Methodenartikel

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

12.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58149

⸱

18 augustus 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

In dit artikel

Samenvatting

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Samenvatting

Bestuderen van de regulering van de efferocytosis vereist methoden die kunnen de opname van apoptotic cellen nauwkeurig te kwantificeren en sonde de signalering en cellulaire processen die efferocytosis zijn. Deze kwantificering kunnen moeilijk uit te voeren zoals apoptotic cellen vaak efferocytosed fragmentarisch zijn, aldus dwingt tot methoden die nauwkeurig af te tussen het efferocytosed-gedeelte van een doelwit van de apoptotic versus residuele unengulfed mobiele bakenen kunnen fragmenten. De aanpak hierin maakt gebruik van dual-labeling benaderingen om de dynamiek van efferocytosis en efferocytic capaciteit van efferocytes zoals macrofagen nauwkeurig te kwantificeren. Het cytosol van de apoptotic cel heet met een cel-tracking kleurstof aan controle van alle apoptotic cel-afgeleide materialen, terwijl de oppervlakte biotinylation van de cel van apoptotic zorgt voor differentiatie tussen verinnerlijkte en niet-geïnternaliseerd inschakelen de fracties van de cel van de apoptotic. De capaciteit van de efferocytic van efferocytes wordt bepaald door de fluorescerende opnamen van live of vaste cellen en kwantificeren van het bedrag van de afhankelijke versus verinnerlijkte doelen, zoals onderscheiden door daar kleuring. Deze benadering biedt verschillende voordelen ten opzichte van methoden zoals stroom cytometry, namelijk de nauwkeurige afbakening van niet-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cel breuken, de mogelijkheid voor het meten van efferocytic dynamiek door live-cel microscopie, en de capaciteit voor het uitvoeren van studies van cellulaire signalering in cellen uiten fluorescently-label transgenen. Gecombineerde, dienen de methoden die worden beschreven in dit protocol als basis voor een flexibele experimentele aanpak die kan worden gebruikt om de activiteit van de efferocytic nauwkeurig te kwantificeren en te ondervragen van cellulaire signaalroutes actief tijdens efferocytosis.

Inleiding

Apoptosis of geprogrammeerde celdood, is een sterk gereguleerd fysiologische proces dat voorkomt in de meeste meercellige organismen en is van cruciaal belang voor hun ontwikkeling en homeostase1. Naast betrokkenheid bij normale cel omzet en embryonale ontwikkeling, apoptosis kan de verwijdering van geïnfecteerde of beschadigde cellen van weefsels en kan worden geactiveerd in reactie op de infectie, ontsteking, kanker, en ook door medische ingrepen zoals radiotherapie of steroïden1. Apoptotic cellen bloot "eten-me" signalen op hun celoppervlak die worden herkend door receptoren op een scala aan professionele en niet-professionele fagocyten, gezamenlijk aangeduid als "efferocytes". Betrokkenheid van deze receptoren induceert de opname en afbraak van de apoptotic cel door de efferocyte door middel van een proces dat bekend staat als efferocytosis2,3. Fosfatidylserine is het beste gekarakteriseerd eten-me signaal drijvende efferocytosis. Het is normaliter beperkt tot de innerlijke bijsluiter van het plasma-membraan, met een lipide-scramblase die dit membraan asymmetrie verstoort, dus bloot fosfatidylserine op de oppervlakte van cel4activeren apoptosis. Fosfatidylserine is te vinden op het extracellulaire oppervlak van sommige niet-apoptotic cellen, zoals volwassen macrofagen en bloedplaatjes geactiveerd. Deze cellen zijn echter niet efferocytosed als gevolg van de aanwezigheid van "don't eat me" signalen, zoals CD47, op hun cel oppervlakte5,6,7. Blootgestelde fosfatidylserine wordt herkend door een matrix van efferocytic receptoren uitgedrukt door efferocytes. Binden van deze receptoren aan fosfatidylserine, activeert ofwel rechtstreeks ofwel via de hulp van opsonins, signaalroutes ter bevordering van de engulfment van de apoptotic cel in een membraan-gebonden vacuole genoemd de efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. de efferosome zekeringen opeenvolgend met Endosomen en lysosomes, die de moleculaire machines nodig breng het efferosome te leveren te degraderen de apoptotic cellen lading13,14. Zodra gedegradeerd, de apoptotic cel-afgeleide materialen worden verhandeld aan de recycling endosome — een proces die grenzen immuunresponsen aan apoptotic cel-afgeleide antigenen, en die kunnen toestaan voor de terugwinning van voedingsstoffen uit de apoptotic cellen13, 15. Een storing in efferocytosis resulteert in verminderde Goedkeuringvande apoptotic cellen; Deze onontgonnen cellen ondergaan uiteindelijk secundaire necrose. Necrotische cellen introductie pro-inflammatoire cytosolische inhoud, pathogenen en autoantigens in de extracellulaire milieu, dus een drivingrange van besmettelijke, inflammatoire en auto-immune ziekten16,17. Samen, apoptosis en efferocytosis de opheffing vergemakkelijkt van de stervende en dode cellen en zorgen voor het onderhoud van de weefsel homeostase.

Onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de efferocytosis vereist methoden waarmee een duidelijke kwantificering van apoptotic cellen opname. Deze kwantificering wordt bemoeilijkt door het feit dat in tegenstelling tot andere opname mechanismen zoals endocytose en fagocytose18,19, efferocytosis niet leiden de engulfment van intact doelcel tot kunnen, resulterend in de versnipperde opname van de apoptotic cel door de efferocyte20. Het protocol hierin beschreven beschrijft een in vitro efferocytosis bepaling waarmee nauwkeurige afbakening van de verinnerlijkte versus niet-geïnternaliseerd gedeelten van individuele apoptotic cellen en kan gecombineerd worden met een aantal vaste-cel en Live-cel microscopie benaderingen. Traditionele fagocytose assays toevoegen antilichamen die specifiek zijn voor de fagocytische doelgroep op het einde van het experiment om het label niet-geïnternaliseerd doelen, waar als onze methode verschilt door etikettering van het doel van de apoptotic met biotine covalent alternerende21 , 22. terwijl apoptotic cel specifieke antilichamen kunnen worden gebruikt in deze test, de biotinylation aanpak zorgt voor geen eiwithoudende doelstelling worden gelabeld en vermijdt potentiële problemen met secundair antilichaam Kruisallergie als immunokleuring wordt uitgevoerd . Specifiek, duidelijk naar voren komt de voorbereiding van apoptotic Jurkat cellen, die dual-gekleurd met zowel een cel bijhouden kleurstof en biotine zijn. De cel voor het bijhouden van kleurstof zorgt voor apoptotic cel-afgeleide materialen worden bijgehouden tijdens de efferocytosis, terwijl de oppervlakte biotinylation zorgt voor de discriminatie van geïnternaliseerd van niet-geïnternaliseerd delen van efferocytosed apoptotic cellen. Ook beschrijven we de cultuur en de voorbereiding van J774.2 en THP-1 cellijnen voor gebruik als lymfkliertest en menselijke efferocytes, monocyt-afgeleide M2 macrofagen als een voorbeeld van de primaire cel efferocytosis en Jurkat cellen voor gebruik als efferocytic doelen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op andere cellijnen of primaire cellen, doelcellen ondergaat elke vorm van celdood (bijvoorbeeld apoptosis, necrose en necroptosis) en micron-sized nabootsers die simuleren van apoptotic cellen via lipide coatings of coating met liganden specifieke aan een receptor efferocytic van belang.

De methode geschetst in dit protocol kent verschillende voordelen ten opzichte van de stroom cytometry gebaseerde methoden gewoonlijk worden gebruikt in het veld23,24. Door direct imaging de fagocytensysteem-apoptotic cel interactie, gecombineerd met duidelijke etikettering van beide totale en niet-geïnternaliseerd apoptotic cel materiaal, kunnen kwantitatieve metingen van efferocytosis worden gemaakt. Bovendien beperkt het gebruik van pH-ongevoelig fluorophores storende factoren zoals de onderdrukking van FITC en GFP fluorescentie bij lysosomale pH dat kunstdiscours sommige alternatieve methoden25. Tot slot, terwijl niet in detail beschreven, deze methoden kunnen worden ingezet met behulp van uiten van fluorescently-label transgenen, efferocytes of met na fixatie immunokleuring, met het oog op kwantificering van de activiteit van de molecule signalering en monitoring van de cellulaire processen tijdens efferocytosis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Collectie van bloed van gezonde vrijwilligers werd goedgekeurd door de Health Science onderzoek Ethics Board van de University of Western Ontario. Venapunctie werd uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de Tri-Raad-beleidsverklaring inzake menselijke onderzoek.

