Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Saccharomyces cerevisiae cellen in de exponentiële fase groei hun wordt aangewezen door het produceren van ATP door middel van fermentatie en/of mitochondriaal ademhaling. De fermenteerbare koolstofconcentratie regelt voornamelijk hoe de gistcellen genereren ATP; Dus, de variatie in fermenteerbare koolhydraten niveaus rijdt de energetische stofwisseling van S. cerevisiae. Dit witboek beschrijft een methode van de high-throughput gebaseerd op exponentiële gist groei te schatten van de effecten van veranderingen van de concentratie en de aard van de koolstofbron op ademhalings- en fermenterende metabolisme. De groei van S. cerevisiae is gemeten in een microplate of geschud conische kolf door bepaling van de optische dichtheid (OD) op 600 nm. Vervolgens is een groeicurve gebouwd door plotting OD tegen de tijd, waardoor identificatie en selectie van de exponentiële fase, en is uitgerust met de vergelijking van exponentiële groei te verkrijgen van de kinetische parameters. Lage specifieke groeisnelheden met hogere verdubbeling keer vertegenwoordigen in het algemeen een respiratoire groei. Daarentegen geven hogere specifieke groeisnelheden met lagere verdubbeling keer fermenterende groei. Drempelwaarden van een verdubbeling van de tijd en de specifieke groeisnelheid worden geschat met behulp van bekende respiratoire of fermenterende aandoeningen, zoals niet-fermenteerbare koolstof bronnen of hogere concentraties van fermenteerbare suikers. Dit percentage wordt verkregen voor elke specifieke soort. Tot slot worden de berekende kinetische parameters vergeleken met de drempelwaarden vast te stellen of de gist fermenterende en/of respiratoire groei toont. Het voordeel van deze methode is de relatieve eenvoud voor inzicht in de effecten van een stof/samengestelde op fermenterende of luchtwegen metabolisme. Het is belangrijk om te benadrukken dat groei een ingewikkelde en complexe biologische proces is; Daarom moet de voorlopige gegevens van deze methode worden bevestigd door de kwantificering van zuurstofverbruik en accumulatie van bijproducten van gisting. Daarmee is deze techniek kan worden gebruikt als een oriënterende van verbindingen/stoffen die kunnen storen of verbetering van fermenterende of luchtwegen metabolisme.
Inleiding
Saccharomyces cerevisiae groei heeft gediend als een waardevol instrument te identificeren van tientallen fysiologische en moleculaire mechanismen. Groei is gemeten voornamelijk op drie manieren: seriële verdunningen voor ter plaatse testen, kolonie-vormende unit tellen en groeikrommes. Deze technieken kunnen alleen of in combinatie met een verscheidenheid aan substraten, omgevingsfactoren, mutanten en chemicaliën te onderzoeken specifieke antwoorden of fenotypen worden gebruikt.
Mitochondriale ademhaling is een biologisch proces waarin groei kinetiek met succes toegepast is voor het ontdekken van onbekende mechanismen. In dit geval de suppletie van groei media met niet-fermenteerbare koolstof bronnen zoals glycerol, lactaat of ethanol (die uitsluitend worden gemetaboliseerd door mitochondriale ademhaling), omdat de enige bron van koolstof en energie voor de evaluatie van zorgt de respiratoire groei, die belangrijk is voor de opsporing van verstoringen in oxidatieve fosforylatie activiteit1. Aan de andere kant, is het ingewikkeld om groei kinetische modellen te gebruiken als een methode voor het ontcijferen van de mechanismen achter gisting.
