figuur 3C). De PE-geëtiketteerden tetrameer had een grotere werkzaamheid te detecteren de specifieke CD8+ T cel ten opzichte van de APC - en BV421-met het label tetramers, maar het verschil niet statistisch significant was.

Met behulp van de E-294-302 tetrameer, we ZIKV-specifieke T-lymfocyten gedetecteerd in de milt van de geïnfecteerde muizen door stroom cytometry op 7 d na inoculatie van de ZIKV (3.49 ± 0,45%). Ook, vergelijkbaar met de methode beschreven in punt 3 van dit protocol, met 4 weken na immunisatie van AdC7-M/E vaccin, ZIKV-specifieke T-lymfocyten werden ontdekt in de milt (6.89 ± 1,36%) (Figuur 4).

Bovendien ontdekt we de lymfocyten geïnfiltreerd in de immunoprivileged-organen, zoals de hersenen en de teelballen, na de ZIKV-infectie. De poorten zijn ingesteld om te kiezen voor CD3+CD8+ T cellen in totale lymfocyten van de hersenen en de teelballen. Een hoge verhouding van de E-294-302 tetrameer-specifieke T-cellen kon worden opgespoord in de hersenen (42,2% in CD3+CD8+ T cellen) en de testiculaire (26.4% in CD3+CD8+ T cellen) lymfocyten (Figuur 5).

figure-results-1
Figuur 1 : Karakterisering van de infectie van de ZIKV in Ifnar1- / - muizen. Ifnar1- / - muizen op 6-8 weken oud waren besmet met 104 focus-vormende eenheden (FFU) van de ZIKV door retroorbital injectie, en muizen geïnjecteerd met PBS werden gebruikt als virusvrije controles. De morfologie van de (A) en (B) veranderingen in het lichaamsgewicht van besmette Ifnar1- / - muizen werden gecontroleerd. De rode pijlen geven Ifnar1- / - muizen gepresenteerd met myeloparalysis en motor paraparese na de infectie. (C) hersenen bij 7 d na inoculatie en (D) teelballen op 0, 7, 14 en 30 dagen na inoculatie zijn geoogst. Representatieve beelden van de hersenen en de testes van de muizen staan met een liniaal om aan te geven van de maten. De foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. n = 10 muizen per groep per experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 : Detectie van de ZIKV en de lymfocyten in de hersenen en de testis van ZIKV-besmet Ifnar1- / - muizen. (A) dit paneel toont histopathologische veranderingen in de hersenen en de teelballen van ZIKV-geïnfecteerde muizen in vergelijking met de negatieve controles op na inoculatie van de 7 d. Schaal bar = 25 µm (linkerdeel) en 50 µm (rechtervenster). (B) een immunofluorescentietest assay werd uitgevoerd met de anti-ZIKV Z6 antilichaam (groen). Alle weefselsteekproeven werden verzameld uit ZIKV-geïnfecteerde muizen op na inoculatie van de 7 d. De kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaal bar = 50 µm. (C) Immunohistochemistry shows een robuuste infiltratie van CD3+ T cellen in de hersenen en de testis. Schaal bar = 25 µm (linkerdeel) en 50 µm (rechtervenster). Paars ziet u haematoxyline, brown vertegenwoordigt het CD3 antilichaam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3 : Voorbereiding van de ZIKV-specifieke pMHC-ik tetramers. (A) de binding van E294-302 naar H-2Db is opgehelderd door een in vitro uiteinde. Blauwe geeft aan de H-2Db-E294-302 proteïne. Oranje vertegenwoordigt de negatieve controle zonder peptide. (B) dit paneel toont de H-2Db-E294-302 shift assay. (C) de mock vertegenwoordigt een PBS-controle. Drie streptavidine-fluorescentie (APC, PE, en BV421) - gelabeld pMHC - ik tetramers werden gebruikt voor het detecteren van ZIKV-specifieke T-cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4 : Cytometrische analyse van virus-specifieke CD8 flow + T-cellen in de milt van ZIKV-besmet en vaccin-geïmmuniseerd muizen. Ifnar1- / - muizen op 6-8 weken leeftijd of besmet waren met 104 focus-vormende eenheden (FFU) van ZIKV of ontvangen van een eenmalige toediening van 4 x 1010 virale deeltjes van AdC7-M/E of PBS als negatieve controle. Na 7 dagen na infectie of 4 weken na vaccinatie, werden muis splenocytes geoogst en geanalyseerd door stroom cytometry. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA (niet significant: P > 0,05; *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0.001; ***P < 0.0001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

