De protocollen voor het bestuderen van de binding van gouden kationen (Au(III)) naar verschillende conformaties van bovien serumalbumine (BSA) zoals alsook voor het karakteriseren van de conformationele afhankelijke unieke BSA-Au fluorescentie worden gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Luminophore formatie in verschillende conformaties van bovien serumalbumine door Binding van Gold(III)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het doel van de voorgestelde protocollen is te bestuderen van het proces van Au(III) binding aan BSA, opbrengst conformatie verandering-geïnduceerde rode fluorescentie (λem = 640 nm) van BSA-Au(III) complexen. De methode past de pH om te laten zien dat de opkomst van de rode fluorescentie is gecorreleerd met de pH-geïnduceerde evenwicht overgangen van de BSA conformaties. Rode fluorescerende BSA-Au(III) complexen kunnen alleen worden gevormd met een aanpassing van de pH op of boven 9.7, die overeenkomt met de "A-poot" conformatie van BSA. Het protocol voor aanpassen van de BSA Au molaire verhouding en het controleren van het tijdsverloop van het proces van Au(III) binding wordt beschreven. Het minimum aantal Au(III) per BSA, voor de productie van de rode fluorescentie, is minder dan zeven. We beschrijven het protocol in stappen om te illustreren de aanwezigheid van meerdere Au(III) bandplaatsen in BSA. Eerste, door toevoeging van koper (Cu(II)) of nikkel (Ni(II)) caties gevolgd door Au(III), deze methode blijkt een bindende site voor Au(III) thats niet de rode fluorophore. Ten tweede, door aanpassing van BSA door thiol aftopping agenten, een andere nonfluorophore-vormende Au(III) bindende site wordt geopenbaard. Ten derde, het veranderen van de gedaante BSA door splijten en de aftopping van de disulfide bindingen, de (s) van de mogelijke Au(III)-bindende worden geïllustreerd. Het protocol beschreven, als u wilt bepalen van de BSA conformaties en Au(III) bindende, kan over het algemeen worden toegepast om te bestuderen van de interacties van de andere eiwitten en metalen caties.
Inleiding
Een verbinding van de BSA-Au exposeren een ultraviolet (UV)-prikkelbaar rode fluorescentie, met opmerkelijke verschuiving stokes, heeft zijn oorspronkelijk gesynthetiseerd door Xie et al.. 1. de unieke en stabiele rode fluorescentie vindt verschillende applicaties op gebieden zoals sensing2,3,4, imaging5,6,7, of nanogeneeskunde8 ,9,10,11,12,13. Deze verbinding is uitgebreid bestudeerd door vele onderzoekers op het gebied van nano-wetenschap in de afgelopen jaren14,15,16. De BSA-Au-compound is geïnterpreteerd als Au25 nanoclusters. Het doel van de onderhavige methode is deze compound in detail onderzoeken en begrijpen van de oorsprong van de rode fluorescentie. Door het volgen van de gepresenteerde aanpak, kunnen de aanwezigheid van meerdere Au bandplaatsen, en de oorsprong van de fluorescentie, alternatief voor de nucleatie van één site van Au25 nanoclusters, worden geïllustreerd. Dezelfde aanpak kan worden gebruikt om te bestuderen hoe andere eiwitten17,18,19 complexvorm met Au(III) hun intrinsieke fluorescerende eigenschappen kunt wijzigen.
De synthese van het rood-fluorescerende BSA-Au samengestelde vereist een smalle controle van de molaire verhoudingen van BSA aan Au (BSA:Au) om de intensiteit van de fluorescentie en de locatie van de pieken in de excitatie-emissie kaart (EEM)20te maximaliseren. Kan worden aangetoond dat er meerdere bandplaatsen bestaan voor Au(III) te binden, met inbegrip van de Asparagine fragment (of ASP-fragment, de eerste vier aminozuurresidu's op de N-terminus van BSA)21,22. De 34th aminozuur van BSA (Cys-34) blijkt ook te coördineren van Au(III) en te worden betrokken in het mechanisme van de rode fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20. Op het splijten van alle Cys-Cys disulfide bindingen en aftopping alle thiolen, rode fluorescentie is niet geproduceerd ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Dit wijst op de noodzaak van Cys-Cys bisulfide obligaties als de Au(III) binding site voor de productie van de rode fluorescentie.
Eiwit chemie technieken hebben niet wijd gebruikt om te studeren het BSA-Au(III) complexen in de nano-wetenschappelijke gemeenschap. Het zou echter waardevolle om deze technieken te begrijpen van bepaalde aspecten van deze complexen, alsook over de gedetailleerde inzicht voor de Au(III) bandplaatsen in BSA in dienst. Dit artikel is bedoeld om te laten zien dat sommige van deze technieken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. synthese van BSA-Au(III) Complex
- Los op 25 mg BSA in 1 mL krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) rang water in een flesje van 5 mL reactie.