De studie van gisting en mitochondriale ademhaling is essentieel voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen achter bepaalde fenotypen zoals de Crabtree en Warburg effecten2,3. Het effect van de Crabtree wordt gekenmerkt door een toename van glycolytic flux, onderdrukking van mitochondriale ademhaling, en de oprichting van gisting als de primaire route voor het genereren van ATP in aanwezigheid van hoge concentraties van fermenteerbare koolhydraten (> 0,8 mM)4,5. Het Warburg effect is metabolisch analoog naar de Crabtree-effect, met het verschil dat bij zoogdiercellen het belangrijkste product van de gisting lactaat6 is. Inderdaad, het Warburg effect wordt tentoongesteld door een verscheidenheid van kankercellen, triggering van de glucose-opname- en consumptie zelfs in aanwezigheid van zuurstof7. Aldus, heeft bestuderen van de moleculaire basis van de overstap van ademhaling om gisting in het effect van de Crabtree zowel de biotechnologische gevolgen (voor de productie van ethanol) en de potentiële effecten in kankeronderzoek.
S. cerevisiae groei mogelijk een geschikt hulpmiddel om te bestuderen van de Crabtree en Warburg effecten. Dit idee is gebaseerd op het feit dat in de exponentiële fase van gist, de centrale trajecten gebruikt voor de productie van ATP zijn mitochondriale ademhaling en gisting, die essentieel is om groei te ondersteunen. Bijvoorbeeld, is de groei van S. cerevisiae nauw verwant met de functie van ATP genererende trajecten. In S. cerevisiae, de mitochondriale ademhaling produceert ongeveer 18 ATP-moleculen per molecuul glucose, overwegende dat vergisting alleen 2 ATP-moleculen genereert, vandaar de verwachting is dat de groei nauwe banden met de stofwisselingsroutes heeft het produceren van ATP8. In dit opzicht, wanneer de gisting is de belangrijkste route voor het genereren van ATP, compenseert de gist de lage productie van ATP door het optrekken van het steunpercentage van de glucose-opname. Integendeel, is de glucose consumptie door gistcellen die gebruikmaken van mitochondriale ademhaling als de hoofdbron van ATP laag. Dit geeft aan dat het belangrijk is voor de gist om zin koolhydraten beschikbaarheid voordat er wordt bepaald hoe ATP zal worden gegenereerd. Dus, de beschikbaarheid van glucose speelt een belangrijke rol in de switch tussen gisting en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae. In de aanwezigheid van grote hoeveelheden glucose verkiest de gist gisting als de centrale route voor het genereren van ATP. Interessant is dat wanneer de gist is fermenteren, wordt de specifieke groeisnelheid gehandhaafd op zijn maximum. Aan de andere kant onder lage niveaus van de glucose produceert S. cerevisiae ATP mitochondriale ademhaling, met behoud van lagere groeicijfers. Aldus, variatie in de concentratie van glucose en het gebruik van andere bronnen koolstof veranderingen bij de gist de voorkeur tussen fermenterende en respiratoire groei veroorzaken. Rekening houdend met dit feit met de vergelijking van exponentiële groei, kan men de biologische betekenis van kinetische parameters zoals de verdubbeling van de tijd (Dt) en specifieke groeisnelheid (µ) verkrijgen. Lagere waarden µ bleken bijvoorbeeld wanneer de gist mitochondriale ademhaling als het primaire traject gebruikt. Integendeel, onder voorwaarden die gisting gunst, hogere waarden µ bleken. Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van de waarschijnlijke mechanismen van elke chemische stoffen op het gebied van fermentatie en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae.
Het doel van deze paper is voor te stellen een methode gebaseerd op de kinetiek van de groei voor het screenen van de effecten van een bepaalde stof/samengestelde op mitochondriale ademhaling of gisting.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. cultuurmedia en entmateriaal voorbereiding
- Bereiden van 100 mL vloeibare voedingsbodem van 2% gist extract-pepton-dextrose (YPD) (1 g gist extract, caseïne pepton, 2 g en 2 g glucose aan 100 mL gedestilleerd water toevoegen). Breng 3 mL van de media in 15 mL steriliseerbare conische buizen. Autoclaaf de media gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C en 1,5 psi.
