Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor de extractie en kwantificering van cafeïne in cel suspensies van C. arabica L. en een experimentele proces voor de evaluatie van de enzymatische activiteit van cafeïne synthase met het niveau van de expressie van het gen dat dit enzym codeert.

Samenvatting

Cafeïne (1,3,7-trimethylxanthine) is een purine alkaloïde in populaire dranken zoals koffie en thee aanwezig. Deze secundaire metaboliet wordt beschouwd als een chemische verdediging, omdat het heeft antibacteriële activiteit en wordt beschouwd als een natuurlijke insecticide. Cafeïne kan ook negatieve allelopatische effecten die voorkomen de groei van de omringende planten dat produceren. Bovendien, verbruiken mensen over de hele wereld cafeïne voor de pijnstillende en stimulerend gevolgen. Als gevolg van de interesse in de technologische toepassingen van cafeïne, onderzoek naar de biosynthetic traject van dit samengestelde gegroeid. Deze studies zijn primair gericht op het begrijpen van de biochemische en moleculaire mechanismen die de biosynthese van cafeïne regelen. In vitro weefselkweek is uitgegroeid tot een nuttig systeem voor de studie van dit biosynthetic traject. Dit artikel beschrijft een stapsgewijze protocol voor de kwantificering van cafeïne en voor het meten van de niveaus van de transcriptie van het gen (CCS1) codering cafeïne synthase (CS) in cel suspensies van C. arabica L., alsmede haar activiteit.

Inleiding

Cafeïne is een secundaire metaboliet thats levende door planten van het geslacht Coffea¹. Dit alkaloïde behoort tot de familie van de methylxanthine en wordt beschouwd als een chemische fabriek verdediging, omdat het tegen de negatieve effecten van ziekteverwekkers en planteneters^{2,3 optreden kan}. Deze metaboliet is daarnaast verantwoordelijk voor de stimulerende eigenschappen van de koffie drinken, die vaak verbruikt wereldwijd^4,5. Als gevolg van zijn eigenschappen, zijn verschillende onderzoeksgroepen geïnteresseerd in het bestuderen van de biosynthetic traject en het katabolisme van cafeïne^6,7. Momenteel, dienen plant in vitro cel/weefselcultures als alternatief voor de evaluatie van cafeïne accumulatie onder verschillende biotische en abiotische strategieën^8,9.

Cafeïne biosynthese impliceert de Hydrolytische release van 7-methylxanthine van de overeenkomstige ribose nucleoside gevolgd door bestelde N-methyleringen op positie 3 en 1. Een specifieke S- adenosyl methionine (SAM)-afhankelijke N-methyltransferase (NMT) katalyseert de Methyleren aan positie 7, overwegende dat theobromine synthase (TS) en CS zijn betrokken in de 3 - en 1-methyleringen, respectievelijk produceren theobromine en cafeïne. De studie van genen coderend voor verschillende meetposten heeft toegestaan het mechanisme dat cafeïne productie^{10,11 regelt}te begrijpen. CS, heeft N -methyltransferase activiteit, katalyseert de laatste twee stappen van het biosynthetic leertraject van cafeïne¹¹. In koffie boom zaailingen, is gebleken dat licht straling CS activiteit, wat in een toename van de biosynthese van cafeïne resulteert kan verhogen. Onlangs, toonden we dat het onderhoud van cel schorsingen van C. arabica L. onder lichte bestraling de optimale voorwaarde is voor de evaluatie van de effecten die produceren abiotische stressfactoren beïnvloeden de biosynthetic traject van cafeïne⁸. De informatie die is verkregen in deze studies wellicht toepassingen in de metabole engineering en systemen biologie voor het maximaliseren van de studie van de cafeïne biosynthetic pathway in dergelijke systemen in vitro .

Gezien de voordelen van het verkrijgen van een geschikt model voor de studie van cafeïne biosynthese, wij de voorwaarden van de winning voor cafeïne op cel schorsingen van C. arabica L. geoptimaliseerd Het was ook mogelijk om een nuttige protocol voor de studie van de enzymatische activiteit, evenals de methodologische stappen voor de beoordeling van het niveau van gene afschriften van Coffea cafeïne synthase 1 (CCS1) codering van dit enzym ontwikkelen. Hierin, rapporteren we een protocol voor het uitpakken en kwantificeren van cafeïne in C. arabica cel suspensies door dunne-laag chromatografie en densitometrie (TLC-densitometrie).