figure-results-5
Figuur 5 : Strategie en vertegenwoordiger resultaten van de virus-specifieke CD8 gating+ T cellen in de hersenen en de testikels van muizen ZIKV-geïnfecteerde. Representatieve percelen worden weergegeven voor de geïnfiltreerde lymfocyten in (A), de hersenen en (B) de testis. Een opeenvolging van poorten is ingesteld op selectie lymfoïde-scatter+ en CD3+ gebeurtenissen. Van deze, CD8+ gebeurtenissen zijn gated voor de analyse van epitoop-specifieke T-cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunogene T-cel-epitoop speelt een belangrijke rol in de cellulaire immuniteit tegen ziekteverwekkers23. De detectie van ZIKV-specifieke T-cellen in immunoprivileged organen is dus een kritische methodologie te begrijpen van T-cel reacties tegen de natuurlijke ZIKV-infectie. Ondertussen, detectie van T-cel-reactie is een uitstekend hulpmiddel om te onderzoeken van de werkzaamheid van de virale vaccin. Hier, laten we een uitgebreide protocol bij het visualiseren van de experimenten, waaronder het isolement van lymfocyten van de milt, hersenen en testes van ZIKV-geïnfecteerde muizen, de voorbereiding van de immunodominante epitoop E294-302 tetrameer, en de erkenning van ZIKV-specifieke CD8+ T cellen in de organen van de immunoprivileged van ZIKV-geïnfecteerde muizen.

Een eerdere studie bleek dat een live ZIKV of haar RNA kan worden opgespoord in het sperma van mannelijke patiënten, die erop wijst dat de ZIKV kan omzeilen van de barrière van de bloed-testis en zelf in de reproductieve systeem24te repliceren. Eerder, toonden we ook dat de ZIKV kan teelballen schade veroorzaken en tot mannelijke onvruchtbaarheid in muizen25 leiden. ZIKV infectie kan leiden tot voorjaarsviremie in rhesus monkeys en het virale RNA kan worden ontdekt in het centrale zenuwstelsel (CNS), alsook in de viscerale organen. Immunohistochemistry is gebleken dat de ZIKV-specifieke antigenen in het centraal zenuwstelsel en de meerdere perifere organen26werden gepresenteerd. Ook in lymfkliertest modellen, ZIKV infectie kan leiden tot een krachtige antivirale CD8+ T-cel-respons in de milt en CNS26.

Vergeleken met eerdere werk, deze studie stelt systematische methoden voor het detecteren van ZIKV-specifieke CD8+ T-cel reacties in de hersenen en de testes, die immunoprivileged sites zijn. Het is belangrijk om te beoordelen van de functionaliteit van virus-specifieke T-cellen in de organen van de immunoprivileged van de ZIKV-geïnfecteerde muizen. Het gebruik van tetramers om te detecteren ZIKV-specifieke CD8+ T-cel reacties in immunoprivileged organen zou aanzienlijk vergroten van ons begrip van ZIKV infecties en hun host immuunrespons. Met behulp van E294-302 tetrameer, kunnen virus-specifieke T-cellen in de hersenen en de testis worden geïsoleerd door stroom cytometry, om te onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en de immunopathogenese tijdens een ZIKV infectie. Ondertussen is het nuttig voor onderzoekers om verder te onderzoeken de functies van de CD8+ T cellen wilt bepalen van de ZIKV, of ter verbetering van de immunopathogenese in deze organen tijdens ZIKV infectie.

Voor het analyseren van de antigeen-specifieke lymfkliertest CD8+ T-cel reacties in de organen van de immunoprivileged, wij bereid H-2Db-E294-302 tetrameer en ontdekt de CD8+ T cellen door stroom cytometry. Tetramers zijn een krachtig hulpmiddel voor het detecteren van antigeen-specifieke T-cellen. Hier zijn drie soorten fluorescerende-geconjugeerde streptavidine (APC, PE, en BV421) gegenereerd. Hoewel er geen statistisch significante verschillen in de APC-, BV421- en PE-label zijn voor het opsporen van antigeen-specifieke T-cellen, PE-label pMHC tetramers-ik tetramers de beste resultaten opgeleverd. Vandaar, de PE-geëtiketteerden tetrameer werd gebruikt gedurende deze studie. Interessant, ontdekt gebaseerd op de PE-geëtiketteerden H-2Db-E294-302 tetrameer, we hoge ratio's van antigeen-specifieke T-cellen in zowel de testes, die wijzen op de mogelijkheid van de migratie van de virus-specifieke T-cellen van het bloed naar de hersenen immunoprivileged de organen.