Opmerking: De media kunnen worden opgeslagen voor maximaal een maand bij 4-8 ° C. - Inoculeer een conische buis gevuld met 3 mL cool steriele 2% YPD bouillon met 250 μL van S. cerevisiae cellen bewaard in glycerol bij-20 ° C. Na een nacht bebroeden in een roteerschudapparaat bij 30 ° C met agitatie bij 200 omwentelingen per minuut.
- Streak in een petrischaal (60 x 15 mm2) gevuld met steriele 2% YPD agar (Voeg toe 10 g gist extract, caseïne pepton, 20 g 20 g glucose, en 20 g van bacteriologische agar aan 1000 mL gedestilleerd water) met de cellen die zijn geteeld in de conische buis met behulp van een steriele lus. Incubeer de petrischaal bij 30 ° C tot de geïsoleerde kolonies groei vertoont.
- Voorbereiding van de pre entmateriaal door het enten van een enkele geïsoleerde kolonie in een conische buis gevuld met 10 mL cool steriele 2% YPD Bouillon en Incubeer het 's nachts bij 30 ° C met continue agitatie bij 200 omwentelingen per minuut.
2. cultuurmedia en groeikrommes in Microplate
- Bereiden van 10 mL van de 1% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,1 g van glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen), 10 mL 2% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0.2 g glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen) , en 10 mL 10% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, pepton, 0.2 g en 1 g glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen). Autoclaaf deze groei mediums voor 15 min bij 121 ° C en 1,5 psi.
Opmerking: De voedingsbodems dient als een controle van fermenterende groei. - 10 mL van 2% gist extract-pepton-ethanol (YPE) Bouillon en 10 mL van 2% gist extract-pepton-glycerol (YPG) Bouillon voorbereiden. Voor 2% YPE: 0.1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,2 mL ethanol aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen. Voor 2% YPG: 0.1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,2 mL glycerol aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen. Autoclaaf deze groei mediums voor 15 min bij 121 ° C en 1,5 psi.
Opmerking: Glycerol en ethanol zijn bronnen van niet-fermenteerbare koolstof die uitsluitend worden gemetaboliseerd door mitochondriale ademhaling. Om deze reden worden ze gebruikt als een respiratoire groei-besturingselementen. In deze stap, kunnen de aard en de concentratie van koolstofbron in de cultuur-media worden gewijzigd om te testen van de effecten op groei fenotype met behulp van gist extract-pepton (YP) Bouillon (10 g gistextract en 20 g van caseïne pepton in 1000 mL gedestilleerd water) als basis. Om te testen de effecten van andere voedingsstoffen naast koolstof, wordt synthetische compleet (SC) medium aangevuld overeenkomstig het doel van het experiment. De basis voor SC medium is 1,8 g gist stikstof basis zonder aminozuren, 5 g ammoniumsulfaat [(NH4)2SO4], Mononatrium Fosfaat (NaH2PO4), 1.4 g en 2 g van drop-out mix in 1000 mL gedestilleerd water. Een aanvulling op de media met een koolstofbron en extra stikstofbron in de benodigde concentraties. - 145 μL van geschikte voedingsbodems voor de proefopzet toevoegen aan elk putje van een steriele microplate (10 x 10-well) met een deksel en enten ze met 5 μL van de pre entmateriaal.
Opmerking: Als het doel is om het scherm van de invloed van stoffen/verbindingen op de energetische stofwisseling van de gist, dat stof/samengestelde moet worden toegevoegd tijdens deze stap. Ook moet elk soort microplate met een deksel nuttig zijn. - Incubeer de multi goed plaat in een microplate lezer bij 30 ° C met constante agitatie bij 200 t/min voor 48 h. maatregel de optische dichtheid (OD) op 600 nm elke 30 of 60 min.
Opmerking: Als de microplate-lezer niet de optie om te broeden de microplate hoeft, kan het worden geïncubeerd in een roteerschudapparaat op dezelfde voorwaarden tussen elke meting van de OD.
