Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hyaluronzuur gebaseerd Hydrogels voor 3-dimensionale cultuur van Glioblastoma patiënt-afgeleide cellen

12.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58176

⸱

24 augustus 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 2Department of Bioengineering, Jonsson Comprehensive Cancer Center, Broad Stem Cell Research Center, Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor driedimensionale cultuur van glioblastoma patiënt-afgeleide cellen binnen orthogonaal afstembare biomaterialen ontworpen na te bootsen de hersenen-matrix. Deze aanpak biedt een in vitro, experimenteel platform die veel kenmerken van in vivo glioblastoma cellen meestal verloren in cultuur onderhoudt.

Samenvatting

Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende, maar meest dodelijke, centraal zenuwstelsel kanker. In de afgelopen jaren hebben vele studies gericht op hoe de extracellulaire matrix (ECM) van het unieke hersenen milieu, zoals hyaluronzuur (HA), GBM progressie en invasie vergemakkelijkt. Echter, de meeste in vitro cultuur modellen omvatten GBM cellen buiten de context van een ECM. Lymfkliertest xenografts GBM cellen worden vaak ook gebruikt. Echter, in vivo modellen maken het moeilijk om te isoleren van de bijdragen van de afzonderlijke functies van de complexe tumor communicatie gedrag van de tumor. Hier beschrijven we een HA hydrogel gebaseerde, driedimensionale (3D) cultuur platform waarmee onderzoekers te wijzigen onafhankelijk HA concentratie en stijfheid. Ultrahoog moleculair gewicht HA en polyethyleenglycol (PEG) omvatten hydrogels, die kruisverwijzende via Michael-type toevoeging in de aanwezigheid van levende cellen. 3D hydrogel culturen van patiënt-afgeleide GBM cellen tentoonstelling levensvatbaarheid en proliferatie tarieven zo goed als of beter dan, wanneer gekweekt als standaard gliomaspheres. De hydrogel systeem kunt ook opneming van ECM-mimetische peptides te isoleren van effecten van specifieke cel-ECM interacties. Hydrogels zijn optisch transparant zodat levende cellen kunnen worden beeld in 3D cultuur. Ten slotte zijn HA hydrogel culturen compatibel met standaardtechnieken voor moleculaire en cellulaire analyses, met inbegrip van PCR, het westelijke bevlekken en cryosectioning gevolgd door immunofluorescentie kleuring.

Inleiding

Driedimensionale (3D) cultuur systemen recapituleren interacties tussen cellen en hun omliggende extracellulaire matrix (ECM) in native weefsels beter dan hun tegenhangers van tweedimensionale (2D)1,2. Vooruitgang in weefselengineering hebben opgeleverd verfijnde, 3D cultuur platformen waarmee gecontroleerde onderzoeken naar 1) hoe chemische en fysische componenten van de matrix communicatie beïnvloeden cel gedrag en 2) de werkzaamheid van nieuwe therapeutische strategieën voor een aantal ziekten, waaronder kanker2. Terwijl in vitro modellen kunnen niet goed zijn voor systemische factoren, zoals de endocriene en immuun signalen, en dus niet volledig in vivo modellen vervangen, bieden ze verschillende voordelen met inbegrip van reproduceerbaarheid, experimentele controle, betaalbaarheid en snelheid. Hier beschrijven we het gebruik van hersenen-mimetische hydrogels in welke 3D culturen van tumor patiënt afkomstige hersencellen veel aspecten van tumor fysiologie, in het bijzonder, de dynamiek vangen van het verwerven van behandeling weerstand3. Vergeleken met andere methoden in vitro , vertegenwoordigen deze culturen beter in vivo de modellen van de tumor en klinische waarnemingen3.