Protocol

1. Cafeïne-extractie in cel suspensies van C. arabica L.

1. C. arabica cel schorsingen⁹gebruiken. Het handhaven van de schorsingen door tweewekelijkse subculturen in Murashige en Skoog medium bij een pH 4.3 met constante 100 t/min schudden bij 25 ° C onder continu licht (8.3 W/m²).
2. Het oogsten van de cellen onder vacuüm filtratie met 11 µm porie filtreerpapier en een Buchner trechter.
3. Registreer het verse gewicht van de verzamelde cellen met een kleurenschaal, wikkel ze in aluminiumfolie, bevriezen ze in vloeibare stikstof en houd ze bij-80 ° C tot analyse.
4. Lyophilize de bevroren celmateriaal voor 72 uur.
5. Het gewicht van het gelyofiliseerd cellen registreren om te kunnen inschatten van het rendement van het drooggewicht.
6. Bewaar de poedervorm materiaal in herbruikbare polyethyleen zakken (9 x 7,5 cm). Maceraat het materiaal tot een fijn poeder en winkel in een exsiccator tot gebruik.
7. Meten van 0,5 g droge cellulaire stof op de schaal van de analytische en toevoegen aan een kolf van glas (25 mL).
   1. Voeg 10 mL aceton aan de gelyofiliseerd cellen en meng in een vortex-mixer voor 30 s voor homogenisering. Dan, zegel de kolf met aluminiumfolie.
   2. Meng 100 rpm met behulp van een rotator op kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 5 uur.
8. Overdracht van al het materiaal een conische tube van 15 mL en centrifuge op 13.000 x g voor 10 min. overdracht de vloeibare fase aan een nieuwe buis en reduceren tot het droogheid bij kamertemperatuur in de zuurkast.
9. Resuspendeer de steekproef met 25 µL van aceton.

2. voorwaarden voor de beoordeling van cafeïne door dunne laag chromatografie (TLC)-densitometrie

1. Breng 1 µL van het eerder geresuspendeerde cafeïne extract de stationaire fase.
   Opmerking: Silica gel platen (F254) worden gebruikt als de stationaire fase. Alvorens de monsters, de platen werden ontwikkeld met 10 mL chloroform-methanol [9:1 v/v] in een zaal van chromatografie (14 x 12 cm x 9,5 cm), en de platen waren gedroogd bij kamertemperatuur. De kenmerken van de chromatografische plaat waar de monsters worden toegepast worden getoond in Figuur 1. De kamer was voor 30 min verzadigd met oplosmiddel voor het ontwikkelen van de plaat. TLC platen moeten omgaan met het gebruik van handschoenen om verontreiniging te voorkomen.
2. Ontwikkelen van de TLC in de zaal van de chromatografie met 10 mL van de mobiele fase cyclohexaan-aceton [40:50 v/v].
   Opmerking: Dit mengsel maakt het mogelijk de scheiding van cafeïne op een factor (Rf) van de retentie van 0,34.
   1. Verwijder de TLC-plaat uit de zaal en laat het volledig drogen bij kamertemperatuur.
3. Visualiseren van cafeïne bands in korte golflengte ultraviolet licht (UV, 254 nm). Gebruik een compacte UV-lamp. Bovendien, voor deze stap, gebruik bril met UV-bescherming.
4. Kwantificeren van cafeïne niveaus door densitometrie op 273 nm. Het instrument wordt beheerd met chromatografie software.

3. RNA Acid (RNA) isolatie

1. Neem de schorsingen van de cel uit stap 1.1 en vacuüm filtraat met filtreerpapier (poriegrootte 11 µm).
2. Het celmateriaal van het koffiefilter verzamelen, weeg 0,5 g van celmateriaal op een analytische balans en verpak het in aluminiumfolie. Het bevriezen van het monster met vloeistof N₂.
3. Het monster van de cel in een porseleinen mortier met vloeibare stikstof maceraat en voeg 1 mL van RNA isolatie reagens tot gehomogeniseerd.
   Opmerking: Steriliseren de porselein mortieren in een moffeloven oven bij 300 ° C voor 6 h. RNA isolatie reagens fenol, guanidine isothiocyanaat en andere componenten bevat.
   1. 500 µL van het monster overbrengen in een steriele microcentrifuge buis (1,5 mL). Voeg 300 µL van chloroform-Isoamylalcohol (24:1) en 300 μL van geëquilibreerd fenol (pH 8.0).
4. Meng het monster met een vortex-mixer en het vervolgens Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
5. 300 μL van de bovenste fase overbrengen in een microcentrifuge buis. Voeg toe 200 μL van isopropanol. Incubeer de buis gedurende 1 uur bij-20 ° C.
6. Centrifugeer de buis bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en vervolgens decanteren in de vloeibare fase.
   1. Voeg 1 mL ethanol (70%) vormen een pellet in de buis. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten en decanteren. Herhaal deze stap tweemaal.
7. Droog het monster gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur (25 ° C). Resuspendeer de RNA-extract met 25 μL van diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water.
   Opmerking: Voor de extractie van RNA, gebruik van water behandeld met 0,1% DEPC (v/v).