1. cultuur en voorbereiding van de THP-1 monocyt cellijn

  1. Cultuur THP-1 monocyten als een schorsing cultuur in T25 kolven op 37 ° C + 5% CO2. Cellen moeten worden gekweekt in 5 mL Roswell Park Memorial Instituut 1640 (RPMI 1640) + 10% foetale runderserum (FBS).
  2. Elke dag onderbreken cellen gelijkmatig over de media van de groei door zachtjes schudden de kolf dan tellen onmiddellijk cellen met een hemocytometer. Cellen moeten worden gepasseerd zodra celdichtheid 1 x 106 cellen/mL bereikt:
    1. Vooraf warm RPMI 1640 + 10% FBS in een waterbad 37 ° C.
    2. 2 x 105 cellen in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL of een conische tube van 15 mL en pellet cellen overbrengen door centrifugatie bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet en resuspendeer de pellet in 1 mL (1,5 mL microcentrifuge buis) of 5 mL (conische tube van 15 mL)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Centrifugeer de buis bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. verwijderen de PBS zonder verstoring van de cel-pellet.
    5. Resuspendeer pellet in 1 mL verse RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. Voeg de geresuspendeerde cellen uit 1.2.5 naar een nieuwe T25 kolf plek 4 mL verwarmde media, en daartoe. Cultuur in een 37 ° C + 5% CO2 incubator totdat de cellen vereisen passaging (meestal 3 dagen) of cellen zijn vereist voor een experiment.
  3. Voor een experiment met THP-1-afgeleide macrofagen, het vereiste aantal cellen uit de kolf en de plaat voorafgaand aan passaging te verwijderen:
    1. Plaats van het vereiste aantal 18 mm ronde glazen coverslips (#1.5 dikte) in de putjes van de plaat van een 12-well — meestal 1 dekglaasje aan per voorwaarde en/of timepoint. Nou in elk aliquot 5 x 104 THP-1 monocyten. Het aantal cellen toegevoegd aan elk putje kan worden gewijzigd, indien nodig.
    2. Opvoeden van het totale volume van elke cel-bevattende goed tot 1 mL met behulp van RPMI + 10% FBS opgewarmd tot 37 ° C.
    3. Voeg 100 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) aan elk putje en cultuur voor 3 dagen voor het opwekken van differentiatie van THP-1 monocyten in macrofaag-achtige cellen.

2. cultuur en voorbereiding van de J774.2 Macrophage cellijn

  1. Cultuur J774.2 cellen in T25 kolven op 37 ° C + 5% CO2. Cellen moeten worden gekweekt in 5 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS en zodra de cultuur 80-90% confluentie tot gepasseerd. Passage cellen:
    1. Verwijder alle media van de kolf en de opkomst eenmaal met 5 mL PBS.
    2. PBS uit de kolf Verwijder en vervang door 5 mL van de verse DMEM + 10% FBS.
    3. Met behulp van een cel schraper, schraap de onderkant van de kolf op te schorten de cellen in de media. Krachtig Pipetteer de cellen meerdere malen te breken van elke cel aggregaten.
    4. Verdun cellen 1:5 door verwijderen van 4 mL van de celsuspensie van de kolf en te vervangen met 4 mL verse media. De resterende celsuspensie kan worden genegeerd, gebruikt voor het starten van een nieuwe cultuur van de cel in een verse T25 kolf of gebruikt voor een experiment.
  2. Instellen voor een efferocytosis assay cuvetten van J774.2:
    1. Een dag vóór de aanvang van het experiment, schorten J774.2 cellen in 5 mL verse media, volgens stappen 2.1.1–2.1.3. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en voorbereiding van de noodzakelijke hoeveelheid cellen bij een concentratie van 5 x 104 cellen/mL.
    2. Het benodigde aantal 18 mm ronde glazen coverslips (#1.5 dikte) plaats in de putjes van de plaat van een 12-well. Nou in elk aliquot 1 mL van de 5 x 104 cellen/mL celsuspensie.
    3. Cultuur overnachting zodat de cellen zich houden aan het dekglaasje aan en herstellen van passaging.