Opmerking: De oplossing moet duidelijk weergegeven. - Goud (III) chloride Trihydraat (chloroauric zuur) tot een concentratie van 5 mM in HPLC rang water los.
Opmerking: De oplossing moet verschijnen gele. Chloroauric zuuroplossing voorbereid op deze concentratie zal resulteren in een BSA Au/ratio van 1:13.- Als alternatief, bereid een oplossing van chloroauric zuur met een concentratie van ergens tussen 0.38 mM (BSA:Au = 1:1) tot 20 mM (BSA:Au = 1:50) in HPLC rang water.
Opmerking: Verschillende ratio's van BSA goud zal resulteren in de drastisch verschillende rode fluorescentie patronen van de excitatie-emissie-kaart.
- Als alternatief, bereid een oplossing van chloroauric zuur met een concentratie van ergens tussen 0.38 mM (BSA:Au = 1:1) tot 20 mM (BSA:Au = 1:50) in HPLC rang water.
- Plaats de ampul reactie van BSA in een waterbad 37 ° C en krachtig roer bij 750 rpm met een magneetroerder.
- Onmiddellijk na het schudden begint, voeg 1 mL chloroauric zuur aan de oplossing. De kleur van de oplossing moet transformeren van duidelijk in geel.
- Roer het mengsel gedurende 2 minuten bij 37 ° C en bij 750 rpm met een magneetroerder.
- Toevoegen in de reactie injectieflacon, 100 μl van 1 M NaOH aan de oplossing om de pH-waarde tot en met 12.
Opmerking: Onmiddellijk nadat NaOH is toegevoegd, de oplossing moet iets donkerder tot een geel-bruin en schakel vervolgens terug naar geel. - Blijven roeren van bij 750 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur en bij 37 ° C. De oplossing moet het langzaam veranderen van geel naar een donker geel/bruine kleur. Deze kleurverandering geeft aan de vorming van de rode fluorescerende BSA-Au(III) complex.
- Toestaan dat de steekproef zitten bij kamertemperatuur voor 2 dagen, en de oplossing zal blijven tot een oranje bruin donkerder en de intensiteit van de fluorescentie zal toenemen.
- Anderzijds laat het monster blijven roeren bij 37 ° C gedurende 12 meer h als de kleur van de oplossing naar een oranje bruin evolueert.
2. synthese van BSA-Cu(II)-Au(III)
- Los op 25 mg BSA in 1 mL HPLC rang water. De oplossing moet worden duidelijk weergegeven.
- Oplossen van koper (II) chloride (dihydraat) p.a. in HPLC rang water tot een concentratie van 5 mM. De oplossing moet verschijnen licht blauw.
- 1 mL van de waterige oplossing van de BSA toevoegen aan een flesje van 5 mL reactie en plaatsen in een waterbad bij 37 ° C. Roer het mengsel op 750 rpm.
- Onmiddellijk toevoegen van 0,5 mL van de koper (II) chloride (dihydraat) p.a. oplossing aan de reactie flacon en meng gedurende 2 minuten. De oplossing blijft licht blauw.
- Voeg 75 l 1 M NaOH te brengen van de pH tot en met 12 en laat mengen gedurende 2 uur. De oplossing wordt paars.
- Los chloroauric zuur in HPLC rang water tot een concentratie van 5 mM.
- Voeg 0,5 mL van een waterige chloroauric zuur aan de reactie flacon en breng de pH terug naar 12 met behulp van de 1 M NaOH.
- Roer het reactiemengsel gedurende 2 uur.
Opmerking: De oplossing moet evolueren naar een bruine kleur.
3. synthese van BSA-Ni(II)-Au(III)
- Los op 25 mg BSA in 1 mL HPLC rang water. De oplossing moet worden duidelijk weergegeven.
- Ontbinden van nikkel (II) chloride-hexahydraat in HPLC rang water tot een concentratie van 5 mM. De oplossing moet verschijnen licht groen.
- 1 mL van de waterige oplossing van de BSA toevoegen aan een flesje van 5 mL reactie en plaats in een waterbad bij 37 oC. Roer het mengsel op 750 rpm.
- Onmiddellijk vergroten met 0,5 mL van de oplossing van nikkel (II) chloride-hexahydraat de reactie flacon en meng gedurende 2 minuten.
Opmerking: De oplossing blijft licht groen. - Voeg 75 l 1 M NaOH te brengen van de pH tot en met 12 en laat mengen gedurende 2 uur.
Opmerking: De oplossing zal donker geel geworden. - Los chloroauric zuur in HPLC rang water tot een concentratie van 5 mM.
- Voeg 0,5 mL van het waterige chloroauric zuur aan de reactie flacon en breng de pH terug naar 12.
- Roer het reactiemengsel gedurende 2 uur.