4. de incubatie van RNA transcriptie met Deoxyribonuclease (DNase)

1. In een steriele microcentrifuge buis, voeg 2 µg totaal RNA-extract. Voeg 1 μl van 10 x reactie buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂). Voeg 1 μl van 1 U/µL DNase.
   1. De reactie op een eindvolume van 10 μL met DEPC behandelde water brengen. Meng het monster en de centrifuge kort bij 2.000 x g voor 1 min.
2. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
3. Stop de reactie met de toevoeging van 1 μL van 50 mM Dinatrium ethyleendiaminetetraacetaat (dihydraat) p.a. (nb₂van EDTA) en Incubeer het monster bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
4. Het analyseren van de integriteit van het RNA door agarose gelelektroforese.
   1. Voorbereiden van een standaard 1% agarose gel en vlek het met 1 µL van 3 x intercalating van nucleïnezuur vlek oplossing.
   2. Toepassing 500 ng van RNA aan de agarose gel en uitvoeren van de gel.
   3. Visualiseer de integriteit van het RNA met behulp van een gel foto documentatiesysteem.
   4. RNA als de sjabloon gebruiken voor cDNA synthese door reverse-transcriptase.

5. aanvullende Deoxyribonucleic Acid (cDNA) synthese

1. 2.5 μg totaal RNA toevoegen aan een microcentrifuge buis. Voeg 1 μL van oligo-deoxythymine (dT) primer en vul de buis tot een eindvolume van 13 μL met nuclease-gratis water. Meng het monster en centrifugeer dan 2.000 x g voor 1 min.
2. Incubeer het monster bij 65 ° C gedurende 5 minuten en vervolgens bij 4 ° C gedurende 2 minuten.
3. Voeg 4 l 5 x reactie buffer die wordt gebruikt voor reverse-transcriptase, 2 μL van deoxynucleotide trifosfaat (dNTPs) mix (10 mM van elke dNTP) en 1 μL van reverse-transcriptase (200 U/µL). Meng voorzichtig samen en centrifugeer bij 2.000 x g voor 1 min.
4. Incubeer het monster bij 45 ° C gedurende 50 min en vervolgens bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
5. Kwantificeren van de concentratie van de cDNA met behulp van een UV spectrofotometer.
6. Gebruik de cDNA als de sjabloon voor de polymerase-kettingreactie (PCR).
   Opmerking: De reactie buffer werd gebruikt als 10 x (stap 4.1.1) en 5 x keer geconcentreerd (stap 5.3), respectievelijk.

6. real-Time kwantitatieve PCR (qPCR) om te vergroten de Gene CCS1

1. 7.5 μL van de polymerase van DNA Taq 2 x (0.1 U/mL) en 0,1 μM van 5-carboxy-X-rhodamine (ROX) toevoegen aan een PCR microcentrifuge buis.
   Opmerking: De warme start polymerase van DNA Taq 2 x werd gebruikt als een oplossing 2 x geconcentreerd.
   1. Voeg 5 l nuclease-gratis water.
   2. Voeg 0,75 l elke 10 μM-forward en reverse primer aan het versterken van het gen CCS1 (AB086414) (naar voren: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' en omgekeerde: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Inleidingen voor tubuline gebruikt als het gen van de house-keeping in een aparte reactie (naar voren: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' en omgekeerde: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. Toevoegen van 600 ng van cDNA sjabloon.
2. Uitvoeren van de amplificatie reactie bij 50 ° C voor 2 min en 95 ° C gedurende 5 min. Incubeer de reactie in de real-time PCR-systeem gedurende 40 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 30 s.
3. Incubeer het monster bij 50 ° C voor 30 s en 20 ° C gedurende 10 s.
4. Het analyseren van de gegevens met de PCR-software.
5. Bereken de relatieve-expressie door de 2-^ΔΔCT methode beschreven door Livak en Schmittgen (2001)¹².
   Opmerking: Analyseren een besturingselement reactie waarin alle onderdelen met uitzondering van de DNA-sjabloon (sjabloon oncontroleerbaar, NTC) kunnen negeren besmet reagentia of versterking-inleidingsdimeer.

7. totale proteïne Extract van cel schorsingen van C. arabica L.

