Methodenartikel

Kwantificeren van de Plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud, met behulp van maïs (Zea mays) als een Exemplar

19K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58164

⸱

6 augustus 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

De protocollen die hierin worden beschreven zorgen voor een heldere en toegankelijke methode voor het meten van oplosbare eiwitten en verteerbare (niet-structurele) koolhydraatgehalte in plantaardige weefsels. De mogelijkheid om te kwantificeren van deze twee plant macronutriënten heeft aanzienlijke gevolgen voor het bevorderen van het gebied van plantenfysiologie, nutritionele ecologie, plant-herbivoor interacties en voedselweb ecologie.

Samenvatting

Elementaire gegevens worden vaak gebruikt om te concluderen van kwaliteit van de plant als een hulpbron voor herbivoren. Echter, de alomtegenwoordigheid van koolstof in biomoleculen, de aanwezigheid van stikstof bevattende defensieve plantenstoffen en variatie in soortspecifieke correlaties tussen stikstof en plant eiwitgehalte alle beperken de nauwkeurigheid van deze gevolgtrekkingen. Daarnaast onderzoek gericht op de plant en/of herbivoor fysiologie vereisen een niveau van nauwkeurigheid dat gebeurt niet door middel van correlaties veralgemeend. De hier gepresenteerde methoden bieden onderzoekers een duidelijke en snelle protocol voor eiwithoudende gewassen oplosbaar en verteerbare koolhydraten, de twee plant macronutriënten meest nauw verbonden met de prestaties van de dieren fysiologische rechtstreeks te meten. De protocollen combineren goed gekarakteriseerd colorimetrische testen met geoptimaliseerde plant-specifieke spijsvertering stappen om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te leveren. Onze analyses van verschillende weefsels tonen aan dat deze testen de gevoeligheid hebben voor variatie in detecteren suikermaïs planten oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud over meerdere ruimtelijke schalen. Deze verschillen tussen-plant toe te voegen in het groeiende regio's en plantensoorten of rassen, evenals binnen-plant verschillen in weefseltype en zelfs positioneel binnen de dezelfde weefsel. Oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten inhoud combineren met elementaire gegevens heeft ook het potentieel te bieden van nieuwe kansen in plantenbiologie aansluiten minerale voeding van planten met plant-fysiologische processen. Deze analyses ook helpen bij het genereren van de oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten gegevens die nodig zijn voor het bestuderen van voeding ecologie, plant-herbivoor interacties en voedselweb dynamiek, die op zijn beurt fysiologie en ecologisch onderzoek zal versterken.

Inleiding

Plantaardige biomassa vormt de basis van vrijwel alle terrestrische levensmiddelen-webs. Planten verwerven nutritionele elementen uit de grond via hun wortels systemen en gebruik maken van zonlicht in hun naalden weefsels voor het synthetiseren van biomoleculen. In het bijzonder koolstof en stikstof worden gebruikt voor het maken van koolhydraten, eiwitten (samengesteld uit aminozuren), en lipiden die nodig zijn om te bouwen plantaardige biomassa (hierbij moet worden opgemerkt dat in fysiologie plant, die de term "macronutriënten" vaak naar bodem elementen, zoals N verwijst, P, K en S, echter in heel dit papier deze term zal verwijzen naar biomoleculen, zoals eiwitten, koolhydraten en vetten). Als herbivoren plantmateriaal verbruiken, zijn de macronutriënten vervat in plantaardige weefsels opgesplitst in de samenstellende delen en vervolgens gebruikt om te rijden de fysiologische processen van de consument. Op deze manier hebben plant macronutriënten een sterke invloed op de consument fysiologie samen met belangrijke gevolgen voor hogere orde ecologische interacties en voedselweb dynamiek.

In het dierenrijk zijn oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten de macronutriënten meest nauw verbonden is met overleving, reproductie en prestaties1. De meerderheid van dieren regelen bovendien actief hun inname van deze twee macronutriënten aan hun fysiologische eisen1,2. Dit geldt met name voor insect planteneters die detecteren van de concentraties van suikers en aminozuren in plantaardige weefsels, die op zijn beurt voeding gedrag leidt. Dientengevolge, plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud heeft een sterke rol gespeeld in de evolutie van plant-insect interacties.

