Synthese en karakterisering van 1,2-Dithiolane gemodificeerde zelfassemblerende Peptides

Summary

Een protocol voor de synthese van een 1,2-dithiolane gemodificeerde peptide en de karakterisatie van de supramoleculaire structuren die voortvloeien uit de peptide zelf-assemblage.

Abstract

Dit verslag richt zich op de synthese van een N-terminus 1,2-dithiolane gemodificeerde zelfassemblerende peptide en de karakterisatie van de resulterende zelf geassembleerd supramoleculaire structuren. De synthetische route maakt gebruik van solid-phase peptide synthese met de koppeling van de op-hars van de dithiolane voorloper molecule, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propanoic acid, en de magnetron-bijgewoonde thioacetate deprotection van de peptide N-terminus vóór definitieve splitsing van de hars aan opbrengst de 1,2-dithiolane bewerkt peptide. Na de zuivering van de krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) van de 1,2-dithiolane peptide, afgeleid van de nucleating kern van de Aβ peptide geassocieerd met de ziekte van Alzheimer, is aangetoond dat de peptide zelf monteren in cross-β-amyloïde vezels. Protocollen bij het karakteriseren van de amyloïde vezels door Fourier-transform infrarood spectroscopie (FT-IR), circulair dichroïsme spectroscopie (CD) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) worden gepresenteerd. De methoden van N-terminal met een 1,2-dithiolane groep aangebrachte goed gekarakteriseerd zelfassemblerende peptiden kunnen nu worden onderzocht als modelsystemen na vergadering wijziging strategieën ontwikkelen en dynamische covalente chemie verkennen op Supramoleculaire peptide nanofiber oppervlakken.

Introduction

De robuuste peptide bond vorming van chemie betrokken bij solid-phase peptide synthese en de mogelijkheid om controle van volgorde lengte en samenstelling maken de peptiden die zelf monteren in supramoleculaire structuren een zwaar onderzocht veld. De factoren die bepalen en stabiliseren van peptide zelf geassembleerde structuren, met inbegrip van de zijketen sterische en elektrostatische interacties, waterstof binding en hydrofobe effecten¹, dienen als een set van regels voor het ontwerp. Aangezien het onderzoek naar deze fundamentele ontwerpregels vooruitgang blijft, de logische volgende stap in peptide zelf-assemblage gaat om uitbreiding van....

Protocol

1. synthese en zuivering van 1,2-Dithiolane gemodificeerde Peptide

1. Synthese van dithiolane precursor, 3-(acetylthio) -2-¹⁹propanoic acid (acetylthiomethyl).
   1. Voeg 1 g 3-bromo - 2-(bromomethyl) propionzuur (1 equiv.) opgelost in een minimale hoeveelheid van 1 M NaOH (ongeveer 4 mL) in een maatkolf van 25 mL ronde bodem reactie met roeren bij 55 ° C. Zegel van de reactiekolf met een septa en onder stikstof atmosfeer te plaatsen.
   2. Bereid een oplossing met 1,49 g kalium thioacetate (3.2 equiv.) in 4 mL gedeïoniseerd water en 3 mL 2 M zwavelzuur (H₂SO₄) maken thioacetic zuur in ....

Results

Afgezien van de eerste one-step-synthese van de molecule dithiolane voorloper, de rest van de 1,2-dithiolane bewerkt peptide synthese treedt op op een stevige steun (figuur 1A). De conversie van 3-bromo - 2-(bromomethyl) propionzuur 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propanoic acid, de voorloper van de dithiolane, wordt bevestigd door ¹H en ¹³C-NMR (figuur 1B en C) voordat het is gekoppeld.......