3. groeikrommes in geschud erlenmeyers
- 4.8 mL van de geschikte voedingsbodems toevoegen aan 20 mL Erlenmeyerkolven en autoclaaf. Inoculeer elke kolf met 200 μL van de cultuur van de pre entmateriaal bij OD600nm ~ 2 in koele, steriele 2% YPD Bouillon. Incubeer hen bij 30 ° C met constante agitatie bij 250 omwentelingen per minuut gedurende 24 uur.
Opmerking: Als de incubatietijd hoger dan 24 h is, 12 mL van de geschikte voedingsbodems aan conische kolven van 50 mL en autoclaaf toevoegen. Inoculeer hen met 500 μL van de pre entmateriaal. Het is ook belangrijk om te overwegen de fermenterende groei (YP media met 1%, 2% of 10% glucose) en respiratoire groei besturingselementen (YP media met 2% glycerol of ethanol). - Neem 100 μl van de geschud erlenmeyer cultuur en Verdun het in 900 μL van gedistilleerd water in een cuvet van de spectrofotometer 1 mL en zachtjes Meng door pipetteren. Meten van de OD op 600 nm met behulp van een spectrofotometer elke 2 h. Voor het verkrijgen van de echte OD, vermenigvuldigt u het resultaat met tien.
4. verwerking van de gegevens en de berekening van de kinetische Parameters
-
Maak een nieuw projectbestand in het statistisch pakket-software. In de sectie van "nieuwe tabel en grafiek", de "XY" -optie te selecteren.
- Selecteer de optie: 'Start met een leeg gegevenstabel' in de sectie "Sample data" .
- Selecteer de "Punten en aansluitende lijn" type van de grafiek. De sectie van de "X" in het segment van de "Subcolumns voor replicatieonderzoeken of foutwaarden" uitgeschakeld laten, en in de "Y" sectie Kies de optie: "Voer (10) repliceren waarden in subcolumns naast elkaar en plot gemiddelde en fout SD". Klik op de knop maken.
Opmerking: De tabelindeling heeft een X-kolom en meerdere Y-kolommen, elk met de 10 subcolumns eerder gekozen.
- Schrijf de tijd op welke OD metingen werden genomen in de X-kolom (bijvoorbeeld 0, 30, 60, 90 min of 0, 1, 1.5, 2 h). In de Y-kolommen, schrijft de OD-waarden, verkregen uit de culturen.
- Het identificeren van de fase van de exponentiële groei de Y kolomgegevens omzetten in logaritmen. Klik op de knop "Analyseren" , kies het "Transformeren" -analyse, selecteer Y-waarden met behulp van Y = Log(Y). Ga naar de "Galerij van resultaten", selecteer "Transformeren" gegevenstabel, klikt u op "Analyseer" , en kies de "Lineaire regressie" analyse. Uitsluiten van de OD-waarden die een lineair gedrag niet volgen. Als u wilt uitsluiten van waarden, selecteert u deze in de gegevenstabel en typ "Ctrl + E".
Opmerking: Het is belangrijk om uit te sluiten van de waarden die niet de exponentiële fase, volgen omdat de exponentiële groei vergelijking goed bij de exponentiële fase past. - Selecteer de gegevenstabel in de "Gegevenstabellen galerij", "gegevens 1". Klik op de knop "Analyseren" en kies de "Niet-lineaire regressie (kromme fit)"-analyse onder de "XY analyses".
- Selecteer de volgende gegevensverzamelingen moeten analyseren en klik op de knop "OK" . Kies in het tabblad "Fit" de sectie "Exponentiële vergelijking" en selecteer de "exponentiële groei vergelijking" (, waar X cel concentratie is, X0 is cel concentratie tegelijkertijd nul μ is van de specifieke groeisnelheid, en t is tijd). Gebruiken van de "kleinste kwadraten" als een passende methode en de interpolate sectie uitgeschakeld laten. Klik op de knop "OK" .