Hoewel gegevens over oplosbare plantaardige eiwitten en gehalte aan verteerbare koolhydraten relatief zeldzaam zijn (maar Zie6,7,8,9,10,11), is er een overwicht van beschikbare gegevens over plant elemental inhoud (koolstof, stikstof en fosfor). Grotendeels immers elementen spelen een hoofdrol in de plant minerale voeding3,4,5. Wanneer elementen worden gemeten, correlaties zijn gebruikt om de hoeveelheid oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten extrapoleren, maar nauwkeurige berekeningen zijn vaak moeilijk te verkrijgen. Bijvoorbeeld, is het onmogelijk om te gebruiken koolstof als een indicator van het gehalte aan plantaardige verteerbare koolhydraten omdat koolstof overal aanwezig in alle organische stoffen is. Een sterkere relatie bestaat tussen elementaire stikstof en plant oplosbaar eiwitgehalte en gegeneraliseerde stikstof-naar-eiwit omrekeningsfactoren worden vaak gebruikt. Echter, er zijn sterke aanwijzingen dat stikstof-naar-eiwit conversies zeer soortspecifieke12,13,14,15 zijn, waardoor het gebruik van veralgemeende omschakeling waarschijnlijk onjuist. Vanwege dit, stikstof-naar-eiwit conversiefactoren vaak geen precisie, met name in de mate die nodig is voor voeding studies over herbivoren. Ook de aanwezigheid van N-bevattende plant allelochemische stoffen, zoals alkaloïden en glucosinolaten die vaak giftig voor herbivoren zijn, kan het verwarren van deze conversies.

Hier bieden we twee chemische testen voor het meten van de concentratie voor oplosbare eiwitten en verteerbare koolhydraten in plantaardige weefsels. Deze testen afzonderlijk worden gepresenteerd, maar er wordt voorgesteld dat zij worden gelijktijdig worden gebruikt voor het analyseren van de dezelfde plant monsters met het oog op een meer uitgebreide analyse van plantaardige macronutriënten. Beide vergelijkbaar methodologieën, bestaande uit een extractie stap, gevolgd door kwantificering via absorptie in dienst. Plant monster prep is ook identiek voor beide protocollen, zodat u gemakkelijk zowel analyse parallel lopen. Het nut van deze testen niet afkomstig zijn van hun nieuwheid, aangezien ze vertrouwen op oudere, (Bradford, Jones, Dubois) gevestigde colorimetrische assays16,17,18, maar hier organiseerden we hebben een duidelijke en gemakkelijk-aan-volgen Dit protocol deze methoden met meer obscure plant-specifieke extractie technieken-17,19 combineert de toepassing van deze tests meer om toegankelijk te maken voor degenen in de plant-relevante velden.

Voor beide tests, plant macronutriënten eerst fysiek uitgepakt door bevriezing, lyofilisering en slijpen van het plantmateriaal. Voor de oplosbaar eiwit assay, verder chemische extractie gebeurt17,,19 door verscheidene rondes van vortexing en verwarming monsters in NaOH oplossing. De bekende analyse van Bradford, gebruik makend van Coomassie briljant blauw G-250, wordt vervolgens gebruikt om te kwantificeren oplosbare eiwitten en polypeptiden tussen 3000-5000 Dalton16,17. Deze bepaling heeft een detectiebereik tussen 1-20 µg totale eiwitten per microplate goed of < 25 µg/mL, maar doet niet maatregel vrije aminozuren. De stap van de extractie van de verteerbare koolhydraten test is gebaseerd op de verdund zuur methode van Smith et al. 20 en zorgt voor de isolatie van oplosbare suikers, zetmeel, en fructosan – maar niet structurele koolhydraten. Een fenol-zwavelzuur zuur kwantificering methode is ontleend aan Dubois et al. 18 en de maatregelen van alle mono-, oligo-, en polysacchariden (evenals methyl derivaten). Deze test is kunnen kwantificeren van bepaalde suikers, maar hier gebruiken we het als een indicator van het gehalte aan totaal verteerbare koolhydraten (Smith et al. Zie 20 voor meer gedetailleerde analyse). Deze tests meten samen, de twee macronutriënten die sterk verbonden zijn plantenziekterisico eco-fysiologie en herbivoor prestaties, met belangrijke gegevens over de kwaliteit van de resource aan de basis van terrestrische levensmiddelen-webs. Presentatie van deze protocollen bevordert de generatie van plant macronutriënten datasets om een grondiger inzicht in plantenfysiologie, herbivoor voeding ecologie en plant-herbivoor interacties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. verzameling en verwerking van planten

