Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

Samenvatting

We beschrijven drie experimentele methoden voor de evaluatie van de activiteit van de verdikking van chemische stoffen in vitro: kwantificering van 1) cellulaire tyrosinase-activiteit en 2) melanine inhoud, en 3) meting van melanine door cellulaire melanine kleuring en beeld-analyse.

Samenvatting

Deze studie presenteert laboratoriumtechnieken voor de kwantificering van hypopigmentatie activiteit in vitro. Melanine, de grote pigment in de melanocyten, wordt gesynthetiseerd in reactie op meerdere factoren voor cellulaire en milieu. Melanine beschermt de huidcellen tegen ultraviolet schade, maar heeft ook biofysische en biochemische functies. Buitensporige productie of ophoping van melanine in de melanocyten kan leiden tot dermatologische problemen, zoals sproeten, donkere vlekken, melasma en mollen. Daarom is de controle van melanogenesis met hypopigmentatie agenten is belangrijk bij personen met klinische en cosmetische behoeften. Melanine is hoofdzakelijk gesynthetiseerd in de melanosomes van melanocyten in een complexe biochemische proces genaamd melanogenesis, die wordt beïnvloed door Extrinsieke en intrinsieke factoren, zoals hormonen, ontsteking, leeftijd en blootstelling aan ultraviolet licht. We beschrijven drie methoden om te bepalen van de activiteit van de verdikking van chemicaliën of natuurlijke stoffen in de melanocyten: meting van de 1) cellulaire tyrosinase-activiteit 2) melanine inhoud, en 3) kleuring en kwantificering cellulaire melanine met afbeelding analyse.

In melanogenesis katalyseert tyrosinase de snelheidslimieten stap dat L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (levodopa) en vervolgens naar dopaquinone converteert. Daarom is de remming van tyrosinase een primaire hypopigmentatie mechanisme. In gekweekte melanocyten, kan tyrosinase-activiteit worden gekwantificeerd door levodopa als een substraat toe te voegen en het meten van de dopaquinone productie door spectrofotometrie. Melanogenesis kan ook worden gemeten door het kwantificeren van de melanine inhoud. De melanine bevattende cellulaire fractie wordt geëxtraheerd met NaOH en melanine spectrophotometrically wordt gekwantificeerd. Tot slot kan de melanine inhoud worden gekwantificeerd door beeldanalyse na Fontana-Masson kleuring van melanine. Hoewel de resultaten van deze in-vitrotests kunnen niet altijd worden gereproduceerd in de menselijke huid, worden deze methoden veel gebruikt in melanogenesis onderzoek, met name als de eerste stap om te identificeren van potentiële hypopigmentatie activiteit. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de melanocyt activiteit, groei en differentiatie. Consistente resultaten met de drie verschillende methoden zorgen de geldigheid van de effecten.

Inleiding

Melanine speelt een cruciale rol in de fysiologie, pathologie en toxicologie van verscheidene organen waaronder de huid, ogen en hersenen¹. Belangrijkste functies van melanine zijn foto-screening en biochemische effecten. Melanine absorbeert nabij-infrarood en zichtbaar licht, alsmede ultraviolette (UV) straling, met verhoogde absorptie tarieven bij kortere golflengten van het licht; melanine beschermt dus weefsels tegen schade veroorzaakt door zichtbaar licht of UV straling². Melanine is een antioxidant en heeft een affiniteit voor metalen en andere giftige chemische stoffen; het kan daarom weefsels beschermen tegen oxidatieve en chemische stress³. De overmatige productie van melanine veroorzaakt echter dermatologische problemen.

De kwantiteit en kwaliteit van melanine in de huid en iris zijn de belangrijkste determinanten van de kleur van de iris en de huid. Individuen kunnen hebben verschillende huid kleurvoorkeuren; enkele gunst gebruinde huid, terwijl anderen het voordeel van lichtere kleuren van de huid. Afhankelijk van deze consument profielen, zijn hypopigmentatie cosmetica ontwikkeld om te voldoen aan individuele markten voor favoriete huid kleuren⁴. Dienovereenkomstig, zijn studies van hypopigmentatie en anti-melanogenic activiteiten belangrijk, zowel wetenschappelijk als praktisch.