Opmerking: Het tabblad met de niet-lineaire fit resultaten is in de "Galerij van resultaten". De software berekent verdubbeling tijd (Dt) en specifieke groeisnelheid (μ). De software toont μ als K op het tabblad resultaten. - Open een nieuw projectbestand en selecteer in de sectie "nieuwe tabel en grafiek" de kolom keuze. Kies de optie "Start met een leeg gegevenstabel" en selecteer de gewenste grafiek. Kiezen voor het uitzetten van het gemiddelde met de SD.-Selecteer de knop "Create" .
- De μ of Dt waarden uit het niet-lineaire fit resultaten tabblad dat is in de "Galerij van resultaten" kopiëren en plakken in een kolom. Tot slot Selecteer de knop "Analyseren" en kies de gewenste analyse in de sectie "Kolom analyses" om te vergelijken de kinetische parameters van de verschillende nutrimental voorwaarden.
Opmerking: De kinetische parameters verkregen de fermenterende groei besturingselementen (YP media met 1%, 2% of 10% glucose) en respiratoire groei besturingselementen (YP media met 2% glycerol of ethanol) helpt de drempel van fermenterende en mitochondriale ademhaling, stand respectievelijk. Vergelijken van de kinetische parameters van de voeding voorwaarde en stof/compound vehiculumcontrolegroep met de Ademhalings- en fermenterende groei helpen bij het identificeren van mogelijke effect op de luchtwegen of fermenterende metabolisme.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Groeikrommes kunnen worden gebruikt om preliminair discrimineren tussen ademhalings- en fermenterende fenotypen in de S. cerevisiae gist. Dus we batch culturen van S. cerevisiae (BY4742) uitgevoerd met verschillende glucose concentraties die zijn gemeld voor het opwekken van fermenterende groei: 1%, 2% en 10% (m/v)9. Culturen waaruit een fermenterende fenotype hebben een kleine vertraging-fase en een exponentiële fase met een hoog groeipercentage ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een lange tijd verstreken is sinds J. Monod10 uitgedrukt dat de studie van de groei van bacteriële culturen de basismethode van de microbiologie is. De komst van de moleculaire tools vertraagt het gebruik en de studie van de groei als een techniek. Ondanks de complexiteit van groei, waarbij tal van onderling samenhangende processen, kunnen de onderliggende mechanismen worden beschreven met behulp van wiskundige modellen11. Dit is een robuuste benadering die kan worden gebru...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit project werd gesteund door subsidies van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (subsidie nummer 293940) en Fundación TELMEX-TELCEL (subsidie nummer 162005585), zowel IKOM.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | Voor inoculum incubatie of kegelvormige fask culturen |
| Bioscreen | Groeicurves | C MBR | Voor batch culturen in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | Voor YPD bouillon bereiding |
| Pepton van caseïne, enzymatisch verteerd | Sigma | 82303 | Voor YPD bouillon bereiding |
| Gistextract | Sigma | 09182-1KG-F | Voor YPD bouillon bereiding |
| Bacteriologische Agar | Sigma | A5306 | Voor YPD agar bereiding |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Voor SC bouillon bereiding |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | Voor SC bouillon bereiding |
| Gist stikstofbasis zonder aminozuren en ammoniumsulfaat | Sigma | Y1251 | Voor SC bouillon bereiding |
| Gist synthetische drop-Out medium supplementen | Sigma | Y1501 | Voor SC bouillon bereiding |
| Ammoniumsulfaat korrelig | J.T. Baker | 0792-R | Voor medium aanvulling voorbeeld |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | Voor medium aanvulling voorbeeld |
| Galactose | Sigma | G8270 | Voor medium aanvulling voorbeeld |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Voor medium aanvulling voorbeeld |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | Voor medium aanvulling voorbeeld |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | Voor medium aanvulling voorbeeld |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Voor data-analyse | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | Voor microplate culturen |
Referenties
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25(2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17(2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800(2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