  1. Verzamelen en verwerken van monsters van de plant
    1. Na het verzamelen van monsters van de plant, flash-freeze monsters door dompelen plantmateriaal in vloeibare stikstof met pincet en winkel bij-80 ° C. Als de plant monsters verzameld zijn te groot voor flash-freeze, snel afkoelen van de monsters met behulp van droogijs en overdracht naar een vriezer-80 ° C zo spoedig mogelijk. De inhoud van de macronutriënten van plantaardig materiaal kunt wijzigen nadat weefsels worden gescheiden van de plant, dus het is belangrijk om te bevriezen plant monsters zo spoedig mogelijk na het verzamelen.
      Let op: Vloeibare stikstof kan leiden tot ernstige bevriezing bij aanraking met de huid. Zorg ervoor dat het vervoer van vloeibare stikstof in goedgekeurde containers en juiste PPE Draag tijdens het hanteren ervan, met inbegrip van cryo-handschoenen, oog googles gelaatsscherm, schort en een laboratoriumjas.
    2. Lyophilize plantaardige materiaal met behulp van een freeze-droger om ervoor te zorgen dat de weefsels metabolisch inactief, zijn terwijl water wordt verwijderd. Droog tot de massa van het monster stabiliseert om ervoor te zorgen dat al het water is verwijderd.
    3. Eenmaal monsters zijn droog, vermalen tot een fijn poeder met een molen of de molen. Tot analyse monsters worden opgeslagen in een desiccating kast.