Melanogenesis is het complexe proces van melanine biosynthese door middel van een reeks van enzymatische en spontane chemische reacties in de melanocyten. Een melanocyt wordt omgeven door ongeveer 36 keratinocyten en melanocyten zijn de melanine synthese fabrieken die verspreiden van hun product aan naburige keratinocyten. In de huid, wordt de melanine geproduceerd en opgeslagen in het compartiment van de melanosomal van melanocyten getransporteerd naar naburige keratinocyten in de opperhuid via dendrites.

L-Tyrosine serveert de eerste substraat voor melanogenesis en het enzym tyrosinase katalyseert twee opeenvolgende reacties die L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en vervolgens naar dopaquinone converteren. Deze reacties zijn de snelheidslimieten stap in melanogenesis^5,6. Dienovereenkomstig, hypopigmentatie activiteit kan eerst worden gemeten door cellulaire tyrosinase-activiteit rechtstreeks te bepalen. Om dit te doen, melanocyt extracten met tyrosinase worden geïncubeerd met DOPA en de dopaquinone geproduceerd in de monsters kan worden gemeten door spectrofotometrie op 475 nm. De waarden zijn genormaliseerd door de concentraties van de eiwitten van de monsters, alsmede stoffen met hypopigmentatie activiteit resultaat in minder vorming van de dopaquinone vergeleken met besturingselementen.

Ten tweede, hypopigmentatie activiteit kan worden gekwantificeerd door het meten van melanine in gekweekte melanocyten direct. Na behandeling van cellen met het testmateriaal, melanine wordt gewonnen onder alkalische omstandigheden en de melanine inhoud wordt gekwantificeerd door spectrofotometrie bij 400 nm. Een verdikking agent zal resulteren in een lagere melanine inhoud dan de besturingselementen⁷.

Tot slot, de verdikking activiteit kan worden gekwantificeerd door Fontana-Masson melanine kleuring en latere beeldanalyse. Melanine korrels Verlaag ammoniak-zilvernitraat aan een zwarte metalen zichtbaarheidsstatus in Fontana-Masson kleuring, en de zwarte gebieden van cellen in de microscopische beelden vertegenwoordigen de hoeveelheid melanine.

Een verdikking agent geeft meestal consistente en vergelijkbare resultaten met deze drie methoden, die bevestigt dat de activiteit van de stof geldig is. Anderzijds kan het zinvol zijn om te meten de uitdrukking van essentiële genen en proteïnen in melanogenesis naar aanleiding van een teststof te onderzoeken van hypopigmentatie activiteit. Naast tyrosinase zijn tyrosinase-gerelateerde eiwitten (TRP-1) en dopachrome tautomerase (TRP-2) essentiële enzymen in melanogenesis⁸. De transcriptie factor microphthalmia-geassocieerde transcriptiefactor (MITF) is een meester regelgever in melanogenesis en kwantificering van de gene/proteïne expressie niveaus of een promotor activiteit assay kan ook worden gebruikt om te beoordelen van hypopigmentatie activiteit.

