Dit protocol biedt een methode om te evalueren van de proteolytic activiteit van een intrinsiek laag-activiteit, één omzet protease in een cellulaire context. In het bijzonder is deze methode toegepast om te evalueren van de proteolytic activiteit van PCSK9, een belangrijke bestuurder van lipide metabolisme waarvan proteolytic activiteit vereist voor de ultieme hypercholesterolemic functie is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is een single-omzet protease die serum low-density lipoprotein (LDL) niveaus regelt en, bijgevolg, hart-en vaatziekten. Hoewel PCSK9 proteolyse vereist voor het volledige hypercholesterolemic effect is, de evaluatie van zijn proteolytische functie is uitdagend: PCSK9 is alleen bekend dat het klieven zelf, ondergaat slechts een enkele omzet, en na proteolyse, behoudt zijn substraat in de actieve site als een auto-remmer. De hier gepresenteerde methoden beschrijven een bepaling die deze uitdagingen overwint. De test richt zich op intermoleculaire proteolyse in een cel-gebaseerde context en de succesvolle decollete koppelingen aan de secreted luciferase activiteit, die kan gemakkelijk worden voorgelezen in het geconditioneerde medium. Via opeenvolgende stappen van mutagenese, voorbijgaande transfectie en een luciferase uitlezing, de bepaling kan sonde PCSK9 proteolyse onder voorwaarden van genetische of moleculaire perturbation in zodanig hoge gegevensdoorvoer. Dit systeem is geschikt voor zowel de biochemische evaluatie van klinisch ontdekte missense single-nucleotidepolymorfisme (SNPs), alsook wat betreft de screening van kleine-molecuul remmers van PCSK9 proteolyse.
Inleiding
PCSK9 richt de LDL-receptor (LDL-R) voor afbraak, verhoging van LDL cholesterol (LDL-C) en rijden atherosclerotische hart-en vaatziekten1,2. Therapeutiek targeting PCSK9 krachtig lagere LDL-C en verbeteren van cardiovasculaire uitkomsten voor patiënten, zelfs wanneer toegevoegd aan een agressieve lipide-verlagende therapie met statines3,4. Momenteel goedgekeurde therapieën zijn beperkt tot antilichaam-gebaseerde benaderingen, echter, en lijden onder een gebrek aan kosteneffectiviteit5,6. U kunt....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. plaats-geleide mutagenese van Protease Vector
- Ontwerp en bestel aangepaste-gesynthetiseerd oligonucleotides te installeren van een mutatie van belang met behulp van een wijziging van de standaard plaats-geleide mutagenese protocollen12. Standaard ontzout inleidingen (zonder extra reiniging) zijn volkomen aanvaardbaar.
Opmerking: Een algemene aanpak primer ontwerpen gaat om het creëren van gedeeltelijk overlappende inleidingen, zoals aangegeven in tabel 1, met behulp van een smelten temperatuur (Tm) rekenmachine die specifiek zijn voor de polymerase van belang. - Instellen polymerase kettingrea....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De high-throughput proteolyse bepaling berust op drie belangrijke uitdagingen te overwinnen. Eerst, om te overwinnen de intrinsiek lage output van een single-omzet PCSK9 protease, een PCSK9 protease ontbreekt de remmende prodomain wordt gebruikt, met de volgorde van de splitsing op de staart van de prodomain gekoppeld aan een luciferase die kan secreted14. Ten tweede, om te voldoen aan de behoefte aan de protease te vouwen in complexe met zijn remmende prodomain, d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De experimentele procedures die hierboven beschreven presenteer een methode om te overwinnen de intrinsiek lage activiteit van de single-omzet protease PCSK9 en zijn proteolytische functie wordt geëvalueerd in een robuuste manier. Het sleutelbegrip van de bepaling is gebaseerd op het omzetten van een single-omzet-evenement in een enzymatisch versterkte uitlezing. De sterke punten van de bepaling zijn de relatief korte tijd-frame en gebruiksgemak van de luciferase verslaggever, evenals haar schaalbaarheid voor high-throug.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de gulle financiële steun van de NHLBI/NIH (K08 HL124068 en LRP HMOT1243), NCATS/NIH via de UCSF klinisch en translationeel Science Institute katalysator Program (UL1 TR000004), de UCSF academische Senaat, de Hellman Foundation, een Gilead Sciences Research Scholar Award, een Pfizer ASPIRE cardiovasculaire Award (alles aan John S. Chorba) en het Howard Hughes Medical Institute (aan Adri M. Galvan en Kevan M. Shokat).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PCR Tubes | USA Scientific | 1402-2900 | Voor PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-fidelity DNA Polymerase |
| Deoxynucleotide Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (voor PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Auteurs | n/a | Beschikbaar bij auteurs |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Auteurs | n/a | Beschikbaar bij auteurs |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | Voor DNA gels |
| E-Gel Imager System met Blue Light Base | ThermoFisher Scientific | 4466612 | Voor beeldvorming van DNA gels |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Voor DNA gels |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | Voor DNA gel running buffer |
| Glacial azijnzuur | ThermoFisher Scientific | A38-500 | Voor DNA gel running buffer |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur oplossing | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, voor DNA gel running buffer |
| 1 kb DNA ladder | Gold Biotechnology | D010 | DNA ladder |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Beperkingsenzym |
| LB Agar platen met 100 µg/mL carbencillin | Teknova | L1010 | LB-Carb platen |
| One Shot Mach1 T Phaage-resistent Chemisch Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemisch competente cellen |
| LB Broth, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicilline | Gold Biotechnology | C-103-5 | Selectief antibioticum |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA Zuivering Miniprep kit |
| NanoDrop 2000 Spectrofotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spectrofotometer |
| 293T Cellen | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T cellen |
| DMEM, hoge glucose, pyruvaat | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, zoogdiercel media |
| Fetaal bovien serum | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsine-EDTA (0,05%), fenolrood | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsine, voor celdissociatie |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess geautomatiseerde celteller | ThermoFisher Scientific | C10227 | Geautomatiseerd celtelling |
| Countess celtelling kamer slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Slides voor celtelling |
| CELLSTAR weefselkweek platen, Wit, Wit-onderkant, met deksel | Grenier Bio-One | 655083 | Witte, wit-onderkant 96 wel plate |
| TempPlate non-skirted 96-wel PCR plaat, natuurlijk | USA Scientific | 1402-9596 | 96 wel plaat voor master plasmid plaat |
| Nunc 2,0mL DeepWell Plates | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 wel deep well plaat |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Lipide transfectie reagens, Lf3K |
| P3000 Reagens | ThermoFisher Scientific | L3000008 | DNA pre-complexatie reagens, geleverd met Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Gereduceerd serum medium voor transfectie |
| (+)-Natrium L-ascorbaat | Millipore Sigma | A4034 | Natrium ascorbaat |
| Natriumchloride | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumine, bovien serum, fractie V, laag zwaar metaalgehalte | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Zoutzuur | VWR | JT9535-2 | Geconcentreerd HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | Luciferase substraat |
| Spuitfilter, sterieel | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterieel filter, PVDF, 0,22 µm porie |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Multikanaals pipet |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Multikanaals pipet |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Multikanaals pipet |
| Reagens reservoir | Corning | 4870 | Trog voor reagentia |
| Centrifuge tubes, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | 15 mL tubes |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL tubes |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 voor Mac | Spreadsheet software |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Wetenschappelijke dataanalyse software |
Referenties
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