Opmerking: De oplossing moet evolueren naar een bruine kleur.
4. synthese van [Cys34-capped-BSA]-Au(III)
- Los 2 mg N-ethylmaleimide (NEM) in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4).
- Los 2 mg BSA in 1 mL PBS-NEM oplossing.
- Breng de oplossing over in een flesje van 5 mL reactie en roer bij 20 ° C bij 500 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur.
- Dialyze de oplossing met behulp van de 12 kDa dialyse buis in 500 mL PBS, roeren 50 rpm met 's nachts te verwijderen spoorverontreiniging NEM een magneetroerder.
- Los chloroauric zuur in PBS tot een concentratie van 0,4 mM.
Opmerking: De oplossing kan een flauw geel. - De reactie-flacon overbrengen in een waterbad bij 37 ° C. Roer op 750 rpm.
- Onmiddellijk 1 mL zure oplossing van de chloroauric aan de flacon reactie toevoegen en laat mengen gedurende 2 minuten.
- Voeg 75 μL van 1 M NaOH aan de reactie flacon te brengen van de pH tot en met 12 en laat mengen gedurende 2 uur.
5. synthese van [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)
- Bereid een oplossing van 2 M ureum en 50 mM Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3, pH 8,0) in HPLC rang water.
- Los 3,3 mg BSA in 1 mL van de bovenstaande oplossing en overdracht aan een flesje van 5 mL reactie.
- Maken van een stamoplossing van 0,25 M tris(2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) door het oplossen van 62,5 mg TCEP in 1 mL HPLC water.
- De stockoplossing van TCEP aan de flacon reactie toevoegen totdat de uiteindelijke concentratie van de TCEP 8 mM is.
- Incubeer de oplossing in een waterbad gedurende 1 uur bij 50 ° C. Roer bij 500 omwentelingen per minuut met een magneetroerder.
- Laat de oplossing volledig afkoelen tot kamertemperatuur.
- Bereid een stamoplossing van 100 mM NEM door ontbinding van 12,5 mg NEM in 1 mL HPLC rang water.
- De stockoplossing van NEM aan de flacon reactie toevoegen totdat de uiteindelijke concentratie van NEM 16 mM is.
- Laat de oplossing te combineren voor 2 uur bij 20 ° C. Roer bij 500 omwentelingen per minuut.
- Dialyze de oplossing om met een 12 kDa dialyse buis, roeren de oplossing bij 50 rpm met een magneetroerder overnachting in 500 mL 50 mM NH4HCO3 te verwijderen van de overtollige TCEP NEM en ureum.
- De flacon reactie naar een waterbad bij 37 ° C en roer bij 750 rpm.
- Los chloroauric zuur in HPLC rang water tot een concentratie van 0,66 mM.
- Onmiddellijk 1 mL zure oplossing van de chloroauric aan de flacon reactie toevoegen en laat mengen gedurende 2 minuten.
- Voeg van 1 M NaOH totdat de pH van de oplossing 12 is en laat de oplossing te blijven meng gedurende 2 uur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Van de fluorescentie van het BSA-Au(III)-complex, men heeft opgemerkt dat de omzetting van de intrinsieke blauwe fluorescentie van BSA (λem = 400 nm) tot rode fluorescentie (λem = 640 nm) optreedt bij over pH 9,7 door een evenwicht overgang (Figuur 1). EEM van BSA-Au(III) op verschillende BSA Au molaire verhouding is afgebeeld in Figuur 2, en deze gegevens toont hoe wijzigen de molaire rati...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De verbindingen van de BSA-Au(III) bereid met een pH van 12 vertonen rode fluorescentie bij een golflengte van de emissie van λem= 640 nm wanneer opgewonden met ultraviolet (UV) licht λex= 365 nm (figuur 1A). De opkomst van rode fluorescentie is een langzaam proces en duurt een paar dagen bij kamertemperatuur te verhogen tot een maximale intensiteit. Uitvoeren van de reactie bij 37 ° C zal de optimale resultaten opleveren, hoewel hogere temperatuur kan worden g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
S.E. erkent de steun van hertog Endowment speciaal initiatief Fonds, Wells Fargo Fonds, PhRMA Foundation, evenals opstarten middelen van de Universiteit van North Carolina, Charlotte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
| goud (III) chloride trihydraat, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Koper (II) chloride dihydraat, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| Nikkel (II) chloride hexahydraat, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM), >99,0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
| Tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride (TCEP), >98,0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Natriumhydroxide, >98,0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Urea, 99,5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | Corning | MT21040CV | |
| Ammoniumbicarbonaat, 99,5% | Sigma-Aldrich | 9830 |
Referenties
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
- Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
- Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
- Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
- Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
- Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
- Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681(2007).
- Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
- Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).
- Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).
- Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
- Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
- Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
- Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).
- Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
- Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
- Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
- Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
- Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
- Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
- Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
- Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
- Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
- Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
- Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