Protocol

1. bereiding van Medium, verbindingen en reagentia

1. B16F10 groeimedium volledig voor te bereiden. De aanvulling Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (PEST).
   1. Meng om 500 mL van volledige medium, 445 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 50 mL FBS en 5 mL van de PEST in een gesteriliseerde 1 L-fles. Na het mengen zachtjes, filtreer het medium door een 0,2-µm fles-top-filter naar een nieuwe gesteriliseerde glazen fles en vervolgens bewaren bij 4 ° C.
      Let op: Alle cel cultuur technieken moeten worden genomen in de microbiologische veiligheid kabinet met behulp van aseptische techniek om steriliteit.
2. Lysis-buffermengsel bereiden: 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane met 0,1% Triton X-100 (v/v) buffer met een pH 7.5 (pH aangepast met HCl). Deze buffer kan worden gebruikt voor 3 maanden toen bewaard bij kamertemperatuur (RT). Proteaseinhibitors toevoegen aan de lysis-buffermengsel vlak voor gebruik.
3. Bereiden tyrosinase-remmer bepaling buffer. 1 M NaH₂PO₄ (monobasisch) en 1 M Na₂HPO₄ (dibasische) stamoplossingen voorbereiden. Meng 46.3 mL nb₂HPO₄ en 53,7 mL NaH₂PO₄ te bereiden een eindvolume van 0,1 M fosfaatbuffer sodium (pH 6.8).
   1. Verdun het resulterende mengsel 1 L (eindvolume) met H₂O. aanpassen de pH van de definitieve oplossing voor de 6,8. Deze buffer kan worden gebruikt voor 1 maand wanneer opgeslagen bij 4 ° C.
4. Bereid tyrosinase substraat oplossing: 0,1% 3,4-dihydroxy-L-fenylalanine (DOPA, w/v) opgelost in tyrosinase-remmer bepaling buffer (zie stap 1.3).
   Let op: Houd op ijs terwijl in gebruik.
5. Optioneel, bereiden 100 U/mL paddestoel tyrosinase. Los van het gelyofiliseerd paddestoel tyrosinase in tyrosinase-remmer bepaling buffer. Deze oplossing kan worden aangewend voor 2 maanden wanneer opgeslagen bij –20 ° C. De paddestoel tyrosinase-activiteit, evenals de cellulaire tyrosinase-activiteit worden in aanwezigheid van cel materialen berekend.
   Let op: De oplossing is aliquoted voordat dus bevriezen herhaald invriezen en ontdooien kan worden vermeden. Bewaar deze oplossing op ijs terwijl in gebruik.
6. Bereiden 1 N NaOH oplossing. Weeg 4 g van NaOH in een maatkolf en ontbinden in gedestilleerd water te maken van 100 mL.
7. Bereid fixatie-oplossing (10% formaline). Verdun 27 mL van 37% formaldehyde met 73 mL gedestilleerd water. Dagelijks vers bereid.
8. Ammoniakale zilveroplossing voorraad voor te bereiden. Bereiden 5 mL 10% zilvernitraat, oplossing in een maatkolf. Voeg ammoniumhydroxide-oplossing ontkleuring, totdat het neerslag volledig is opgelost. Voeg 200 l zilvernitraatoplossing (10%). De oplossing wordt licht bewolkt.
   Let op: Vermijd contact en inhalatie. Gebruik een zuurkast.
9. Bereiden ammoniakale zilveroplossing werken. Verdun 2,5 mL ammoniakale zilveroplossing voorraad met 7,5 mL gedestilleerd water. Één keer gebruiken en vervolgens verwijderen.
   Let op: Vermijd contact en inhalatie. Gebruik een zuurkast.
10. 0,1% goud chloride bereiden. Bereiden 1 mL 10% goud chloride en 99 mL gedestilleerd water toe te voegen in een maatkolf. Dagelijks vers bereid.
11. Bereiden fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). Voeg 8 g NaCl, 0.2 g van KCl, 1,44 g nb₂HPO₄ en 0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL gedestilleerd water. Breng de pH op 7.4 met HCl. Dilute het resulterende mengsel 1 L (eindvolume) met gedestilleerd water.
12. Bereid natrium thiosulfate-oplossing van 5% (m/v) opgelost in gedestilleerd water.