2. oplosbaar eiwit Assay

  1. Bereiding van de monsters
    1. Weeg analysemonsters van elk weefsel, ongeveer 20 mg per stuk, in 1,5 mL polystyreen microcentrifuge buizen en label buizen. Deze monsters zal vervolgens worden hierna aangeduid als onbekende monsters. Opnemen de exacte massa van elk monster, terwijl deze informatie zal worden vereist voor het berekenen van het eiwit % oplosbaar in elk onbekend monster. Gebruik microcentrifuge buizen met vergrendeling deksels, zoals niet-vergrendeling deksels tijdens de daaropvolgende verwarming stap openen kunnen, wat resulteert in verlies van de monsteroplossing.
  2. Solubilize en isoleren van onbekend monster eiwitten
    1. Met behulp van een micro-Pipet, voeg 500 µL van 0,1 M NaOH aan elke buis. Sluit deksels strak en bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten. Verwarm een hot water bad 90 ° C.
      Let op: Natronloog is een sterke base en brandwonden bij aanraking met de huid kan veroorzaken. Hoewel 0.1 M NaOH een lage concentratie vertegenwoordigt, Draag beschermende handschoenen Voorkom irritatie van de huid.
    2. Plaats buizen in een rek in het bad van warm water gedurende 15 minuten.
    3. Centrifugeer buizen bij 15.000 x g gedurende 10 minuten. Pipetteer de bovenstaande vloeistof in nieuwe gelabelde microcentrifuge buizen, met behulp van een nieuwe Pipet tip voor elk monster. Voeg 300 µL van 0,1 M NaOH aan de buis met de pellet en centrifuge weer op 15.000 x g gedurende 10 minuten. Nogmaals, de bovenstaande vloeistof verzamelen en combineren met de andere supernatant vloeistof uit hetzelfde monster. Dit is een potentieel stopplaats en monsters kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C's nachts indien nodig.
  3. Neerslag van plantaardige eiwitten
    1. Neutraliseren de pH van het supernatant oplossing door 11 µL van 5.8 M HCl. Bevestig een pH van 7 ~ door dompelen lakmoespapier in elke oplossing van het monster toe te voegen.
      Let op: Zoutzuur is een sterk bijtende zuur dat kan leiden tot brandwonden bij aanraking met de huid (huid toepassing of inhalatie). Gelieve te dragen handschoenen om te voorkomen dat de irritatie van de huid tijdens het verwerken van HCl.
    2. Voeg 90 µL van 100% Trichloorazijnzuur (TCA) aan elke buis en incubeer buizen op ijs gedurende 30 minuten. De neerslag van eiwitten verandert de oplossing van duidelijk tot ondoorzichtig. Als dit niet na 30 minuten gebeurt, koelen de buizen voor 1 uur. Dit is een potentieel stopplaats en monsters kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C's nachts indien nodig.
      Let op: Trichloorazijnzuur is corrosief. Gelieve Draag handschoenen bij hantering ter voorkoming van aanraking met de huid en inhalatie te voorkomen.
    3. Centrifugeer steekproeven bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig TCA bezinken door het suctioning met behulp van een vacuüm lijn gekoppeld aan een fijn glas micropipet tip (de dezelfde tip kan worden gebruikt in verschillende steekproeven). Niet storen de pellet eiwit door het vermijden van zware zuig en houden van de juiste afstand tussen het uiteinde van de pipet en de pellet.
    4. Wassen pellet snel met 100 µL van-20 ° C aceton. Deze stap verwijdert alle resterende TCA uit de pellet, die met de daaropvolgende analyse van Bradford interfereren kan; echter zal aceton beginnen met de eiwit-pellet ontbinden indien links contact te lang, zodat de aceton moet worden toegevoegd dan snel gewonnen uit de pellet binnen 5 seconden.
    5. Toestaan dat aceton te verdampen door het plaatsen van de buizen in een zuurkast of koelkast. Los vervolgens, de pellet eiwit door toevoeging van 1 mL 0,1 M NaOH aan elke buis. Volledig oplossen van de pellet kan vereisen verschillende rondes van verwarming in een warm water bad, vortexing en sonicating.
      Opmerking: Hoe langer de buizen zitten in de zuurkast of koelkast en de droger de pellets krijgen, des te moeilijker zal zij moeten opnieuw solubilize. Er wordt voorgesteld om de pellet gedurende 30 minuten drogen, en vervolgens controleren op de aanwezigheid van aceton elke 10-15 minuten totdat het is duidelijk dat de aceton is verdampt (geen aceton rook waarneembaar zijn).
  4. Meng standaardoplossingen, onbekend monsteroplossingen verdund en kwantificeren van het totale eiwitgehalte van de onbekende monsters met behulp van de analyse van Bradford.