Er zijn echter enkele beperkingen bij het protocol. De H-2Db-E294-302 tetrameer is niet nuttig voor menselijk T-cel-detectie, omdat tetrameer detectie afhankelijk van MHC beperking is. De screening van de immunodominante HLA-beperkte peptiden is nog nodig. Bovendien, retro-orbitaal infectie is effectief voor een ZIKV infectie maar misschien niet de geschikte operatie voor sommige onderzoekers. Andere routes van besmetting, met inbegrip van peritoneale, subcutane of intraveneuze, zijn dus ook aangeraden.

In het protocol beschreven hier, is een cruciale stap het isolement van monocyten uit de hersenen en de testis. Het is belangrijk om te verwerven van kwalitatief hoogwaardige lymfocyten; het is dus belangrijk aandacht te besteden aan, bijvoorbeeld, de centrifugaal snelheid, de kracht van de schuurmachine weefsel, en de dissectie van de hersenen en de testis weefsel. Bovendien, tetrameer voorbereiding, protease remmers (PMSF, pepstatin, leupeptin) zijn handig als een eiwit beschermen wordt gedegradeerd. Daarom is het zinvol een proteaseinhibitor toevoegen aan de refolding buffer en uitwisselen van de buffer tijdens het proces van het preparaat tetrameer.

Tot slot presenteren we de methoden voor het opsporen van antigeen-specifieke T-cel reacties in de organen van de immunoprivileged van de Ifnar1- / - muismodel voor een ZIKV infectie. Dit platform kan algemeen worden toegepast om te onderzoeken de immuun mechanismen van nieuwe en opnieuw de kop van virussen die de barrières tussen het bloed en de organen van de immunoprivileged kunnen mijden. Bovendien, deze studie kan de weg effenen voor de toekomstige ontwikkeling van kandidaat-vaccins en immuuntherapie.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Gary Wong voor de Engelse herziening. Dit werk werd gesteund door de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (grant 2017YFC1200202), de grote speciale projecten voor besmettelijke ziekte onderzoek van China (subsidie 2016ZX10004222-003). George F. Gao is een toonaangevende hoofdonderzoeker van de nationale Natural Science Foundation van China innovatieve Research Group (grant 81621091).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Z6our labMa W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3Santa Cruzsc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)ZSGB-BIOZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC ConjugatedCWBIOCW0115
FITC anti-mouse CD3Biolegend17A2
APC anti-mouse CD3Biolegend100236
PerCP anti-mouse CD8aBiolegend100732
PercollGE HealthcareP8370
PMSFAmeresco0754-5GToxisch en corrosief reagens.
Voorzichtig hanteren
StreptadivinBDS4762-FZGeeft een heldere oplossing bij 10mg/ml in PBS en  bewaard bij -20 °C
PepstatinSigmaP4265-5MG5 mg in 2,5 mL DMSO, aliquoten bewaard bij -20 ºC
LeupeptinSigmaL85115 mg in 2,5 mL dH2O, aliquoten bewaard bij - 20 ºC
PeptidesScilight-peptideMoet worden opgeschort in DMSO en bewaard bij -20 °C
RPMI 1640HycloneSH30809.01Moet worden bewaard bij 4 °C
DMSOMP219605590Bewaar op kamertemperatuur.
APC-StreptadivinBD554067Moet worden bewaard en onderhouden op
4 °C. Niet invriezen.
FITC-StreptadivinBD554060Moet worden bewaard en onderhouden op
4 °C. Niet invriezen.
PE-StreptadivinBD554061Moet worden bewaard en onderhouden op
4 °C. Niet invriezen.
BV421-StreptadivinBD563259Moet worden bewaard en onderhouden op
4 °C. Niet invriezen.
PageRuler Unstained Protein LadderThermo Fisher Scientific 26614Moet worden bewaard bij 4 °C
Cell StrainersBFBF10-5040Bewaar op kamertemperatuur.
Amicon Ultra 100 kDaMilliporeUFC510024Bewaar op kamertemperatuur.
UltracentrifugeThermo Fisher Scientific 
FACS CantolFlowcytometer moet lasers en filters bevatten die compatibel zijn met het gebruikte kleuringspaneel.
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE healthcare28990944
AKTA PUREGE healthcare
red blood cell lysis bufferSolarbioR1010Bewaar bij 4 °C.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
  4. Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
  5. Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
  6. Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204(2016).
  7. Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
  8. Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  9. Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
  10. Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
  11. Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
  12. Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
  13. Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
  14. Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257(2014).
  15. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420(2012).
  16. Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256(2015).
  17. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658(2016).
  18. Altman, J. ohnD., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  19. Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
  20. Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
  21. Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
  22. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293(2015).
  23. Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
  24. Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
  25. Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
  26. Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tetrameerkleuringflowcytometriehersenen testikels miltvirusinfectievaccinimmunisatieantigeenspecifieke T cellen

Gerelateerde artikelen