2. cel cultuur en behandeling

1. Verkrijgbare B16F10 cellen worden gebruikt. De B16F10 cellen in volledige medium handhaven. Houd de cel cultuur kolf in een bevochtigde, 5% CO₂ sfeer incubator bij 37 ° C.
2. Test verbindingen, positieve controle van de Inhibitor van de omwenteling, en negatieve controlemonsters voorbereiden.
   1. Los van de verbindingen van de test in de geschikte oplosmiddelen. Ontbinden wateroplosbare verbindingen in tweemaal gedestilleerd water. Water onoplosbare stoffen in passende organisch oplosmiddel, bijvoorbeeldontbinden., DMSO.
   2. Hier, gebruik Arbutine als positieve controle op de activiteiten van de verdikking in vergelijking met test verbindingen of een negatieve controle beoordelen in tweemaal gedestilleerd water (125 μg/mL) opgelost. Als een negatieve controle (voertuig-behandeld), gebruik maken van de oplossingen of buffers gebruikt in het monster, bijvoorbeeld, tweemaal gedestilleerd water, DMSO, ethanol.
3. Cel zaaien en behandeling
   1. Zaad B16F10 cellen op 5 × 10-⁴ cellen per putje in 24-well cultuur platen met volledige medium en broeden in een CO₂ incubator gedurende 24 uur. Na incubatie, gecombineerd het volledige medium.
   2. Incubeer de cellen met medium van de DMEM (zonder FBS en 1% penicilline/streptomycine) dat test verbindingen, een inhibitor van de omwenteling-besturingselement, of een negatieve controle in een CO₂ incubator voor 72 h. selectievakje cellen elke 24 uur onder de Microscoop. Na deze stap, ga naar stap 3-5 voor verdere experimenten.
      Let op: Het mengsel van de teststof en DMEM medium moet worden gefilterd door een filter van 0,2 micrometer.

3. meting van de cellulaire Tyrosinase-activiteit

1. Met behulp van de methode beschreven in stap 2, verwijderen van media en spoel tweemaal met 300 μL van koude PBS cellen.
2. Plaats de cel cultuur plaat op ijs. Voeg 300 μL van lysis buffer en incubeer gedurende 5 min. Vervolgens verzamelen de lysate met behulp van een cel schraper cel en de cel lysate overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis.
3. Meng de cel lysate met een homogenizer van de cel bij 14.500 TPM voor 2 s, 3 keer op ijs te verkrijgen van intracellulaire tyrosinase. Gebruik de optimale conditie specifiek voor de homogenizer.
4. Centrifugeer gedurende 10 min bij 12.000 × g bij 4 ° C en de cel supernatant overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis. Houd op ijs terwijl in gebruik.
5. 70 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een 96-Wells duidelijk polystyreen microplate.
6. Toevoegen van 140 μL van een oplossing met tyrosinase substraat (DOPA) naar een 96-Wells duidelijk polystyreen microplate, schud voorzichtig en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
7. Optioneel, 70 μL van 100 U/mL paddestoel tyrosinase oplossing toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
8. Meten van de tyrosinase-activiteit bij een golflengte van 475 nm met behulp microplate-lezer.
9. Normaliseren de tyrosinase-activiteit aan de eiwitconcentratie van elk monster. Meet de eiwitconcentratie van elk monster door een analyse van Bradford.

4. meten van melanine inhoud

1. Met behulp van de methode die is beschreven in stap 2, verwijderen van media en spoel tweemaal met 300 μL van koude PBS cellen.
2. Plaats de cel cultuur plaat op ijs. Voeg 300 μL van lysis buffer en incubeer gedurende 5 min. Vervolgens verzamelen de lysate met behulp van een cel schraper cel en de cel lysate overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis.
3. Centrifugeer gedurende 10 min bij 12.000 × g bij 4 ° C.
4. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en maatregel totaal eiwitconcentratie voor normalisatie. Meet de eiwitconcentratie van elk monster door een analyse van Bradford.
5. 300 μL van 1 N NaOH toevoegen aan elke pellet en Incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur.
6. Centrifugeer de opgeloste oplossing voor 10 min bij 12.000 × g bij 4 ° C.
7. 200 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een 96-Wells-microplate.
8. Meten van de melanine inhoud bij een golflengte van 400 nm.
9. Normaliseren van de melanine inhoud aan de eiwitconcentratie.

