Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Genereren van Homo- en Heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve MicroRNAs

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58242

⸱

20 november 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Lab Breeding Base for Sustainable Control of Plant Pest and Disease, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 4Shanghai Biozeron Biotechnology Co., Ltd

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt maken van homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas, naast de methoden van bemonstering van weefsel, generatie van de gegevens en data-analyse, voor het onderzoek van koude-responsieve microRNAs.

Samenvatting

MicroRNAs (miRNAs) zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt, bekend om te spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van planten en aanpassing. Er is een accumulatie bewijsmateriaal waaruit blijkt dat de uitingen van bepaalde miRNAs worden gewijzigd wanneer enten, een vaak gebruikt door landbouwers voor het verbeteren van gewas tolerantie voor biotische en abiotische stress landbouwpraktijken. Fles kalebas is een inherent klimaat-veerkrachtig gewas in vergelijking met vele andere belangrijke Cucurbitaceae met niet, met inbegrip van watermeloen, waardoor het een van de meest gebruikte onderstammen voor het laatste. De recente vooruitgang van high-throughput sequencing technologieën heeft grote kansen te onderzoeken van koude-responsieve miRNAs en hun bijdragen aan heterograft voordelen; Toch zijn voldoende experimentele procedures een voorwaarde voor dit doel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt genereren van homo- en heterografts tussen de koud-gevoelige watermeloen en de koude-tolerante fles kalebas, naast weefsel bemonsteringswijzen, gegevens generatie, en data-analyse. De gepresenteerde methoden zijn ook handig voor andere systemen met plant-enten, te ondervragen miRNA verordeningen onder verschillende milieu benadrukt, zoals warmte, droogte en zoutgehalte.

Inleiding

Enten is lang werkzaam als een agrarische techniek om plantaardige productie en tolerantie aan biotische en abiotische stress1,2,3te verbeteren. In heterografting systemen, kunnen elite wijnstokdelen onder de grond betere opname van water en voedingsstoffen voor planten, versterken van weerstand tegen ziekteverwekkers van de bodem en beperken van de negatieve effecten van metalen toxiciteit4,5, waarin de protheses een verbeterde kan verlenen kracht van de groei en verhoogde tolerantie voor het milieu benadrukt. In veel gevallen, heterografting kan ook gevolgen hebben vrucht kwaliteiten in tuinbouw planten, wat leidt tot verbeterde fruit smaak en meer inhoud van gezondheidsgerelateerde verbindingen6,7. Het is gebleken dat de interlokale overdracht van fytohormonen, RNAs peptides en proteïnen tussen de onderstam en de scion is een fundamenteel mechanisme moduleren van de groei en ontwikkeling herprogrammering van scion planten8,9 ,10. Enten wijd gebruikt in studies van interlokale signalering en vervoer in verband met milieu aanpassing11. Praktijk experimenten zijn vooral krachtig voor ondubbelzinnige detectie van overdraagbare moleculen in het ontvangen van weefsel of vasculaire sap, en activering of onderdrukking van moleculaire targets te wijten aan de signaal overdracht12.

Non-codering RNAs, een grote klasse van RNA die uitoefenen van belangrijke regelgevende functies in cellen, zijn bij het spelen een rol bij het vergemakkelijken van de aanpassing van de plant aan de abiotische stress13gemeld. miRNAs zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt. Studies is gebleken dat de regelgevende rol van miRNAs in verschillende aspecten van de activiteiten van de plant, zulke zoals groei, schieten lateraal wortel vorming14,15,16, opname van voedingsstoffen, sulfaat metabolisme en homeostase17en reacties op biotische en abiotische stress18. Onlangs, is de uitdrukking van miRNAs en hun doelgenen hielden verband met zout stress tolerantie in heterografted komkommer zaailingen19. In de intervariety transplantaties van druivenmost, de reacties van miRNA expressie aan droogte stress bleken genotype-afhankelijke20.

De snelle ontwikkeling en het verminderen van de kosten van high-throughput sequencing technologie hebben een grote kans voor de studie van miRNA verordeningen in landbouwkundige planten verstrekt. Watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), een belangrijk cucurbit gewas geteeld over de hele wereld, is gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) is een klimaat-veerkrachtiger cucurbit vaak door boeren gebruikt om te enten met watermeloen. Het primaire doel van de huidige studie is om een standaard, efficiënt, en handige methode voor het maken van heterografts tussen watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) en fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Dit protocol biedt ook een gedetailleerde regeling van experimentele en analytische procedures voor de studie van het Reglement van miRNA expressies na enten, die is handig voor het openbaren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de voordelen van de heterografting.

De materialen van de plant gebruikt in deze studie omvatten de cultivar watermeloen en de fles kalebas landras. Watermeloen cultivar is een commerciële cultivar met hoge opbrengst maar gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas landras is een populaire onderstam voor enten met watermeloen, komkommer en fles kalebas, vanwege zijn uitstekende tolerantie van lage temperaturen21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Zaaimaterialen sterilisatie en de kiemkracht

  1. Voor de sterilisatie van het oppervlak, geniet de fles pompoen zaden in een 500 mL-bekerglas gevuld met water op 58 ° C met af en toe roeren, totdat de temperatuur van het water tot 40 ° C. daalt
  2. Ondertussen, plaatsen van 3 kg van veengrond in een nylon zak en steriliseren, autoclaaf op 120 ° C/0.5 MPa gedurende 20 minuten.
  3. Houd de fles pompoen zaden voor 4-5 h meer met geen roeren inweken.
    1. Zodra het water kamertemperatuur bereikt, spoel de zaden 2 x - 3 x met gedestilleerd water.
    2. Afvoer van het overtollige water en laat de zaden te ontkiemen in een zak gaas bij 28 ° C in een zaal van de groei in het donker.
    3. Na kieming, zaaien in kunststof potten (6 cm diameter) gevuld met gesteriliseerde veengrond.
  4. Wanneer de fles kalebas zaailingen hebben ontwikkeld twee afgevlakte zaadlobben, herhaal stappen 1.1-1.3 met watermeloen zaden.
    Opmerking: Deze timemanagement zorgt ervoor dat de grootte van de scion en onderstam match goed voor succesvolle enting.

2. zaailing groei en enten

  1. Groeien de zaailingen in een zaal van de groei met een donker cyclus van 16 uur licht /8-h, houden van de temperatuur bij 28 ° C gedurende de dag (licht) en bij 22 ° C's nachts (donker). Bevloeiing van de zaailingen door toevoeging van water 1 x per dag in de late namiddag.
  2. Gebruik de methode knippen-enten22 maken van heterografts als de zaailingen van de fles kalebas (wortelstok) in de één ware-bladstadium zijn en de zaadlobben van de watermeloen (scion) opgedoken (niet nog afgevlakte).
    1. Snij de hypocotyls van de watermeloen zaailingen op 2-3 cm onder de zaadlobben en de bovenkant van de fles kalebas zaailingen op de site direct boven de ware verlaat.
    2. Gebruik een tandenstoker om een gat in de top van de schoongemaakte fles kalebas zaailingen. Plaats de bijgesneden watermeloen zaailingen in de gaten van de fles kalebas zaailingen te maken heterografts.
  3. Een vergelijkbare methode gebruiken zoals beschreven in stap 2.2 te maken homografts.
    Nota: Combinaties van Homo- en heterografting moeten altijd worden gemaakt gelijktijdig (Figuur 1), die, in dit geval leidt tot het volgende: watermeloen/fles kalebas (WB, heterograft), watermeloen/watermeloen (WW, homograft) en fles kalebas sluitinstrument kalebas (BB, homograft).

figure-protocol-1
Figuur 1: illustratie van het transplantaat combinaties en de geënte planten structuren. WB = watermeloen/fles kalebas heterografting; WW = watermeloen/watermeloen homografting; BB = fles pompoen/fles kalebas homo-enten; WB-S = scion bladeren van de watermeloen/fles kalebas heterografts die werden bemonsterd; WB-R = onderstam bladeren van de watermeloen/fles kalebas heterografts die werden bemonsterd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. postgrafting beheer, koude behandeling en bemonstering

  1. Wrap van de geënte zaailingen met transparant polyethyleen zakken houden van een relatief hoge vochtigheidsgraad voor en onderhouden ze 7 d onder milieuomstandigheden van 16 uur licht/8-h donkere cycli, houden van de temperatuur bij 28 ° C gedurende de dag (licht) en bij 22 ° C tijdens de nacht (donker).
  2. Ontdek de transparant polyethyleen zakken op de 7e dag. Laat die de planten groeien voor een extra 7-10 dagen onder dezelfde voorwaarden.
  3. Verdeel de gezonde uniforme zaailingen in twee groepen, één voor koud behandeling (gewezen) en één voor controle (niet-onderstreept). Voor de controlegroep, laat de zaailingen in de dezelfde groei zaal (bij 28 ° C) voor een extra 48 h, terwijl voor de koude-benadrukt-groep, de zaailingen overbrengen in een kamer van de groei met een constante temperatuur op 6 ° C, met licht/donker voorwaarden zoals beschreven in stap 2.1.
  4. Proef de bladeren van de scion en de wortelstok van de protheses (Figuur 1). De monsters onmiddellijk bevriezen in vloeibare stikstof en hen bij-70 ° C te bewaren tot gebruik.

4. bibliotheek voorbereiding en High-throughput Sequencing

  1. De bevroren monsters overbrengen in een 2-mL microcentrifuge buis in vloeibare stikstof.
  2. Een roestvrij stalen kraal (5 mm diameter) toevoegen aan elke buis met de weefsels.
  3. Meng de weefsels tot een fijn poeder met een kraal molen homogenizer voor 30 s.
  4. Voor elke praktijk combinatie, neem gelijke hoeveelheden (0,1 g) van gemalen monster van tien zaailingen en meng ze in een centrifugebuis van 10 mL. Het toevoegen van een juiste hoeveelheid guanidium hydrochloride reagens (Tabel of Materials) op basis van de fabrikant suggesties overeenkomt met het weefsel gewicht.
    1. Verwijderen van genomic DNA verontreinigingen door toevoeging van RNA-vrije DNase I tot en met 150 U/mL bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  5. Bepalen van de totale RNA hoeveelheid op een microcapillary elektroforese systeem om de integriteit van RNA nummer > 7.0.
    Opmerking: Een RIN > 7.0 zorgt voor een hoge integriteit van de RNA-monsters.
  6. Het bereiden van kleine RNA bibliotheken met behulp van een commerciële kit (Tabel of Materials) volgens instructies van de fabrikant. Gebruik 1 µg totaal RNA per monster op gang te brengen.
    1. Ontdooi bibliotheek normalisatie reagentia en adapters volgens de richtlijnen van de fabrikant. Kleine RNAs met de 5 ' en 3 ' adapters afbinden en elueer en zuiveren van hen. Vervolgens, omgekeerde transcriberen de 5 ' en 3' afgebonden kleine RNAs volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    2. Uitvoeren van PCR versterking volgens protocol van de fabrikant. Het beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van de cDNA bibliotheken met behulp van een systeem van de Elektroforese van het microcapillary.
    3. Laden 1 µL van een RNA-bibliotheek op een microcapillary elektroforese systeem om ervoor te zorgen de RIN > 7.0.
  7. Volgorde van de kleine RNA-bibliotheken op een high-throughput sequencing instrument zoals elders beschreven23.

5. miRNA en Target Gene voorspelling

  1. Voor elke praktijk combinatie, gebruik de open source UEA sRNA workbench 2.4-plant versie24 te ruimen van slechte kwaliteit sequenties en trim adapter-sequenties van het ruwe luidt als volgt. Negeren van de sequenties die kleiner dan 18 zijn nt of groter zijn dan 32 nt.
  2. Vergelijk de 'schone' sequenties van hoge kwaliteit aan de open source Rfam 11.0 database te herkennen en verwijderen leest van rRNA, tRNA, snoRNA en andere snRNAs.
  3. Hiermee lijnt u de resterende leest aan het genoom van de verwijzing met behulp van een reeks van korte-lezen uitlijning gereedschap25. Geen wanverhouding is toegestaan in deze stap.
    Opmerking: De vergadering van de "97103" genoom watermeloen V126 werd gebruikt voor de aanpassing aan het lezen van de scion en de fles kalebas "HZ" genoom vergadering V127 werd gebruikt voor leesbewerkingen van de onderstam.
  4. Vergelijk de resterende leest tegen bekende volwassen miRNAs in de open source miRBase 22,028. Leest die homoloog aan bekende miRNAs worden geclassificeerd als geconserveerde miRNAs.
  5. Vergelijk de sequenties die niet overeenkomen met de voorlopers van de bekende miRNA met het genoom. Gebruiken de MIREAP29 -algoritme voor het detecteren van mogelijke nieuwe miRNAs onder standaardinstellingen.

6. differentiële expressie en Ontology van het gen analyse

  1. Vergelijk de niveaus van de expressie van miRNAs op basis van hun Lees graven. miRNAs met een P-waarde (Fisher's exacte test) < 0,05 en een absolute log2 waarde > 2 worden beschouwd als differentieel worden uitgedrukt.
  2. Gebruik een antisense oligonucleotide doel site selectie tool (TargetFinder)30 te voorspellen van potentiële aanvullende mRNAs (miRNA doelgenen) naar de differentially uitgedrukte miRNAs onder standaardparameters.
  3. Gebruik het ontology van het gen (ga) verrijking analytisch hulpmiddel31 te onthullen de miRNA doel genen ontologie (GO) patronen onder een P- waardedrempel van 0,05 voor statistische significantie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

figure-results-1
Figuur 2: fenotypes van verschillende enten bij kamertemperatuur en koude-benadrukte voorwaarden. (een) dit paneel toont homo- en heterografted zaailingen op kamertemperatuur als het besturingselement. (b) dit paneel toont homo- en heterografted zaailingen na 48u van koude behandeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschreven we in detail een zeer efficiënte en reproduceerbare methode om homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas te maken. Deze methode, waarvoor geen specifieke apparatuur, is zeer eenvoudig te bedienen en heeft doorgaans een zeer hoge overlevingskansen enten. De methode kan ook worden gebruikt om de protheses voor andere Cucurbitaceae met niet, zoals tussen watermeloen, komkommer en pompoen.

Het is vermeldenswaard dat de relatieve grootte (leeftijd) van de o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen. De kleine RNA sequencing gegevens wordt gestort in de GenBank de toetreding onder nummer SRP136842.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (31772191), het onderzoeksproject voor algemeen belang in de provincie Zhejiang (2017C 32027), de sleutel Science Project van de plantenveredeling in Zhejiang (2016C 02051) en het nationale programma voor de steun van Top-notch jonge Professionals (P.X.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
RNA-free DNase ITakaraD2270A
Truseq Small RNA sample prep KitIlluminaRS-200-0012
2100 BionalyserAgilent5067
DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificF530S
UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software)NANAhttp://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/
Rfam 11.0 database (website)NANAhttp://rfam.janelia.org
miRBase 22.0 (website)NANAhttp://www.mirbase.org/
MIREAP(software)NANAhttps://sourceforge.net/projects/mireap/
TargetFinder (software)NANAhttp://targetfinder.org/

Referenties

  1. Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
  2. Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
  3. Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
  4. Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
  5. Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
  6. Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
  7. Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
  8. Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
  9. Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
  10. Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
  11. Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
  12. Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
  13. Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
  14. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).
  15. Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
  16. Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
  17. Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
  18. Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
  19. Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
  20. Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
  21. Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359(2013).
  22. Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
  23. Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
  24. Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851(2014).
  25. Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
  26. Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
  27. Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).
  28. Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).
  29. Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
  30. Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
  31. Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
  32. Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Enten van watermeloen op fleskalebasprotocol voor heterograft en homograftmicroRNA analyse bij koudestressplantententeniekmethode voor de bereiding van zaailingenRNA extractieprotocolmicrocapillaire elektroforesesysteemhigh throughput sequencingguanidinehydrochloride reagenscondities van de groeikamer
Genereren van Homo- en Heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve MicroRNAs
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.