Glioblastoma (GBM) is de meest frequente en dodelijke kanker van oorsprong in de hersenen, met een mediane overleving van slechts 1-2 jaar-4,5. In de afgelopen jaren hebben vele studies gericht op de invloed van tumor matrix milieu in GBM6,7,8. De unieke hersenen ECM is gemeld bij GBM cel migratie, proliferatie, en therapeutische weerstand6,7,8,9,10,11 , 12. hyaluronzuur (HA) is een overvloedige glycosaminoglycaan (GAG) in de hersenen, waar het interageert met andere GAGs en proteoglycans te vormen een hydrogel-achtige gaas13. Vele studies hebben gemeld HA overexpressie GBM tumoren en haar latere gevolgen voor kanker progressie8,9,13,14,15,16 ,17. Andere ECM-onderdelen ook invloed op GBM tumor groei en invasie6,7,15,18. Bijvoorbeeld, fibronectin en vitronectin, die zijn meestal overexpressie in GBM, induceren heterodimerization van cel oppervlakte integrine receptoren door binding aan de "RGD"-reeks en initiëren van complexe signalering cascades ter bevordering van de tumor survival19 2120, ,. Naast biochemische invloeden beïnvloeden fysische eigenschappen van de weefsels-matrix ook GBM progressie22,23.

Voortdurende verwerving van weerstand tegen therapieën is een van de belangrijkste drijfveren van GBM letaliteit4. Drugs veelbelovende resultaten in 2D of gliomasphere modellen hebben gefaald in latere dierstudies en klinische gevallen3, die aangeeft dat de effecten van microenvironmental factoren in belangrijke mate aan GBM tumor antwoord1 bijgedragen. Hoewel diermodellen een 3D bieden kunnen, fysiologisch geschikte communicatie naar xenografted patiënt cellen en genereren van klinisch relevante uitkomsten24,25, de complexiteit van de hersenen communicatie in vivo maakt het uitdagend om te bepalen welke functies, met inbegrip van cel-matrix interacties, zijn de sleutel tot specifieke biologische uitkomsten. Identificatie van nieuwe therapeutische doelen zullen profiteren van het gebruik van vereenvoudigde cultuur platforms waarin biochemische en biofysische eigenschappen worden gedefinieerd.

In tegenstelling tot de eerder gemelde biomaterial modellen van de GBM tumor communicatie26,27 , die echte orthogonale controle over afzonderlijke biochemische en fysieke kenmerken van de ECM, het biomaterial platform niet hebben bereikt gerapporteerde hier stelt ontkoppeling van de bijdragen van meerdere onafhankelijke functies GBM cel fenotype. Hier presenteren we een systeem van de HA-based, orthogonaal afstembare, hydrogel voor 3D cultuur van patiënt-afgeleide GBM cellen. Hydrogels bestaan uit twee polymeer onderdelen: 1) biologisch actieve HA en 2) biologisch inerte polyethyleenglycol (PEG). PEG is een veel gebruikte biocompatibel en hydrofiele materiaal met laag eiwitgehalte adsorptie en minimale immunogeniciteit28. Ongeveer 5% van glucuronic zuur wordt op HA kettingen zijn hier, matiemaatschappij met thiol-groepen om crosslinking aan een commercieel beschikbare 4-arm-PEG beëindigd met maleimides via Michael-type toevoeging. In zijn meest voorkomende vorm in het lichaam bestaat HA in ultrahoog moleculair gewicht (HMW) ketens. Hier, bijdraagt een lage mate van wijziging van HMW HA (500-750 kDa) tot de bescherming van inheemse interacties van HA en zijn cel receptoren, met inbegrip van CD4429. Door vervanging van PEG-thiol voor HA-thiol met behoud van een constante molaire verhouding van totale thiolen te maleimides, kan HA concentratie worden losgekoppeld van de mechanische eigenschappen van het resulterende hydrogels. Bovendien kunnen stoichiometrische besturingselementen worden gebruikt voor conjugaat van cysteïne-beëindigd peptiden aan een opgegeven gemiddelde aantal armen maleimide-beëindigd op elk 4-arm-PEG. Opneming van ECM-afgeleid, zelfklevende peptiden kan interacties met verschijnsel op gekweekte cellen, waardoor biochemische en chemische signalen getransduceerde1 zijn. Maleimide-thiol toevoeging vindt zeer snel plaats onder fysiologische omstandigheden, minimaliseren van de tijd die nodig is voor de cel inkapselen en maximaliseren voortbestaan van patiënt-afgeleide cellen. Bovendien hydrogel culturen kunnen worden behandeld als typische weefsel specimen en zijn compatibel met standaard karakterisering technieken waaronder westelijke bevlekken, stroom cytometry en immunofluorescentie kleuring. Het volgende protocol beschrijft de procedures voor het fabriceren van hydrogels, tot de oprichting van 3D culturen van patiënt-afgeleide GBM cellen en technieken voor biochemische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle menselijk weefsel collectie stappen werden uitgevoerd onder institutioneel goedgekeurde protocollen.