    1. Bereiden boviene immunoglobuline G (IgG) standaard oplossingen volgens de concentraties die zijn vermeld in tabel 1 (gelyofiliseerde vorm of IgG stockoplossing kan worden gemengd met gedeïoniseerd water tot elke concentratie). Winkel normen bij 4 ° C. Voeg in een 96-wells-plaat, 160 µL van elke IgG-standaardoplossing in drievoudige gerekend vanaf de positie van de A1 van de goed plaat (0 µg/µL in A1, A2, A3 positie, 0,0125 µg/µL in B1, B2, B3 posities, enz.).
    2. Bereid een verdunde NaOH-oplossing door 50 µL van 0,1 M NaOH aan 950 µL van gedistilleerd water toe te voegen. Als een negatieve blancocontrole, voeg 60 µL van deze oplossing naar de goed plaat in drievoud (G1, G2, G3 posities).
    3. Maak verdunningen van onbekende monsters door toevoeging van 50 µL van elke oplossing van het monster aan 950 µL van gedistilleerd water in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis. Dan, voeg 60 µL van elk verdunde monster aan de goed plaat in drievoud, gerekend vanaf de positie die H1. Een 96-wells-plaat mag voor de analyse van 6 normen, 1 leeg en 25 onbekende monsters als in drievoud Lees. Elke goed plaat geanalyseerd moet eigen IgG standaard en lege monsters bevatten.
    4. Breng 100 µL van gedistilleerd water in alle putjes van de lege en onbekende monsters. Nu elk goed moet bevatten van een totaal van 160 µL. met behulp van een precisiepipet multi-kanaals (8 kanalen), voeg 40 µL van Coomassie briljant blauw G-250 eiwit kleurstof aan elke goed in de eerste kolom van de goed plaat. Mix de kleurstof met de monsters door kelderen meerdere malen. Herhaal dit voor alle andere kolommen, ter vervanging van de uiteinden van de pipet om verontreiniging te voorkomen.
      Let op: Coomassie briljant blauw G-250 is een irriterend en contact met huid, ogen of longen dient te worden vermeden. Gelieve Draag handschoenen en voorkom contact met de huid. Als contact met de huid optreedt, zal dit product vlekken.
    5. Gebruik een naald om pop bubbels aanwezig in de putten, als zij met de lezing van de spectrofotometer microplate interfereren kunnen. Reinig de naald om te voorkomen dat besmetting tussen putten. Laat de microplate Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    6. Het gebruik van een spectrofotometer microplate, opnemen de extinctie waarden voor elk putje op 595 nm.
    7. De gemiddelde absorptie voor de drie lege putten opnemen en deze waarde van elk van de standaard en onbekende monster lezingen aftrekken. Noteer de gemiddelde absorptie voor elk standaard en onbekende monster.
      Opmerking: Als u wilt berekenen van de hoeveelheid eiwit aanwezig in elke onbekende monster met behulp van de standaard curve, is het makkelijkste om de gemiddelde absorptie van elke standaard tegen de microgram proteïne in elke standaard regressie, maar een de eiwitconcentratie (µ kunt uitzetten g/µL) van elke standaard als wenselijk. De volgende berekeningen, echter verwijzen naar een standaard curve gebaseerd op microgram, niet concentraties (µg/µL).
    8. Plot de gemiddelde absorptie van elke standaard tegen de totale hoeveelheid proteïne in elke norm goed (tabel 1). Passen van een lineaire regressielijn tot deze gegevens en de vergelijking voor het berekenen van de hoeveelheid eiwit (µg) in elk onbekende monster goed op basis van de gemiddelde absorptie (Figuur 1a) gebruiken.
      Opmerking: De correlatiecoëfficiënt (r -waarde) van deze regel moet groter zijn dan 0,98 en regelmatig in de buurt van 0,99. De standaard regressie zullen specifiek zijn voor elke plaat, vandaar de onbekend monster putten in elk bord apart moeten worden geanalyseerd.
    9. Zodra de gemiddelde hoeveelheid eiwit is berekend voor elk onbekend monster putje, gebruikt u de volgende vergelijking voor het berekenen van de totale hoeveelheid eiwit (µg) in elk oorspronkelijke monster:
      Mp = (((Wp/60) x 1000) / 50) * 1000
      Mp = µg van eiwitten in het oorspronkelijke monster
      Wp = µg eiwit in een onbekend monster goed
      1. Gebruik vervolgens de volgende vergelijking om te bepalen van het percentage eiwit in elk monster:
        Pp = ((Mp/1000) / mi) * 100
        Pp = % eiwit in monster
        Mik = aanvankelijke massa van het monster (mg)
        Opmerking: In sommige gevallen kan het monster het bovenste extinctie drempel overtreffen. Zo ja, wellicht monsteroplossingen verdere verdunning bij stap 2.4.3.
        Extra verdunningen moeten vervolgens worden verantwoord in latere berekeningen. Sommige microplate lezer merken bieden ook computersoftware die de gemiddelde eiwitconcentratie van elk onbekende monster gebaseerd op de standaard curve-gegevens automatisch worden berekend.