5. Fontana – Masson kleuring

1. Fontana-Masson kleuring
   1. Wassen cellen tweemaal met 300 μL van koude PBS.
   2. 200 μl van 10% formaline toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
   3. Spoelen met gedistilleerd water.
   4. Voeg 200 μl voorverwarmde ammoniumstikstof zilver werkoplossing en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, of totdat de cellen geel/bruin van kleur worden.
      Let op: Plaats van vers gemengde ammoniumstikstof zilveren werkoplossing in een waterbad 58-60° C en laat voldoende tijd voor de temperatuur equilibreer.
   5. Verwijder ammoniumstikstof zilver werkoplossing en naspoelen met gedestilleerd water.
   6. Verwijder gedestilleerd water. Voeg 200 μL van 0,1% goud chloride en incubeer gedurende 2 min op RT.
   7. Verwijderen van 0,1% goud chloride oplossing en naspoelen met gedestilleerd water.
   8. Verwijder gedestilleerd water. Voeg 200 μL van natrium thiosulfate oplossing (5%, w/v) en incubeer gedurende 2 min.
   9. Verwijderen van natrium thiosulfate oplossing en naspoelen met gedestilleerd water.
   10. Verwijder gedestilleerd water. Voeg 200 μL van nucleaire snel rood en incubeer gedurende 5 min.
   11. Verwijderen van nucleaire snel rood en spoel met leidingwater.
   12. Verwijderen van leidingwater en observeren van de gekleurde cellen onder een microscoop.
2. Fontana-Masson kleuring (drempel analyse met behulp van ImageJ)
   Opmerking: Een voorbeeld van het imago-analyseprocedure ImageJ softwarematig wordt weergegeven in de aanvullende materialen.
   1. Open het programma ImageJ.
   2. Selecteer bestand | Open | Microscoop afbeelding.
   3. Selecteer afbeelding | Aanpassen | Kleur drempel.
   4. Voor het meten van het gebied dat is gekleurd met Fontana – Masson, de lat helderheid parameter op nul en aanpassen van de helderheid-balk om te zoeken naar het punt waarop alle gekleurde cellen (zwart of donker bruin) opgenomen.
   5. Selecteer analyseren | Analyseren van deeltjes. Schakel het selectievakje samenvatten in het venster van de deeltjes analyseren en druk op OK. Het summiere resultaat verkrijgen en plak in een werkblad.
      Opmerking: De beschrijving van de resulterende vak parameters zijn als volgt:
      Segment: Naam van elke afbeelding
      Aantal: Aantal gekleurde cellen
      Totale oppervlakte: Totale oppervlakte van de getelde cellen
      Gemiddelde grootte: Totale gebied/Count
      % Gebied: gekleurd gebied/totaal gebied × 100%; totale oppervlakte wordt automatisch berekend.
   6. Bereken de relatieve gebied gekleurd met melanine met behulp van de waarde van de totale oppervlakte.
      Relatieve melanine gekleurd gebied (%) = waarde van cellulaire oppervlakte van test sample/gemiddelde oppervlakte van controle × 100, dat wil zeggen,

Resultaten

Representatieve resultaten voor de activiteit van de verdikking van de Arbutine, een anti-melanogenic samengestelde, in B16F10 melanocyten staan hieronder. Figuur 1A blijkt dat Arbutine sterk onderdrukt de cellulaire tyrosinase-activiteit in vergelijking met de controle van voertuig-behandeld. Ook was de melanine inhoud van cellen gestimuleerd met Arbutine aanzienlijk verminderd in vergelijking met de besturingselementen (figuur 1B

Discussie

Wij presenteerden protocollen voor de beoordeling van de activiteit van de verdikking van de test verbindingen met behulp van gekweekte melanocyten. De representatieve resultaten toonde het effect van de verdikking van de Arbutine, een tyrosinase-remmer die geremd tyrosinase-activiteit en cellulaire melanine inhoud. Deze methoden worden veel gebruikt in anti-melanogenic activiteit onderzoek. Met behulp van deze tests, hebben we ook met succes verschillende bioactieve stoffen die melanogenesis remmende effecten op B16F10 ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU