Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage

Samenvatting

Hier presenteren we een methode waarin menselijke low-density neutrofiele granulocyten (LDN), postoperatieve peritoneale lavage vloeistof, verhaald produceren enorme neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en efficiënt trap gratis tumorcellen die vervolgens groeien.

Samenvatting

Geactiveerd neutrofielen release neutrofiele extracellulaire vallen (netten), die kunnen vangen en microben te vernietigen. Recente studies suggereren dat de netten zijn betrokken bij verschillende ziekteprocessen, zoals auto-immune ziekte, trombose en tumor uitzaaiingen. Hier, laten we een gedetailleerde in vitro -techniek netto activiteit tijdens de vangst van gratis tumorcellen, die na gehechtheid aan netten groeien detecteren. Ten eerste, wij lage dichtheid neutrofiele granulocyten (LDN) van postoperatieve peritoneale lavage vloeistof van patiënten die onderging laparotomies verzameld. Op korte termijn kweken van LDN resulteerde in enorme netto formatie die werd gevisualiseerd met groen fluorescent nucleaire en chromosoom-counterstain. Na een incubatieperiode van Co van menselijke maagkanker cellijnen MKN45, OCUM-1 en NUGC-4 met de netten, werden vele tumorcellen opgesloten door de netten. Vervolgens de bijlage volledig werd afgeschaft door de afbraak van netten met DNase I. tijd-tijdspanne video geopenbaard dat tumorcellen gevangen door de netten niet sterven, maar in plaats daarvan krachtig groeide in een continue cultuur. Deze methoden kunnen worden toegepast op de detectie van zelfklevende interacties tussen netten en verschillende soorten cellen en materialen.

Inleiding

Polymorf nucleaire neutrofielen in het bloed circuleren zijn het meestal gescheiden van mononucleaire cellen via de dichtheid kleurovergang voorbereiding methode. Sommige neutrofiele granulocyten bekend als low-density neutrofiele granulocyten (LDN), met CD11b(+), CD15(+), CD16(+) en CD14(-) fenotypen, zijn echter mede gezuiverde met mononucleaire cellen. Het relatieve aantal LDN aanzienlijk verhoogt in verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune ziekten^1,2, sepsis³en kanker^4,5. Eerdere studies hebben aangetoond dat LDN een fenotypische en functioneel verschillend soort neutrofielen⁶. Opgemerkt moet worden dat LDN in het circulerende bloed hebben meer kans op produceren neutrofiele extracellulaire vallen dan normale dichtheid neutrofielen^2,7(netten). Netten zijn web-achtige structuren samengesteld van nucleïnezuren, histonen, proteasen en korrelig en cytosolische eiwitten, en ze kunnen efficiënt vangen en het vernietigen van ziekteverwekkers⁸.

Onlangs, netten zijn gebleken om vast te leggen niet alleen microben, maar ook bloedplaatjes en circulerende tumorcellen die bij trombose vorming⁹ en tumor uitzaaiingen^{10,11 helpen kunnen}. De moleculaire mechanismen achter de zelfklevende interacties tussen netten en bloedplaatjes of tumorcellen zijn echter nog onduidelijk. Meer recentelijk, een hechting in vitro assay geopenbaard dat myeloïde leukemie cellen (K562¹²) en Long carcinoom cellen (A549¹³) aan netten via β1 en β3 integrins hechten. De auteurs gebruikt NET voorraad geïsoleerd van neutrofielen en geactiveerd door phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) als de hechting substraat¹⁴. Hoewel deze test maakt de ontdekking van echte interactie met netto componenten in de afwezigheid van neutrofiele granulocyten, is het betwistbaar of de "cel-vrij NET voorraad" geïsoleerd door middel van centrifugeren high-speed behoudt de molecuulstructuur identiek aan netten geproduceerd in vivo. Onlangs, vonden we dat peritoneale lavage vloeistof na abdominale heelkunde vervatte veel volwassen LDN, die enorme netten gegenereerd en gekoppeld aan tumorcellen peritoneale metastasen¹⁵veroorzaakt. In deze studie onderzochten we met succes de hechting van de tumorcellen aan intact netten zonder enige fysieke manipulatie. Hier, laten we details van een techniek voor het detecteren van zelfklevende interacties tussen netten en gratis tumorcellen.

Protocol

LDN patiënten ingeschreven in deze studie werden verkregen en zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board van Jichi medische universiteit.

1. isolatie van LDN uit de buikholte Lavages en netto detectie

1. Monster overname
   1. Infundeer 1000 mL normaal steriele zoutoplossing rechtstreeks in de buikholte vóór afsluiting van de wond bij patiënten die een abdominale chirurgie als gevolg van gastro-intestinale maligniteit hebben ondergaan.
      Opmerking: Monsters zijn verkregen van patiënten die onderging een Gastrectomie, colectomy of esophagectomy zonder vooringenomenheid op basis van leeftijd of geslacht. Saline werd overgebracht naar een container en gegoten in de hele buik binnen één minuut. Dit is routinematig uitgevoerd als een postoperatieve peritoneale wassen zonder aanzienlijke gevolgen voor de patiënten.
   2. Lavage de buikholte uitgebreid voor minstens 1 min.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen dat de geïnfundeerd vloeistof langzaam wordt geroerd met de surgeon's handen zodat de monsters uniform zijn.
   3. Herstellen van 200 mL lavage vloeistof met vier spuiten van 50 mL.
      Opmerking: Soms wordt een rubber-connector gebruikt tot het nemen van de vloeistoffen.
2. Zuivering van peritoneale LDN granulocyt specifieke mAb, CD66b¹⁶gebruiken uitvoeren
   Opmerking: Omdat de tussenliggende laag na dichtheid kleurovergang centrifugeren vele mononucleaire cellen bevat, positieve selectie van polymorf neutrofiele granulocyten met behulp van mAb CD66b werd uitgevoerd.
   1. De vloeistof peritoneale lavage overbrengen in een tube van 50 mL.
      Opmerking: In deze stap passeren de vloeistoffen een 100 µm nylon filter voor het verwijderen van onzuiverheden.
   2. Centrifugeer het buikvlies vocht bij 270 x g gedurende 7 min op RT.
   3. Resuspendeer de pellets in 5 mL PBS met 0,02% EDTA.
   4. Zorgvuldig bedekken de 5 mL celsuspensie op een dichtheid van de kleurovergang oplossing in 3 mL.
   5. Centrifugeer bij 1700 x g gedurende 15 minuten op RT zonder alle einden.
   6. Oogst de ~ 2-3 mL oplossing met de tussenliggende lagen (figuur 1A) met behulp van een precisiepipet en meng dit met 10 mL PBS met 0,02% EDTA.
   7. Centrifugeer het buikvlies vocht bij 400 x g gedurende 7 min op RT en verwijder het supernatant.
   8. Voeg een ander 10 mL PBS met 0,02% EDTA en centrifuge bij 270 x g gedurende 7 min op RT. Discard het supernatant.
   9. Los de cel pellet (1 x 10⁷) in 60 µL van buffer voor de magnetische cel scheiding kit.
   10. Voeg toe 20 µL van Fc blok aan de pellets en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.
   11. Voeg 20 µL van de anti-CD66b geconjugeerd met microbeads en incubeer gedurende een extra 10 min bij 4 ° C.
   12. Wassen en resuspendeer de pellets in 500 µL van MACS buffer.
   13. De celsuspensie van toepassing op een magnetische kolom in het magnetisch veld van een geschikt magnetische scheidingsteken en verzamelen de doorstroming met CD66b(-) cellen door het wassen van de kolom met 15 mL buffer.
   14. Verwijder de kolom uit de magnetische scheidingsteken en onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde CD66b(+) cellen door stevig de zuiger te duwen in de kolom.
       Opmerking: De CD66b(+)-celpopulatie bestaat meestal uit neutrofielen zoals bepaald door FACS analyse waaruit blijkt dat > 95% van de CD66(+)-fractie zijn voor CD11b, CD15 en CD16 positief, maar negatief voor de CD14.
3. Generatie van netten
   1. Na centrifugeren bij 270 x g gedurende 7 min op RT, resuspendeer de geïsoleerde LDN (5 x 10⁶) in 1 mL RPMI1640 met 10% FCS.
   2. Cultuur de LDN op een 6-well poly-L-lysine beklede plaat (6 cm diameter) gedurende 2 uur op 37 ˚C in 5% CO,₂.
   3. De groen fluorescente counterstain (een membraan-ondoordringbare kleurstof om vlek de celkern en de chromosomen) op de uiteindelijke concentratie van 5 µM toevoegen.
   4. Onmiddellijk observeren de morfologie van netten (de extracellulaire DNA componenten de LDN onder fluorescentie microscopie uitgezet).