3. verteerbare koolhydraten Assay

  1. Bereiding van de monsters
    1. Weeg analysemonsters van elk weefsel, ongeveer 20 mg elke, in glas 15 mL buisjes met rubber beklede schroefdoppen (100 mm lengte). Deze steekproef zal vervolgens worden hierna aangeduid als onbekende monsters. Label buizen met een waterdichte marker of etikettering van tape op de deksels en noteer de exacte massa van elk monster; deze informatie zal nodig zijn voor het berekenen van de % koolhydraten in elk onbekend monster.
  2. Pak verteerbare koolhydraten uit elk onbekend monster.
    1. Voeg 1 mL 0,1 M H2zodat4 aan elke buis en schroefdoppen op strak buizen. Plaats gedurende 1 uur in een kokend waterbad.
      Let op: Zwavelzuur is zeer corrosief. Gelieve draag een schort, handschoenen en oog googles bij hantering H2dus4 en voer deze stap uit in een zuurkast.
    2. Koel af buizen in een bad met lauw water. Giet buis inhoud in gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buizen (wees niet bezorgd als sommige materiële overblijfselen in het glazen buizen plant).
    3. Centrifugeer buizen bij 15.000 x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant vloeistof met een micro-pipet en de plaats in nieuwe gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buizen. Buizen kunnen 's nachts op dit punt worden gekoeld. Als verdergaat met test, zie stap 3.3.2.
  3. Meng standaardoplossingen en kwantificeren van de inhoud van de totale verteerbare koolhydraten van onbekende monsters.
    1. Voorbereiding d glucose standaardoplossingen met de concentraties vermeld in tabel 2. Zes glazen reageerbuizen met 400 µL van elke standaardoplossing voor te bereiden.
    2. Pipetteer 15 µL van elk onbekende monster in eigen test-buis en 385 µL van gedistilleerd water toe te voegen aan elk voor een totaal volume van 400 µL in elke proefbuis. In een zuurkast, 400 µL van 5% fenol toevoegen aan elke proefbuis standaard en onbekende monster, en vervolgens snel Pipetteer 2 mL van geconcentreerde H2SO4 in elke buis. Niet aanraken van de inhoud van de reageerbuis met de pipet-tip, gewoon toevoegen aan het oppervlak van de oplossing (een repeater Pipet werkt het beste voor deze).
    3. Laat buizen Incubeer gedurende 10 minuten, en vervolgens zorgvuldig vortex de buizen te mengen van inhoud. Incubeer gedurende een extra 30 minuten.
      Let op: Fenol en zwavelzuur zijn bijtende irriterende stoffen. Om te beschermen tegen blootstelling aan huid, ogen en inhalatie, deze stap moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast met behulp van de juiste PBM, omvat: gezicht schild of oog veiligheidsbril, rubber handschoenen, lab schort en laarzen. Mengen van fenol met zwavelzuur ook resultaten in een exotherme reactie, die zal resulteren in de buizen steeds warm.
    4. Pipetteer 800 µL van monster uit elke buis in elk van de 3 polystyreen 1,5 mL semi-micro cuvettes (3 technische replicatieonderzoeken per monster). Stel de spectrofotometer valt te lezen op 490 nm. Kalibreren voor een lege Cuvet met gedistilleerd water vóór het lezen van normen of onbekende monsters en met tussenpozen in de gehele steekproef lezingen. Elke cuvette doorlopen met een spectrofotometer en opnemen van de extinctie. Gemiddelde over technische repliceert voor elk onbekend monster.
      Opmerking: In sommige gevallen monsters kunnen overtreffen de bovenste extinctie drempel. Als dat zo is, moeten de monsters bij stap 3.2.3 worden verdund. Verdunningen moeten ook worden verantwoord in latere berekeningen.
    5. Bereken de gemiddelde absorptie van elke standaard.
      Opmerking: Voor de berekening van het bedrag van de totale verteerbare koolhydraten aanwezig in elke onbekende monster met behulp van de standaard curve, is het eenvoudigste om de gemiddelde absorptie van elke standaard tegen de microgram D (+)-glucose aanwezig in elke standaard regressie, maar men kan ook plot de D (+) glucose concentratie (µg/µL) van elke standaard als wenselijk. De volgende berekeningen, echter verwijzen naar een standaard curve gebaseerd op microgram, niet concentraties (µg/µL).
    6. Bereken de standaard curve door het uitzetten van de gemiddelde extinctie tegen de totale hoeveelheid D (+)-glucose (µg) in elke standaardoplossing. Passen van een lineaire regressielijn tot deze gegevens en gebruik vervolgens de volgende vergelijking voor het berekenen van de totale hoeveelheid koolhydraten (µg) in elk onbekende monster:
      Mc = (((eenx -b)/m)/(15)) * 1000
      Mc = µg van koolhydraten in monster
      Eenx = gemiddelde absorptie van onbekende monster