1. Thiolation van hyaluronzuur

Opmerking: Molaire ratio's zijn vermeld met betrekking tot het totale aantal carboxylaat groepen tenzij anders aangegeven.

  1. Los 500 mg natrium hyaluronaat (HA, 500-750 kDa) bij 10 mg/mL in gedeïoniseerd, gedestilleerd water (DiH2van O) in een autoclaaf gesteriliseerd, 250 mL conische kolf. Roer de oplossing (~ 200 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur te ontbinden volledig HA. Gebruik een roer bar en magnetische roer plaat te houden reactie roeren tijdens thiolation procedure.
  2. Met behulp van 0,1 M zoutzuur (HCl), breng de pH van de oplossing van de HA naar 5.5. Weeg 69,6 mg (0.25 x molaire verhouding) van 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
    Opmerking: Hoewel onopgeloste EDC kan direct naar de HA-oplossing worden toegevoegd, is het doorgaans makkelijker los EDC eerst in 1 mL DiH2O en vervolgens snel het toevoegen van de EDG-oplossing aan de HA-oplossing. Pre ontbinding in 1 mL DiH2O kan ook worden gedaan, met N-hydroxysuccinimide (NHS) en cystamine dihydrocholoride voordat u toevoegt aan de reactie in stap 1.3 en 1.4.
  3. 17.9 mg (0,125 x molaire verhouding) van NHS aan de reactie toevoegen. Breng de pH van de oplossing van de reactie naar 5.5 met behulp van 0,1 M HCl en Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
  4. 70,0 mg (0.25 x molaire verhouding) cystamine dihydrochloride toevoegen in de reactie-oplossing. Gebruik 0,1 M natriumhydroxide (NaOH) om te passen pH ten slotte op 6,25. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur 's nachts tijdens het roeren.
  5. De volgende dag kunt 1 M NaOH Breng de pH van de oplossing van de reactie op ongeveer 8. 192 mg (4 x de molaire verhouding) van dithiothreitol (DTT) aan de reactie toevoegen. Breng de pH terug op 8 na toevoeging van DTT en laat roeren gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
  6. Gebruik 1 M HCl om te passen pH tot en met 4. Breng het gehele reactiemengsel in vooraf doorweekt dialyse membraan (moleculair gewicht cut-off rond 13 kDa) en dialyze tegen DiH2O vooraf aangepast aan de pH 4.
    Opmerking: Het volume van DiH2O voor dialyse moet ten minste 40 keer het volume van de gereageerde HA oplossing (bijvoorbeeld 50 mL monster in 2 L van DiH2O, pH 4).
  7. Vervang de dialyse-oplossing (DiH2O, pH 4) tweemaal per dag gedurende 3 dagen bij kamertemperatuur.
  8. Filtreer de dialyzed oplossing door een 0,22 µm membraan, vacuüm-gedreven filter. Flash bevriezen oplossing van thiolated HA in vloeibare stikstof. Gebruik een lyophilizer om te bevriezen droge monsters over 2 dagen. Thiolated HA in droge vorm kunnen worden opgeslagen in een vacuüm verzegelde exsiccator bij-20 ° C gedurende ten minste 6 maanden.
  9. Om te bepalen van de mate van thiolation, door Ellman van test-en/of proton NMR spectroscopie30,31te gebruiken.

2. voorbereiding van Crosslinking materialen

  1. Los thiolated HA in de gewenste concentratie (in dit voorbeeld, 13,3 mg/mL) in een HEPES-gebufferde zoutoplossing (20 mM HEPES Henks evenwichtige zout zout (HBSS) buffer, aangepast om te vallen op een pH van 8-9) in een amber flesje tot een minimum beperken van blootstelling aan het omgevingslicht. Bewaar deze oplossing onder voortdurend roeren.
    Opmerking: Vorming van disulfide bindingen tussen thiolen geconjugeerd met HA kan optreden als de pH hoger dan 8 is, concentratie voorraadoplossing te hoog is of de oplossing roeren blijft gedurende te lang voordat de gelering. U kunt dit probleem voorkomen, gebruik maken van onderstaande thiolated HA 15 mg/mL en los thiolated HA binnen twee uur na de vorming van de hydrogels.
  2. Los 4-arm-PEG-maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) en 4-arm-PEG-thiol (PEG-thiol, 20 kDa) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4, ter voorbereiding van 50 mg/mL PEG-Mal en PEG-thiol stamoplossingen.
    Opmerking: Het duurt ten minste 1 uur te ontbinden volledig PEG reagentia.
  3. Als toevoegt ECM-afgeleide peptiden, ontbinden cysteïne bevattende peptiden in PBS te bereiden van een stamoplossing.
    Opmerking: Gebruik een voorraad concentratie van 2-4 mM.
  4. Soak siliconen rubberen mallen in ethanol voor ten minste 20 min. te schoon hen en vervolgens autoclaaf hen voor sterilisatie.

3. Hydrogel Crosslinking en cel inkapseling

Opmerking: als voorbeeld hier, de inkapseling van vier individuele, 80 µL hydrogels met 0,5% (w/v) HA en druksterkte modulus van 1 kPa is beschreven3. Zie tabel 1 voor voorbeeld recepten die hydrogels met verschillende eigenschappen opbrengst: twee hydrogels waarin het integrine-bindend peptide RGD en twee hydrogels cysteïne caps op te nemen als een negatieve controle voor peptide activiteit. Concentratie van patiënt-afgeleide GBM cellen zaaien is 500.000 cellen/mL.

  1. PEG-Mal stockoplossing (50 mg/mL, vanaf stap 2.2) tot 12,5 mg/mL verdund door 40 µL van de stockoplossing naar 120 µL PBS toe te voegen. De verdunde oplossing splitsen in twee 1,5 mL microcentrifuge buizen, zodat elke buis 80 µL heeft.
  2. Voeg 16 µL van voorraad RGD oplossing (2,8 mM, vanaf stap 2.3) aan één buis en 16 µL van voorraad cysteïne oplossing (2,8 mM, vanaf stap 2.3) aan de tweede buis. Vortex te mengen. Plaats de PEG-Mal-RGD of PEG-Mal-CYS oplossingen op ijs tot gebruik in stap 3.9.
    Opmerking: De procedure zoals beschreven hier opbrengsten hydrogels met ~ 140 µM van peptide. Dit komt overeen met ongeveer 1 uit elke 8 beschikbaar PEG wapens met een peptide bezet. Dit kan worden gevarieerd door de molaire verhouding van cysteïne-beëindigd peptiden aan beschikbare maleimide-groepen te wijzigen. In het algemeen, kan een maximale concentratie van 280 µM van peptide worden bereikt terwijl nog voldoende aantallen maleimide groepen beschikbaar voor hydrogel crosslinking.
  3. De PEG-thiol stockoplossing (50 mg/mL, vanaf stap 2.2) tot 5 mg/mL verdund door het mengen van 4 µL van 50 mg/mL stockoplossing met 36 µL van PBS. 120 µL van opgeloste, thiolated HA uit stap 2.1 toevoegen aan het mengsel.
    Nota: Oplossingen van HMW HA zijn zeer viskeuze. Dus, is het raadzaam gebruik van wide-opening micropipet tip om over te brengen van oplossingen. Pipetteer langzaam om te voorkomen dat de oplossing die vasthouden aan de muren van micropipet tip en ter verbetering van de meetnauwkeurigheid.
  4. De schone, droge mallen (bereid in stap 2.4) in ieder putje van een niet-Weefselkweek behandeld 12-well plaat plaatsen. Met behulp van een pipet tip schoon, botte ultimo, druk op de gel schimmel en dubbel te controleren afdichting tussen mallen en goed plaat onderin.
    Opmerking: Controleer het zegel weer vlak voor inkapseling ter voorkoming van lekkage.
  5. Passage van gekweekte GBM cellen, distantiëren aan afzonderlijke cellen en bepalen cel concentratie3zoals hiervoor is beschreven.
    Opmerking: Sommige GBM lijnen kunnen niet los worden gezien aan afzonderlijke cellen. In dit geval kan de hele gliomaspheres worden samengevat. Echter bereid gedissocieerde afzonderlijke cellen na nauwkeurige cel tellen ter verbetering van de reproduceerbaarheid. Het protocol voor gliomasphere passaging varieert tussen verschillende labs en veel van deze zijn waarschijnlijk compatibel met hydrogel inkapseling.
    1. (Aanbevolen) Centrifuge gliomaspheres bij 500 x g gedurende 5 min. het supernatant verwijderen en voeg 1 mL cel dissociatie enzym tot de cel pellet. Vervolgens, Incubeer gedurende 5 minuten, zachtjes te tikken op de buis te doorroeren.
    2. 4 mL van volledige voedingsbodem (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg Mo/mL heparine, G21 supplement en 1% penicilline/streptomycine in DMEM/F12) aan de cellen toevoegen.
    3. Centrifugeer nogmaals bij 500 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Ten slotte, resuspendeer de cel pellet in 1 mL van het volledige medium en zwevende cellen passeren door een zeef van de cel 70 µm. (Aanbevolen) wassen de zeef met een extra 4 mL van het volledige medium om te maximaliseren van het aantal cellen hersteld.
  6. Schatting van de concentratie van cellen in de opschorting die met behulp van een hemocytometer. De celsuspensie worden gesplitst in 2 centrifuge buizen, waar elke buis ~ 80000 cellen bevat. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min; in het algemeen zal 80.000 cellen 2 80 µL hydrogels make-up.
  7. Verwijder het supernatant en resuspendeer een pellet in 80 µL van PEG-MAL-RGD oplossing en een tweede pellet in 80 µL van PEG-MAL-CYS oplossing (bereid in stap 3.1).
  8. Met behulp van een 200 µL, wide-opening micropipet tip, afzien 40 µL van HA-oplossing (uit stap 3.3 hierboven) in elke rubberen siliconen mal (zoals opgesteld in stap 3.4).
  9. Met behulp van een 200 µL, wide-opening micropipet tip, meng de 40 µL van PEG-MAL-CYS of PEG-MAL-RGD cell oplossing met de HA-oplossing in de mal. Pipetteer op en neer snel niet meer dan 10 keer. Herhaal voor elke cultuur van de gel voorbereid.
    Opmerking: Deze stap neemt praktijk, aangezien eerste gelering snel gebeurt (binnen de 30 s). Pipetteer omhoog en omlaag terwijl het bewegen van de tip op verschillende locaties in mallen om ervoor te zorgen zelfs mengen. Houd altijd de tip hieronder vloeistofniveau tot de vorming van luchtbellen vermijden. Doen niet mix de oplossing ook vaak als gel kan krijgen gevormd binnen de micropipet tip. PEG-MAL-CYS en PEG-MAL-RGD kunnen worden gecombineerd op verschillende ratio's om de gewenste RGD peptide concentratie.
  10. Plaats de goed-plaat met gel-ingekapseld cellen in een 37 ° C cel cultuur incubator voor 5-10 minuten om de voltooiing van de reactie.
  11. Voeg 2-2.5 mL gestolde voedingsbodem aan elk putje met gevormde gels. Kunt een steriele, 2 µL Pipetteer tip of micro-spatel, de schimmel en de gel zachtjes te scheiden. Gebruik vooraf gesteriliseerde pincet voor het verwijderen van de mal van de goed plaat. Plaats de goed plaat terug naar cel incubator (37 ° C en 5% CO2) voor cultuur en toekomstige experimenten.
    Opmerking: Trek de mal verticaal omhoog om te voorkomen dat nadelige gevolgen voor de gel-culturen. In het algemeen, moet middelgrote in gel culturen worden vervangen om 3-4 dagen. Wees voorzichtig niet te hydrogels gecombineerd bij het verwijderen van medium. Als dit een probleem is, is het raadzaam met behulp van een precisiepipet kunststof overdracht. Als bioluminescentie imaging als u wilt bijhouden celaantal is gepland, moeten GBM cellen worden transduced met lentivirus codering constitutively luciferase expressie voor inkapseling, als eerder beschreven3. Voor bioluminescentie imaging, 1 mM van D-luciferine aan kweekmedium 1 h vóór luminescentie imaging te toevoegen.

4. lysate voorbereiding voor het westelijke bevlekken

  1. Chill 1,5 mL microcentrifuge buizen op het ijs (1 per gel monsters). Cool centrifuge tot 4 ° C.
  2. Medium verwijderen goed platen. Pipetteer gels in prechilled microcentrifuge buizen.
  3. Voeg 100 µL van RIPA buffer met 1 x protease/phosphatase inhibitors.
  4. De gel met een 1 mL injectiespuit met een naald van 20 G, breken door het hele mengsel erdoor naald minstens 20 keer.
  5. De flits spin het monster met behulp van de bovenste microcentrifuge van de Bank en plaats het monster terug op het ijs.
  6. Vortex monsters kort elke 5 min voor een totaal van 20 min.
  7. Centrifugeer steekproeven bij 14000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
  8. Supernatant overdragen aan nieuwe, vooraf gekoeld microcentrifuge buizen en opgeslagen bij-20 ° C (korte termijn) of en -80 ° C (lange termijn). Voer de Elektroforese van het gel met behulp van standaardprocedures, als eerder beschreven3.

5. het uitpakken van afzonderlijke cellen van Hydrogel culturen voor stroom Cytometry

  1. Verwijder medium en overdracht gel cultuur (uit stap 3.11) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
  2. Incubeer gel met 500 µL van cel dissociatie enzym (bijvoorbeeld TrypLE Express) bij 37 ° C gedurende 5 minuten, af en toe flicking de buis te doorroeren.
  3. Breng het mengsel in een centrifugebuis 50 mL met 5 mL van volledige medium. Plaats de buis op ijs.
  4. Bevestig een naald van 20G op een 10 mL spuit. Trek voorzichtig de celsuspensie omhoog en omlaag door de naald 8 keer.
  5. Het mengsel doorstromen met 70 µm cel zeef in een nieuwe centrifuge-tube van 50 mL. Een extra 5 mL van volledige medium door de zeef voor het verzamelen van alle resterende cellen toepassen.
  6. Centrifugeer het monster bij 400 x g voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in gewenste buffer voor stroom cytometry (via standaardprotocollen3).

6. cryopreservatie van Hydrogels voor het segmenteren

  1. Verwijder medium van de gel culturen (uit stap 3.11).
  2. Gel culturen met 2 mL 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
    Let op: PFA is giftig en moet voorzichtig worden omgegaan.
  3. Verwijder de volgende dag, PFA. Voeg 2 mL 5 gewichtspercenten sacharose in PBS tot gels en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. 5% sacharoseoplossing vervangen door 2 mL 20% sacharose in PBS en incubeer gedurende 30 min.
  5. Sacharoseoplossing vervangen door 2 mL vers 20 gewichtspercenten sacharose in PBS en incubeer gedurende een extra 30 min.
  6. Voor de derde keer, door de sacharoseoplossing te vervangen door 2 mL vers 20 gewichtspercenten sacharose in PBS. Bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
  7. Bereiden 20 gewichtspercenten sacharose in optimale snijden temperatuur (OCT) omheind.
    Opmerking: Als gevolg van de viscositeit van LGO, ontbinding van sacharose kan duren enkele tijd (tot overnachting). Het is raadzaam om het mengsel op een shaker plaatsen tijdens ontbinding te handhaven van agitatie.
  8. De volgende dag, verwijder de 20% sacharoseoplossing en zachtjes giet de 20 gewichtspercenten sacharose in OCT oplossing de gel. Zorg ervoor dat ter dekking van de hele gel. Incubeer bij 4 ° C gedurende 3 uur.
  9. Breng de gel in het midden van een insluiten schimmel met behulp van een grote, platte spatel; Dit moet zorgvuldig gebeuren om te voorkomen beschadiging van de gel.
  10. Cool 2-methylbutane binnen een cryochamber met een overmaat van droogijs.
  11. Vul de insluiten schimmel met zuivere LGO (geen sacharose). Vul tot net onder de bovenrand van de schimmel.
  12. Bevriezen van de hydrogel monster door onderdompeling in gekoelde 2-methylbutane en dan verder te segmenteren.
  13. Afdeling van het monster met behulp van een cryostaat; sectie dikte van 10-18 µm en vectorafbeeldingsbestanden temperatuur van rond de-26 ° C worden aanbevolen.
  14. Standaard immunokleuring procedures uitvoeren op verdeelde gel cultuur, als vroeger beschreven3.
    Opmerking: PFA heet irriterend en kankerverwekkend. Gelieve te behandelen en gooi PFA volgens plaatselijk geldende normen en voorschriften.

7. totale RNA extractie van monsters in Hydrogel

Opmerking: Hier, beschrijven we een protocol met behulp van een commerciële kit (Zie de tabel van materialen) om het totale RNA uittreksel uit hydrogel gekweekte cellen. De buffers en al het materiaal zijn beschikbaar binnen de kit gebruikt.

  1. Verwijder kweekmedium. Gebruik een pipet P1000 overdracht met wide-boring tip de hydrogel cultuur overbrengen naar 1,5 mL microcentrifuge buis.
  2. Voeg 350 µL van buffer RLT aan de hydrogel cultuur.
  3. Met behulp van een naald van 20 G verbonden met een spuit van 1 mL, versnipperen de gel door het hele mengsel erdoor naald minstens 20 keer.
  4. Breng het hele mengsel in een kolom van de homogenizer in een tube van 2 mL collectie geplaatst. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 2 minuten.
  5. Breng de bovendrijvende substantie in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis. Wees voorzichtig niet te verstoren, de neerslag van de gel op de bodem.
  6. Meng het lysate monster met 350 µL van 100% ethanol. Alle het monster overbrengen in een spin kolom (uit de kit) plaats in een tube van 2 mL collectie. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 13.000 x g.
  7. Voor volgende stappen voor RNA zuivering voor PCR, volg het algemeen protocol geleverd door de fabrikant van de kit.
    Opmerking: Zodra RNA is uitgepakt, standaardprotocollen voor PCR inzetbaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor elke partij van thiolated HA, moet de mate van thiolation worden geverifieerd met behulp van H1-NMR of van een Ellman test. HA wijziging volgens de procedure hier consequent genereert ~ 5% thiolation (gedefinieerd als de molaire verhouding van thiolen naar HA disachariden) (Figuur 1).

Opzetten van deze nieuwe cultuur platform vergt elk laboratorium om strenge testen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Generatie van reproduceerbare gegevens met behulp van dit systeem 3D cultuur vereist: 1) consistent-charges-thiolation van de HA, 2) de praktijk te komen tot efficiënte mengen van hydrogel precursoren en behandeling van hydrogel culturen om schade te voorkomen en 3) geoptimaliseerd zaaien dichtheid voor elke regel van de cel gebruikt.

Wanneer een bepaald gewicht percentage van HA in de hydrogel gewenst is, bepaalt de mate van thiolation van HA de dwarslijn dichtheid. Het is raadzaam om met beh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund met middelen uit de NIH (R21NS093199) en de UCLA ARC 3R's Award. Onze oprechte dank gaat uit naar het laboratorium van Dr. Harley Kornblum voor bepaling van de cellijnen HK301 en HK157. Wij danken ook UCLA weefsel pathologie Core laboratorium (TPCL) voor cryosectioning, geavanceerde licht microscopie/spectroscopie kern faciliteit (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) aan de UCLA voor gebruik van de confocal microscoop, UCLA Crump Instituut voor Moleculaire beeldvorming voor het gebruik van IVIS imaging systeem, UCLA moleculaire Instrumentation Center (MIC) voor het verstrekken van magnetische resonantie spectroscopie en Stroom Cytometry kern in Jonsson uitgebreide Cancer Center (JCCC) aan de UCLA voor het verstrekken van instrumentatie voor stroom Cytometry.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
pH meterThermo FisherN/AElk pH meter dat pH 2-10 gevoeligheid heeft
Stir plateThermo FisherN/AAlgemeen laboratoriumapparatuur
Erlenmeyer kolf (125mL)Thermo FisherFB-501-125
DialysebuizenThermo Fisher21-152-14
2L polypropyleen bekerThermo FisherS01916
natriumhyaluronaatLifecoreHA700k-5500-750 kDa bereik
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo FisherPI-22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)sigma aldrich130672-5G
Zoutzuur (HCl)Thermo FisherSA48-500
Natriumhydroxide (NaOH)Thermo FisherSS266-1
Cystamine dihydrochlorideThermo FisherAC111770250
Dithioltreitol (DTT)Thermo FisherBP172-25
Ellman's testreagens (5-(3-Carboxy-4-nitrofenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoëzuurSigma AldrichD218200-1G
Gedeutereerd water (deuteriumoxide)Thermo FisherAC166301000
0,22µm vacuüm gedreven filterCellTreat229706
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Thermo FisherP32080-100T
Hanks' balanced salt zoutoplossing (HBSS)Thermo FisherMT-21-022-CV
4-arm-PEG-maleimideJenKem TechnologyA7029-1moleculair gewicht rond de 20kDa
4-arm-PEG-thiolJenKem TechnologyA7039-1moleculair gewicht rond de 20kDa
L-Cysteine sigma aldrichC7880-100G
RGD ECM mimetisch peptideGenscript BiotechN/AAangepast peptide met de sequentie "GCGYGRGDSPG", N-terminaal moet worden geacetyleerd
Siliconen mallenSigma AldrichGBL664201-25EAGebruik een scheermes om in afzonderlijke stukken te snijden
Volledig kweekmediumVerschillendeVerschillendeDMEM/F12 (Thermofisher) met non-serum supplement (G21 van GeminiBio), epidermale groeifactor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast groeifactor 20ng/mL (Pepro Tech) en hepraine 25µg/mL (Sigma Aldrich), kweekmedium varieert in verschillende labs
Door patiënten afgeleid GBM-celN/AN/A
20G naaldBD medical305175
1mL spuitThermo Fisher14-823-434
10mL spuitBD medical302995
RIPA BufferThermo FisherPI-89901
Protease/fosfatase remmer mini tabletsigma aldrich5892970001
Vortex shakerThermo Fisher12-814-5Q
TrypLE expressThermo Fisher12604013
70µm celzeefThermo Fisher22-363-548
ParaformaldehydeThermo FisherAC416785000Los 4% (w/v) op in PBS, houd pH 7,4
D-sucroseThermo FisherBP220-1
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compoundThermo FisherNC9373881
CelkweekincubatorThermo FisherN/AElke algemene met 5% CO2 en 37C
Koel-/vriescombinatieThermo FisherN/AElke algemene laboratoriumapparatuur met -20C en -80C capaciteit
Wegwerp inbeddingsmalenThermo Fisher12-20
LyofiliseerpistolenLabconcoN/AElke -105C vriesdroogmachine
HEPESThermo FisherBP310-500
Amber flesjeKimble Chase60912D-2
Pipettipuntjes met brede openingThermo Fisher9405120
2-methylbutaanThermo Fisher03551-4
DroogicN/AN/A

Referenties

  1. Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
  2. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  3. Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
  4. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  5. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
  6. Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
  7. Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
  8. Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
  9. Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. Role of hyaluronan in glioma invasion. Cell adhesion & migration. 2 (3), 202-207 (2008).
  10. Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
  11. Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
  12. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  13. Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
  14. Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
  15. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
  16. Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
  17. Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201(2015).
  18. Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
  19. Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
  20. Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
  21. Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
  24. Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
  25. Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327(2014).
  26. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  27. Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
  28. Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
  29. Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
  30. Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
  31. Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
  32. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hyaluronzuurhydrogels3D-celkweekhydrogel-crosslinkingcelencapsulatieflowcytometriewestern blottingcryosectieECM-mimetische peptidenglioomsfeerkweek
Hyaluronzuur gebaseerd Hydrogels voor 3-dimensionale cultuur van Glioblastoma patiënt-afgeleide cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.