Discussion

Dit artikel behandelt de details van zowel de synthese en de zuivering van een N-terminal 1,2-dithiolane bewerkt zelfassemblerende peptide en de karakterisatie van de resulterende supramoleculaire structuren. De synthese van de 1,2-dithiolane peptide gemeld hier heeft voordelen, met inbegrip van een one-step synthese voor de productie van de dithiolane-precursor, 3-(acetylthio) -2-(acetylthiomethyl) propanoic acid, en de op-hars magnetron deprotection reactie van de voorloper thioacetate groep om de groep van de geoxidee.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rink amide MBHA resin, high load	Gyros Protein Technologies	RAM-5-HL	Avoid contact with skin and eyes; do not inhale
N,N-Dimethylformamide	Fisher Scientific	D119-4	Flammable liquid and vapor; irritating to eyes and skin; Use personal protective equipment; keep away from open flame
Fmoc-L-Val-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-V	Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Leu-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-L	Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-KBC	Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Phe-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-F	Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Ala-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-A	Wear personal protective equipment; do not inhale
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH	Gyros Protein Technologies	FLA-25-QT	Wear personal protective equipment; do not inhale
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate	Gyros Protein Technologies	26432	Causes skin, eye and respiratory irritation; do not inhale; use under hood or in well ventilated area
0.4 M N-methylmorpholine in DMF	Gyros Protein Technologies	PS3-MM-L	highly flammable; wear personal protective equipment; keep away from heat and keep container tightly closed; do not inhale or swallow; wash skin thoroughly after handling
20% piperidine in DMF	Gyros Protein Technologies	PS3-PPR-L	Causes severe eye and skin burns; Flammable Liquid and vapor; Do not inhale
dichloromethane	Fisher Scientific	D37-4	May cause cancer; Do not inhale; Wear personal protective equipment; use under hood only; if contacted rise with water for at least 15 minutes and obtain medical attention
acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	Flammable; irritating to eyes; Use personal protective equipment; Use only under a fume hood; keep away from open flame or hot surface; if contacted rinse wiith water for at least 15 minutes and obtain medical attention
trifluoroacetic acid	Fisher Scientific	A116-50	Causes severe burns; do not inhale; harmful to aquatic life; use personal protective equipment; use only under fume hood; if contacted rinse with water for at least 15 minutes and obain immediate medical attention
4% uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-4	Do not inhale; harmful to aquatic life
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Acros Organics	AC172571000	Do not inhale; use outdoors or in well-ventilated area
nitrogen Gas	TechAir		Contents under pressure, may explode if heated
3-bromo-2-(bromomethyl)propionic acid	Alfa Aesar	AAA1963014	Do not inhale; causes irritation to skin and eyes; corrosive
sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-100	Use personal protective equipment; use only under fume hood; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
potassium thioacetate	Acros Organics	AC221300250	Causes skin and eye irritation; do not inhale; use personal protective equipment
sulfuric acid	Fisher Scientific	SA213	Causes burns; keep away from water; keep away from combustible material; do not inhale; use personal protective equipment; if contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
chloroform-d	Acros Organics	AC320690075	Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
chloroform	Fisher Scientific	C298-4	Possible cancer hazard; irritating to skin and eyes; do not inhale; Use personal protective equipment; use only under fume hood; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
N,N-diisopropylethylamine	Acros Organics	AC367841000	Highly flammable; harmful to aquatic life; wear personal protective equipment; do not swallow
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Corrosive; do not inhale
methanol	Fisher Scientific	A452-4	Flammable liquid and vapor; use personal protective equipment; do not inhale; If contact rinse area for at least 15 minutes and obtain medical attention
triisopropylsilane	Sigma Aldrich	233781	Flammable; use personal proctective safety equipment; keep container tightly closed
diethyl ether	Fisher Scientific	E138-1	Extremely flammable; Irritating to skin and eyes; Use personal protective equipment
2,5-dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich	39319-10x10MG-F	do not inhale; irritating to skin and eyes
alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Alfa Aesar	AAJ67635EXK
c18 zip-tip	Millipore	ZTC18S096
tris(2-carboxyethyl) phospine hydrochloride	Thermo Scientific	PI20490
silica gel 60 F254 coated aluminum-backed TLC sheets	EMD Millipore	1.05549.0001
Thin walled Precision NMR tubes	Bel-Art	663000585	5mm O.D.
All-plastic Norm-Ject syringes	Air Tite	AL10
single-use needle	BD PrecisionGlide	BD 305185	used needles get disposed on in sharps waste container
disposable fritted syringe	Torviq	SF1000LL	10mL fritted syringes were used in the report, but larger syringes are avaibale if needed for larger scale synthesis.
carbon grid	Ted Pella, Inc.	CF200-CU	Make sure to prepare samples and staining on the carbon grid side, not the shiny copper side of grid
self-closing tweezers	Electron Microscopy Sciences	78318-3X	very sharp tips, length: 120 mm
0.1 mm short path length cell	Starna Cells, Inc.	20/C-Q-0.1	Fragile
10mL Vessel Caps	CEM	909210
10mL Pressure Vessels	CEM	908035
Aeris Semi-Prep HPLC column	Phenomenex	00F-4632-N0	150 x 10mm
cell holder	Starna Cells, Inc.	CH-2049	Needed when using short pathlength cells
PS3 peptide synthesizer	Gyros Protein Technologies
DiscoverSP Microwave Reactor	CEM
centrifuge	HERMLE	Z 206 A	used a fixed 6x50 mL rotor
HPLC	Shimadzu		UV Detector
nuclear magnetic resonance spectrometer	Avance, Bruker		300 MHz
MALDI-TOF mass spectrometer	Axima Confidence, Shimadzu
lyophilizer	Millrock Technology	BT85A
Fourier-Transform Infrared Spectrometer	Alpha Tensor, Bruker
Transmission Electron Microscope	Tecnai Spirit, FEI		Used with Gatan Orius Fiberoptic CCD digital camera. Accessed at CSCU Center for Nanotechnology
Circular Dichroism Spectropolarimeter	J-810, JASCO		Used with a six-cell Peltier temperature controller. Accessed at Wesleyan University.