1. Filter cel schorsingen onder vacuüm met een medium-porie filtreerpapier.
2. Weeg 1 g van celmateriaal en verpak het in aluminiumfolie.
   1. Het bevriezen van het monster met vloeibare stikstof. Maceraat het monster in een gesteriliseerde porseleinen vijzel tot een fijn poeder te verkrijgen.
3. Het monster overbrengen in een glazen ampul en voeg 2,5 mL extractie buffer (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), op pH 8,0, met 10 mM β-mercaptoethanol, 5 mM nb₂EDTA en 0,5% (w/v) natrium ascorbaat.
   1. Meng het monster in een vortex-mixer gedurende 2 minuten.
      Opmerking: Het is belangrijk dat het monster wordt gehouden op het ijs om te voorkomen dat denaturatie van eiwit.
4. Centrifugeer het monster bij 20.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C en breng 500 µL aliquots in cryogene flesjes (2 mL). Monsters bij-72 ° C bewaren tot gebruik.
5. Meten van de eiwitconcentratie van het monster bij 562 nm in een spectrofotometer gebruikend bicinchoninic zuur assay met bovien serumalbumine als norm.

8. enzymatische Assay voor cafeïne Synthase

1. Bereiden van een reactiemengsel in een buis van de microcentrifuge met 200 µM SAM, 4.07 kBq van methyl [³H]-SAM, 200 µM theobromine, 200 µM MgCl₂en 5 µM cafeïne. Verhoog het volume aan 200 µL met 100 mM Tris-HCl bij een pH van 8.0.
2. Houd de microcentrifuge buis op ijs en toevoegen van een volume van de oplosbare fractie 7-9 mg eiwit bevat. Daarna Meng door vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 ° C in een Thermostatische bad/rondpompthemostaat. Voor een partij van verschillende monsters, incubeer elk monster in tweevoud in 1 min perioden om voldoende tijd om te stoppen met de reacties voor alle monsters in een exacte periode van 30 min.
   1. Voeg vervolgens 1 mL chloroform zet de reactie stop en schud vervolgens het monster met een vortex-mixer. Schud het monster met behulp van een vortex-mixer voor 3 min te verwijderen van de radioactieve cafeïne in het oplosmiddel.
3. Centrifugeer steekproeven bij 11.000 x g gedurende 5 min en een volume van 900 µL zorgvuldig te herstellen. Vervolgens overbrengen in de monsters Scintillatie flesjes.
4. Verdampen van de chloroform om te voltooien van de droogte in de motorkap bij kamertemperatuur op 25 ° C. Voeg 5 mL van scintillatie vloeistof naar de flacon en meng het monster.
5. Het analyseren van de radioactiviteit in de cafeïne in een teller Scintillatie opgenomen.

Resultaten

Cafeïne extracten verkregen via het proces hier gepresenteerd werden geanalyseerd door TLC-densitometrie door het onderwerpen van de monsters te plaat chromatografie volgens de regeling die is afgebeeld in Figuur 1. Kwantificeren van de niveaus van cafeïne in de cel extracten, een curve met verschillende concentraties van commerciële standaard voor deze verbinding werd gebruikt (figuur 2A). Het patroon van absorptie voor cafeïne ...

Discussie

Wij presenteren hier de optimale omstandigheden voor de evaluatie van de cafeïne inhoud, CS activiteit en afschrift niveaus in een in vitro plantaardige weefselkweek, zoals cel schorsingen van C. arabica. Eerdere verslagen hebben bevestigd dat handhaving cellen onder lichte bestraling en in aanwezigheid van theobromine in het kweekmedium geschikt parameters zijn voor het verhogen van het niveau van cafeïne, waardoor het mogelijk is om te evalueren van de cafeïne scheidingsmethoden met behulp van reverse...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boorzuur (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdeenzuur (Natriumzout)• 2H2O (0.25) Kaliumjodide (0.83) Kaliumnitraat (1900) Kaliumfosfaat, monobasisch (170) Zinksulfaat•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteïne (25) sucrose (30000) 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeïne	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexaan	JALMEX	C4375-13	1 L
Aceton	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silicagel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbaat	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Zoutzuur 36,5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl metioniene	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Vloeibare scintillatiebuisjes	SIGMA	Z253081
Thermostaatbad/circulator	Cole Parmer	60714
Microcentrifugebuisjes	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogene buisjes	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porseleinen vijzel	Fisherbrand	FB961B
Filterpapier	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytische balans	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillatieteller	Beckman Coulter	6500
Gel fotodocumentatiesysteem	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner trechter	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
RevertAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	Voor 200 reacties van 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Fenol, pH 8,0, geëquilibreerd, moleculaire biologie kwaliteit, ultrapuur	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethylpyrocarbonaat	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210