      b = y-snijpunt (standaard regressielijn)
      m = helling (standaard regressielijn)
      De correlatiecoëfficiënt van deze regel moet groter zijn dan 0,98 en regelmatig in de buurt van 0,99. Gebruik vervolgens de volgende vergelijking om te bepalen van het percentage koolhydraten in elk monster:
      Pc = ((Mcvan /1000) / (Mi)) * 100
      Pc = % koolhydraten
      Mik = aanvankelijke massa van het monster (mg)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om aan te tonen het nut van deze methoden, geanalyseerd wij de oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud van vier verschillende veld en suikermaïs weefsels die als afzonderlijke voeding potentieel voor insect herbivoren dienen. We korenaren verzameld uit drie landbouwgebieden in de Verenigde Staten (Minnesota, North Carolina en Texas), vijf verschillende verscheidenheden van zoete maïskorrels (dat wil zeggen, genotypen) en een scala aan veld maïs als een outgroup omvat. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Door het combineren van gevestigde colorimetrische testen met protocollen van de extractie van effectieve plant-specifieke, bieden de testen hier aangetoond een redelijke en nauwkeurige methode voor het meten van de plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud. Onze resultaten met behulp van maïs zoals een voorbeeld hoe deze protocollen kunnen worden gebruikt illustreert voor het verkrijgen van nauwkeurige metingen over verschillende biologisch relevante ruimtelijke schalen. Bijvoorbeeld, waren wij kundig voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dank aan allen van onze medewerkers die hebben geholpen met zoete maïs veld collecties, met inbegrip van Dominic Reisig en Dan Mott op North Carolina State University, en Pat Porter in Texas A & M University in Lubbock, TX. Dank aan Fiona Clissold voor zijn bijdrage aan het optimaliseren van de protocollen en wijzigingen in dit manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Texas A & M C. Everette Salyer Fellowship (departement van Entomologie) en de biotechnologie Risk Assessment Grant Program concurrerende verlenen nr. 2015-33522-24099 uit de U.S. Department of Agriculture (toegekend aan GAS en STB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
microplate reader (spectrofotometer)Bio-RadModel 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentraatBio-Rad#5000006450mL

Referenties

  1. Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
  2. Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
  3. Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
  4. Chapin, F. S. III The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
  5. Marschner, H. Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plants. , Academic press. London, UK. (1956).
  6. Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
  7. Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
  8. Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
  9. Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
  10. Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
  11. Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
  12. Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
  13. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. 78, 105-109 (2002).
  14. Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
  15. Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
  16. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
  18. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
  19. Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
  20. Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
  21. Cui, S. W. Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (2005).
  22. Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
  23. Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
  24. Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
  25. Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
  26. Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
  27. Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
  28. Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
  29. Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
  30. Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kwantificering van oplosbare eiwittenAnalyse van verteerbare koolhydratenAnalyse van plantenweefselColorimetrische eiwitassayFenol zwavelzuurmethodeCoomassie Brilliant BlueSpectrofotometrische metingAnalyse van macronutri ntgehalteKwantificering van plantenmacronutri ntenMethoden voor nutritionele ecologie

Gerelateerde artikelen