3. cultuur van de primaire mens M2 macrofagen

  1. Het verzamelen van 10 mL EDTA bloed voor elke 12-well plaat van M2 macrofagen vereist.
  2. Laag in een centrifugebuis 15 mL, 5 mL bloed op de top van 5 mL voorverwarmde Lympholyte-poly cel scheiding voedingsbodem. Bereiden van meerdere buizen als verwerking > 5 mL bloed in plaats van met behulp van grotere volume buizen.
  3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 35 minuten, met gemiddelde versnelling en geen pauze.
  4. Verwijder voorzichtig de bovenste mononucleaire cellen rijke band met behulp van een plastic pipet en overdracht aan een tube van 50 mL centrifuge. Als meerdere buizen werden voorbereid in stap 3.2, kunnen de bands worden samengevoegd in een enkele 50 mL-buis. Volume van de buis te brengen tot 50 mL met PBS.
  5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 8 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Tijdens deze stap gesteriliseerde met autoclaaf 18 mm diameter circulaire coverslips (#1.5 dikte) in elk putje van de plaat van een 12-well te plaatsen.
  6. Resuspendeer de pellet cel in 300 µL van de serum-vrije RPMI 1640 per gewenste aantal putten; bijvoorbeeld als 10 mL bloed werd verwerkt ter voorbereiding van een volledige 12 goed plaat, schorten cel pellet in 3,6 mL media.
  7. Voeg 300 µL van de celsuspensie naar elke dekglaasje aan-bevattende goed in de 12-well-plaat. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C + 5% CO2.
  8. Voorzichtig wassen dekglaasje aan 3 x met 1 mL verwarmde PBS niet-aanhanger cellen verwijderen.
  9. Voeg vervolgens 1 mL van RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL recombinante menselijke M-CSF + cel cultuur antibioticum/antimycotic. Incubeer bij 37 ° C + 5% CO2 gedurende 5 dagen.
  10. Media vervangen door RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL recombinante menselijke M-CSF + 10 ng/mL recombinante menselijke IL-4 + cel cultuur antibioticum/antimycotic. Incubeer bij 37 ° C + 5% CO2 voor 2 dagen in beslag M2 polarisatie.
  11. Gepolariseerde macrofagen moeten worden gebruikt binnen de komende 3 dagen.

4. bereiding van Jurkat van Apoptotic cellen

  1. Cultuur van de Jurkat cellen in 5 mL RPMI 1640 + 10% FBS bij 37 ° C + 5% CO2. Jurkats zijn een cellijn van schorsing en kan worden gehandhaafd door passaging van 1:5 in verse, voorverwarmde media elke 3-5 dagen.
  2. Ter voorbereiding van apoptotic cellen, kunt u de Jurkat-cultuur te groeien met hoge dichtheid (4 – 5 dagen na de passaging). Aliquot 1,5 mL in een 1,5 mL microcentrifuge buis en pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min.
  3. Verwijder supernatant en resuspendeer cel pellet in 1 mL serumvrij RPMI 1640 medium dat 1 µM staurosporine.
  4. Incubeer 16 h bij 37 ° C + 5% CO2 te renderen van apoptotic cellen.
  5. Indien gewenst, inductie van apoptosis bevestigen door kleuring met Annexine V:
    1. Aliquot 100 µL Jurkat celkweek staurosporine-behandeld in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min, verwijder supernatant en resuspendeer de pellet cel in 100 µL van serumvrij RPMI 1640 medium.
    2. Voeg 1 µL van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd Annexine V en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    3. Voeg 900 µL van PBS en overdracht van het gehele volume aan een enkel putje van een 12-well-plaat met een dekglaasje aan van 18 mm, circulaire glas (#1.5 dikte). Spin naar beneden in een centrifuge uitgerust met een adapter plaat bij 200 x g gedurende 1 minuut te dwingen cellen zich te houden aan het dekglaasje aan. U kunt ook kunnen cellen worden geplaatst in een chambered dia voor imaging.
    4. Beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop.