2. kleuring van tumorcellen met rode fluorescerende cel Linker kleurstof

1. Bereiden menselijke kanker cellijnen, MKN45, NUGC en OCUM-1.
2. Wassen van 1 x 10⁷ cellen met PBS + 0,02% EDTA in een tube van 15 mL en centrifuge op 270 x g gedurende 7 minuten op RT.
3. Voeg 1 mL van oplossing voor kleurstof vlekken aan de pellets en Pipetteer zachtjes.
4. 4 µL van rood fluorescerende cel Linker kleurstof in 1 mL van oplossing voor vlekken los en meng met de celsuspensie uit stap 2.2.
5. Incubeer de pellets voor 4 min op RT.
6. Voeg 4 mL DMEM (10% FBS) om te stoppen met de kleuring reactie.
7. Centrifugeer 270 x g gedurende 7 minuten en verwijder het supernatant.
8. Herhaal stap 2.6 en 2.7 tweemaal.
9. Neem contact op met een fluorescentie Microscoop (excitatie = 551 nm, uitstoot = 567 nm) dat de tumorcellen rood worden gekleurd.

3. analyse van Tumor cel adhesie aan netten

1. Resuspendeer de rode fluorescerende gebeitst tumorcellen (1 x 10⁶) in 1 mL RPMI 1640 aangevuld met 0,1% BSA.
2. De tumorcellen aan de LDN cultuur dat de netten geproduceerd zoals beschreven in stap 1.3 toevoegen.
3. Incubeer gedurende 5 min op 37 ˚C, waarmee de tumorcellen contact opnemen met de netten.
   Opmerking: Lange incubatie induceert tumor cel adhesie LDN of aan de platen.
4. Verwijder het medium en zachtjes was de putjes goed door toevoeging van 2 mL voorverwarmde media (0,1% BSA + RPMI 1640) en zwenken van de schotel.
5. Herhaal de procedure wassen in stap 3.4 tweemaal.
   Opmerking: Sinds netten zwak hechten aan de plaat, zo voorzichtig mogelijk om verwijdering van de netten zich wassen moet worden gedaan.
6. Voeg de groen fluorescente kleurstof voor de kleuring van de kern en de chromosomen op een eindconcentratie van 5 µg/mL voor visualisatie van de netten.
7. Observeren van de netten en aangesloten tumorcellen met behulp van de juiste filters (groen, excitatie = 504 nm, uitstoten = 523 nm; rood, excitatie = 551 nm, uitstoot = 567 nm).
8. Het samenvoegen van de cijfers om aan te tonen van de tumorcellen die zijn gevangen door de netten.
   Opmerking: In sommige experimenten, DNA afbraak enzym is toegevoegd aan de LDN cultuur (eindconcentratie van 100 U/mL) 5 min vóór co incubatie gedurende 5 min.

4. time Lapse Video-analyse van de gevangen tumorcellen

1. Cultuur de peritoneale LDN in een 35 mm ronde schotel bedekt met poly-L-lysine zoals beschreven in stap 1.3.
2. Voeg de groen fluorescente kleurstof voor de kleuring van de kern en de chromosomen te visualiseren netten zoals beschreven in stap 1.3.
3. Verwijder het medium na 1 min van incubatie, en voeg 2 mL 0,1% BSA + RPMI 1640.
4. Verwijder de media en voeg onbevlekt 1 x 10⁶ MKN45 cellen gesuspendeerd in 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubeer gedurende 5 min op RT.
5. Verwijder eventuele niet-vastgemaakte tumorcellen door voorzichtig wassen zoals beschreven in stap 3.4 en DMEM met 10% FCS aangevuld met 100 u/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine toevoegen.
6. Monteren van de schotel van cultuur in een systeem voor de observatie van uitzicht op de gehele cel en selecteert u het desbetreffende veld in welke tumor cellen zijn gevangen door de netten.
7. Blijven samen cultuur voor een extra 2 dagen en nemen continue foto's van het veld elke 6 min onder normaal licht en fluorescentie, die MKN45 cellen en netten, respectievelijk detecteert.
8. De beelden op elk timepoint superponeren en time-lapse video's met behulp van Image Viewer software te bouwen.

Resultaten

In de 2-uur-cultuur, CD66b(+) LDN afgeleid van peritoneale lavage vloeistof toonde tekenreeks structuren gekleurd met groen-fluorescerende kleurstof voor nucleaire en chromosoom (figuur 1B), terwijl CD66b(-) mononucleaire cellen niet (Figuur 1 c). Echter, wanneer de LDN culturen werden voorbehandeld met 100 U/mL DNase ik, de karakteristieke structuur was vernietigd (Figuur 1 d), die aangeeft dat zij ...

Discussie

Eerdere studies hebben gemeld dat circulerende tumorcellen kan worden gevangen door netto substraten in vivo^10,11. Metastatische borstkanker kankercellen is gebleken stimuleren neutrofielen en vorming van netten, die in de groei van de cel van de tumor in de target orgel^{17 helpt}induceren. Daarnaast vonden we dat op korte termijn culturen van LDN van postoperatieve lavage vloeistof geproduceerd enorme netten die efficiënt tumorcell...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, ZWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, VS	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift van Dr. M.Yashiro