5. kwantificeren van de opname van de Efferocytic en dynamiek met behulp van een vaste cel Efferocytosis Assay en binnenstebuiten kleuring

  1. THP-1, J774.2 of M2 menselijke macrofagen bereiden zoals beschreven in de secties 1-3, respectievelijk.
  2. De avond vóór de aanvang van het experiment bereiden apoptotic cellen van de Jurkat zoals beschreven in sectie 4.
  3. Onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, apoptotic cellen met behulp van een hemocytometer te tellen. Breng voldoende aantallen apoptotic cellen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge – we meestal toevoegen 5 x 10,5 cellen/well, bieden een doel: efferocyte verhouding van 10:1.
  4. Pellet Jurkat cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min en resuspendeer in 500 μL van PBS.
  5. Tijdens het centrifugeren, aliquoot 10 µL van DMSO in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis. Los in de DMSO een minimale hoeveelheid N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotine). 5-10 kristallen (~0.005 mg) is voldoende.
  6. Breng de 500 μL apoptotic cellen/PBS de DMSO/NHS-Biotine met buis. Dan Verdun een cel bijhouden van kleurstof bij de aanbevolen concentratie van de fabrikant in de apoptotic celsuspensie. Zorg ervoor om te selecteren van een cel bijhouden kleurstof die niet overlapt spectraal met FITC-streptavidine (bijvoorbeeld rood of far-red cel bijhouden kleurstof).
  7. Incubeer schorsing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een gelijk volume RPMI 1640 + 10% FBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker om quench elke spoorverontreiniging kleurstof.
  8. Pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min, verwijder supernatant en resuspendeer de gebeitst apoptotic cellen in 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS per putje van macrofagen.
  9. Voeg 100 µL celsuspensie van gebeitst apoptotic ontkleuring aan elk putje van de macrofagen. Centrifugeer 200 x g gedurende 1 min. in een centrifuge uitgerust met een adapter plaat te dwingen contact tussen macrofagen en apoptotic cellen.
  10. Incubeer plaat voor de gewenste periode op 37 ° C + 5% CO2 in een incubator weefselkweek. Voor macrofagen, efferocytosed materiaal is meestal eerste detecteerbare na 20-30 min, en na 120-180 min is voltooid.
  11. Op het gewenste tijdstip wordt in punt cellen verwijderen uit de incubator. Wassen cellen tweemaal met 1 mL van de kamertemperatuur PBS te stoppen efferocytosis en niet-efferocytosed apoptotic cellen verwijderen.
  12. Voeg FITC-geconjugeerd streptavidine bij een verdunning 1:1,000 aan elk putje en incubeer gedurende 20 min in het donker. Dit zal het label van de blootgestelde Biotine op niet-efferocytosed apoptotic cel materiaal.
    Opmerking: Indien gewenst, celkernen kunnen worden gekleurd tijdens deze stap door toevoeging van 1:20,000 verdunning van Hoechst 33342 of 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI).
  13. Wassen cellen 3 keer met 1 mL PBS, zachtjes schudden of het schommelen van de monsters voor 5 min per spoeling. Fix cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen een keer met PBS te verwijderen overtollige PFA.
  14. Mount coverslips op een dia voor beeldbewerking en overdracht aan een fluorescentie Microscoop. Z-stacks van een voldoende aantal cellen voor nauwkeurige kwantificering vangen — meestal 10 – 30 cellen per voorwaarde. Non-geïnternaliseerd apoptotic cel materiaal zal blijken in de resulterende afbeelding als cel kleurstof label materiaal gehuld door FITC-streptavidine kleuring, terwijl efferocytosed materiaal vormt een aparte cel bijhouden kleurstof puncta gratis een streptavidine bijhouden kleuring.
  15. Kwantificeren van efferocytosis in de resulterende afbeeldingen via een verscheidenheid van maatregelen:
    1. Berekening van de efferocytic-index door bepaling van het gemiddelde aantal discrete efferosomes (cel bijhouden kleurstof+/streptavidin- puncta) per macrofaag. Alleen de macrofagen ≥1 zichtbaar efferosomes die geheel of gebonden aan een apoptotic cellen te kwantificeren. Record macrofagen gebonden aan een apoptotic cellen, maar ontbreekt discrete efferosomes, als een efferocytic-index van 0.
    2. Berekenen efferocytic-efficiëntie door het meten van de Fractie van de macrofagen die ≥1 efferosome bevatten.
    3. Bereken het percentage van efferocytosis door imaging cellen vast en gekleurd op meerdere tijdstippen. Enige afbeelding macrofagen verbonden met apoptotic cellen, of van elke cel waarin zichtbaar efferosomes, met z-stacks gevangen. Zodra de image is gemaakt, bepaalt het tarief van efferocytosis:
      1. Met behulp van de kleuring van de daar als een gids, en het gereedschap freehand of veelhoek in FIJI/ImageJ26 (of andere afbeelding analyse softwarepakket), alle van de cel voor het bijhouden van kleurstof+/streptavidin- (bijvoorbeeld geïnternaliseerd) cirkel materiaal in een enkel vliegtuig van de z-stack. Het meten van de geïntegreerde intensiteit van de cel voor het bijhouden van kleurstof deze regio. Individuele maatregelen voor elke efferosome (bijv . diameter, positionering ten opzichte van de rand van een cel of nucleus, etc.)15,27 kunnen gemakkelijk worden verworven gelijktijdig met deze metingen, sterk verhoging van de gegevens verzameld tijdens de analyse.
      2. Op dezelfde z-sectie, alle van de cel kleurstof+/streptavidin+ (bijvoorbeeld niet-geïnternaliseerd) bijhouden met behulp van de streptavidine als een gids en het gereedschap freehand of veelhoek kleuring cirkel materiaal in een enkel vliegtuig van de z-stack . Alleen omvatten kleuring van apoptotic cellen in contact met de fagocytensysteem. Het meten van de geïntegreerde intensiteit van deze regio.
      3. Herhaal stap 4.2.3.1 aan 4.2.3.2 voor de resterende z-delen van de afbeelding. Som van de geïntegreerde intensiteit van de efferocytosed (ΣEVF) en niet-efferocytosed (Σne) materialen. De Fractie van de apoptotic-cel die is geweest efferocytosed kan worden berekend voor de cel als:
        figure-protocol-1
      4. De Fractie efferocytosed voor alle cellen op alle tijdstippen te kwantificeren. Merk op dat de fluorescerende intensiteit van apoptotic cellen/efferosomes kan variëren tussen beelden als gevolg van de variaties in de opname van cel kleurstoffen tracking door individuele apoptotic cellen, en als gevolg van veranderingen in de afbeelding overname parameters zoals belichtingstijd. Als zodanig enige vergelijk genormaliseerde waarden zoals de Fractie Efferocytosed of intensiteit-onafhankelijke waarden zoals efferocytic index en efficiëntie van de efferocytic, tussen beelden, tussen experimentele omstandigheden, en tussen herhalen experimenten.
    4. Om ervoor te zorgen dat de resulterende dataset komt nauwkeurig overeen met de variatie in efferocytosis tussen cellen, voeren deze analyses op het maximum aantal cellen mogelijk in elk experiment.
      Opmerking: Efferocytic-efficiëntie en de efferocytic-index kan snel worden berekend (een paar seconden/cel), en meestal willen we analyseren van ten minste 100 cellen per experiment, elk experiment ten minste 3 keer herhalen. Berekening van de Fractie van efferocytosed materiaal, en efferosome-specifieke maatregelen zijn meer moeizaam, nemen meestal 2-3 min/cel voor een ervaren analist. Voor deze berekeningen kwantificeren we een minimum van 15 cellen per voorwaarde per experiment.
    5. Record efferocytic index, breuk efferocytosed en individuele efferosome gegevens op basis van de per-cel.
      Opmerking: Dit zorgt voor data-analyse met behulp van eencellige benaderingen, waardoor Inter cel variaties worden gekwantificeerd. Populatieniveau analyses kunnen nog steeds worden uitgevoerd op deze datasets door gemiddeld eencellige gegevens verworven in persoonlijke experimenten. Efferosome-specifieke metingen kunnen worden geanalyseerd op het bevolkingsniveau, eencellige niveau, en als ensembles (bijvoorbeeld als de bevolking van efferosomes onafhankelijk van de cellen met hen)15.

6. levende cel Efferocytosis Assay met behulp van Apoptotic cellen

  1. THP-1, J774.2 of M2 macrofagen bereiden zoals beschreven in stappen 1-3, respectievelijk. Indien nodig, de cellen moeten zijn transfected met transgenen of andere genetische construeert ten minste 18 h voordat u alle experimenten uitvoert.
  2. De avond vóór de aanvang van het experiment, bereiden apoptotic cellen van de Jurkat als beschreven in afdelingen 4 en 5 met de volgende wijzigingen:
    1. Verdun cellen en induceren van apoptose per 4.1-4.3, en verzamelen van het vereiste aantal apoptotic cellen per 5.3-5.4.
    2. Een cel bijhouden kleurstof bij de aanbevolen concentratie van de fabrikant van de celsuspensie apoptotic toevoegen. Incubeer schorsing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg een gelijk volume RPMI 1640 + 10% FBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker om quench elke spoorverontreiniging kleurstof. Voeg geen NHS-Biotine voor deze experimenten.
    3. Pellet cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 min, verwijder supernatant en resuspendeer gebeitst apoptotic cellen in 100 µL RPMI 1640 + 10% FBS per putje van macrofagen.
  3. Indien nodig, label de macrofagen door verwijderen van voedingsbodems van elk putje en het toevoegen van 500 µL van PBS met de fabrikanten Aanbevolen verdunning van een cel bijhouden kleurstof die niet spectraal overlapt met de cel bijhouden kleurstof toegevoegd aan de apoptotic cellen of een fluorescerende transgenen uitgedrukt door de macrofagen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker, dan Voeg een gelijk volume DMEM + 10% FBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker om quench elke spoorverontreiniging kleurstof.
  4. De macrofaag-bevattende dekglaasje aan overbrengen in een kamer Leiden. Voeg 400 µL van DMEM + 10% FBS, gevolgd door 100 µL celsuspensie van de gelabelde apoptotic. Meng door zachtjes pipetteren media 2-3 keer.
  5. De kamer Leiden overbrengen in een verwarmde en CO2-geperfundeerd kamer van een levende cel fluorescente microscoop.
    Opmerking: Voor Microscoop opstellingen die ontbreken van CO2 perfusie mogelijkheden, gebruik weefsel kweekmedium gebufferd met 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) in plaats van natriumbicarbonaat om fysiologische pH terwijl de cultuur is blootgesteld aan lucht.
  6. Vastleggen van een time-lapse serie met de afbeelding van een wit licht (fase contrast of DIC) en beelden van alle fluorescerende etiketten:
    1. Gebruik een 100 X-objectief voor experimenten waar oplossen van fijne details is vereist (bijvoorbeeld membraan dynamiek van fagocytensysteem-apoptotic cel interacties). Ondertussen, meer algemene maatregelen (tarief van apoptotic cellen opname, tijd van de interactie tussen de macrofagen en de apoptotic cellen, etc.) zijn beste beeld met behulp van een 60 X of 63 X doelstelling.
    2. Indien beschikbaar, gebruik punt-een bezoek aan het beeld van meerdere velden-of-view tijdens een enkele verwerving, waardoor het aantal efferocytic-gebeurtenissen vastgelegd in een enkele experiment
    3. Omdat efferocytes vaak kleine fragmenten van apoptotic cellen, in plaats van onbeschadigde cellen verzwelgen, is het beter om te vangen z-stacks. Vangen om te minimaliseren fototoxiciteit, z-delen gescheiden door de focal diepte van uw doelstelling microscopen (meestal 0.5 – 1.0 µm), door de dikte van de cel (meestal 8-10 µm voor macrofagen, bijvoorbeeld 8 – 20 segmenten/cel). Dit zorgt ervoor dat alle engulfment en mensenhandel gebeurtenissen zichtbaar zijn in ten minste één z-vlak zullen. Anderzijds gebruiken grote (1-5 µm diameter) apoptotic cel nabootsers of apoptotic cellen die minimale fragmentatie tijdens efferocytosis ondergaan (bijvoorbeeld warmte geschokt neutrofielen) in plaats daarvan zonder z-stapelen. Wij hebben de voorbereiding van zowel de Nabootsers en de apoptotic neutrofielen beschreven eerder28.
    4. Gebruik helder fluorophores en vangen te minimaliseren photobleaching beelden met overname-instellingen die photobleaching minimaliseren — bijvoorbeeld lage-intensiteit excitatie gecombineerd met hoge camera winst en kortstondige blootstelling tijden29. Wij raden met behulp van een microscoop voorzien van een hoog-gevoeligheids elektromagnetische charge - coupled apparaat (EM-CCD) camera of spinnen-schijf confocale en een high-speed piëzo-elektrische mechanische stadium, voor deze vorm van beeldvorming.
  7. Het aantal mogelijke analysemethoden die kunnen worden toegepast op deze time-lapse video's is uitgebreid en buiten ons vermogen om de recensie hier. Als enkele voorbeelden, gebruik handmatige of automatische tracking software te volgen de kernfusie, kernsplijting en verkeer van efferosomes binnen cellen15, kwantificeren efferosome fusion dynamiek met endolysosomes door colocalization analyse in macrofagen uitdrukken compartiment-specifieke fluorescerende transgenen13, monitor opname processen zoals indringende en cup vorming30, bepalen de dynamiek van de werving van signalering en eiwitten voor de efferosome13, mensenhandel en/of de afbraakroutes activiteit van efferosomes met behulp van apoptotic cellen aangeduid met pH-gevoelige, oxidant-gevoelige en protease-geactiveerde fluorophores31te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

'S nachts cultuur van Jurkat cellen met 1 µM staurosporine resultaten in apoptosis van > 95% van de cellen, die kunnen worden bevestigd met Annexine V kleuring (Figuur 1). Andere celtypes kunnen worden gebruikt voor deze experimenten, hoewel de concentratie van staurosporine en de duur van de behandeling van de staurosporine zal moeten worden geoptimaliseerd voor elke regel van de cel. Voor betrouwbare detectie en kwantificering van efferocytosis, > 80% van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De methoden die worden beschreven in dit protocol inschakelen beeldvorming en kwantificering van het proces van dynamische efferocytic, met behulp van zowel vaste-cel en live-cel benaderingen. Deze benaderingen bieden verscheidene voordelen over algemeen werknemer stroom cytometry gebaseerde methoden23,24. Het gebruik van binnenstebuiten kleuring met vaste monsters biedt een meer robuuste en nauwkeurige kwantificering van het tarief en de omvang van efferocytosis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) operationele subsidie MOP-123419, natuurwetenschappen en Engineering onderzoek Raad van Canada Discovery Grant 418194, en een Ontario ministerie van onderzoek en innovatie vroege Research Award aan BH. DGW bijgedragen enkele van de beelden gepresenteerd, de optimalisatie van de protocollen en het schrijven van het manuscript; Hij werd gefinancierd door een subsidie van de pomp-priming van de Universiteit van Liverpool. CY wordt gefinancierd door een Vanier Graduate beurs en CIHR MD/PhD studententijd. De financieringsinstanties had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMI 1640 MediaWisent3500-000-EL
DMEM MediaWisent319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)Wisent080-150
PBSWisent311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thicknessElectron Microscopy Sciences72290-08Grootte en vorm van dekglas is niet kritisch, maar 18 mm past in de putjes van een standaard 12-well plate wat celkweek vereenvoudigt
StaurosporineCayman Chemical81590Los op in DMSO bij 1 mM (1.000x stockoplossing)
Annexin V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217Bewaar in een exsicatuur. Maak geen stockoplossing.
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Lympholyte-poly cel scheidingsmediumCedarlane LabsCL5071
Recombinant Human M-CSFPeprotech200-04
Recombinant Human IL-4Peprotech300-25
J774.2 Macrophage Cell LineSigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell LineATCCTIB-202
Jurkat T Cell LineATCCTIB-152

Referenties

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529(2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863(1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884(2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004(2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964(2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kwantificering van efferocytoseopname van apoptotische cellendual labelingmethodeceltrackingskleurstofoppervlaktebiotinyleringstreptavidinekleuringlive cell microscopiefluorescerende reportergenenz stackanalyse

Gerelateerde artikelen