Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Samenvatting

Hier presenteren we een methode voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door vervanging van de eerste codering exon van genen met transcriptie stuurprogramma's. De CRISPR/Cas9 gebaseerde methode plaatst een transactivator reeks onder de endogene regulering van een vervangen gen, en bijgevolg vergemakkelijkt transctivator expressie uitsluitend in gen-specifieke Spatio patronen.

Samenvatting

Binaire transcriptie systemen zijn krachtige genetische hulpmiddelen voor het visualiseren en manipuleren van cel lot en gen-expressie in specifieke groepen van cellen of weefsels in modelorganismen op grote schaal gebruikt. Deze systemen bevatten twee componenten als afzonderlijke transgene regels. Een driver regel spreekt een transcriptionele activator onder de controle van weefsel-specifieke initiatiefnemers/versterkers, en een verslaggever/effector lijn havens een target-gen stroomafwaarts geplaatst op de site van de binding van de transcriptie activator. Dieren herbergen van beide componenten induceren weefsel-specifieke transactivation van de genexpressie van een doel. Precieze Spatio uitdrukking van het gen in gerichte weefsels is essentieel voor onbevooroordeelde interpretatie van cel/gen-activiteit. Ontwikkeling van een methode voor het genereren van exclusieve cel/weefsel-specifieke stuurprogramma lijnen is daarom essentieel. Hier presenteren we een methode voor het genereren van zeer weefsel-specifieke gerichte expressie systemen door gebruik te maken een "geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische Repeat/CRISPR-geassocieerde" (CRISPR/Cas)-genoom bewerken techniek gebaseerd. Bij deze methode wordt de endonuclease Cas9 wordt gericht door twee chimeer gids RNAs (gRNA) voor specifieke sites in de eerste codering exon van een gen in het genoom van de Drosophila maken dubbel-strand einden (DSB). Vervolgens kan met behulp van een exogene donor plasmide met de transactivator reeks, de cel-autonome reparatie machines homologie geleide herstellen (HDR) van de DSB, wat resulteert in precieze verwijdering en vervanging van de exon met de transactivator volgorde. De transactivator klopte-in wordt uitgedrukt uitsluitend in cellen waar het cis-regelgevende elementen van het vervangen gen zijn functioneel. Het gedetailleerde stapsgewijze protocol hier gepresenteerd voor het genereren van een binaire transcriptionele stuurprogramma uitgedrukt in Drosophila fgf/branchless-epitheliale/neuronale cellen produceren voor elke gen - of weefsel-specifieke expressie kan worden aangenomen.

Inleiding

De genetische toolbox voor gerichte genexpressie is in Drosophila, waardoor het een van de beste modelsystemen te onderzoeken van de functie van genen die betrokken zijn in een breed scala van cellulaire processen goed ontwikkeld. Binaire expressiesystemen, zoals gist Gal4/UAS (upstream activering sequence), werd aangenomen voor weefsel-specifieke enhancer overlapping en gene misexpression in de Drosophila genetische model¹ (Figuur 1). Dit systeem vergemakkelijkt de ontwikkeling van een groot aantal technieken zoals Spatio verordening overexpressie van het gen, misexpression, knock-out in geselecteerde groepen cellen zo goed zoals in cel ablatie, cel markering, live traceren van cellulaire en moleculaire processen in het embryo en weefsels, lineage tracering en mozaïek analyses tijdens de ontwikkeling. Een aantal binaire transcriptie systeem, zoals de bacteriële LexA/LexA_op systeem (Figuur 1) en Neurospora Q-systeem, zijn krachtige genetische hulpmiddelen die worden nu algemeen gebruikt in Drosophila, in aanvulling op het oorspronkelijke Gal4/UAS systeem voor gerichte gene expression^1,2,3.

Hier presenteren we een methode voor het genereren van zeer betrouwbare weefsel toepassingsspecifieke binaire expressie systemen door gebruik te maken van een genoom-bewerken-techniek. De recente vooruitgang in CRISPR/Cas9 genoom bewerken technologie hebben toegestaan ongekende mogelijkheden gestuurde genoom wijzigingen aanbrengen in een brede waaier van organismen. In vergelijking met de andere beschikbare genoom-bewerkingstechnieken, is het CRISPR/Cas9-systeem goedkoop, efficiënt en betrouwbaar. Deze technologie maakt gebruik van onderdelen van het bacteriële adaptieve immuunsysteem: een Cas9 endonuclease van Streptococcus pyogenes die creëert een dubbel-strand break (DSB), en een chimeer gids-RNA (gRNA), die de Cas9 aan een bepaalde genoom site voor gidsen gerichte DSB⁴. De cellen bevatten de machine om te herstellen van de DSB met verschillende routes. Non-homologe einde deelname aan (NHEJ) leidt tot kleine invoegingen of verwijderingen verstoren genfunctie, terwijl homologie geleide reparatie (HDR) een gedefinieerde regie/wenselijk genomic knock-in/knock-out introduceert met behulp van een exogene HDR donor als een sjabloon. De vervanging HDR gebaseerde strategie kan efficiënt worden gebruikt voor het genereren van een zeer betrouwbare weefsel toepassingsspecifieke binaire expressie-systeem, dat alle beperkingen van de traditionele enhancer val methoden kan overwinnen. We beschrijven een stapsgewijze procedure voor het gebruik van CRISPR/Cas9 gebaseerde HDR reparatie bij het genereren van een binaire transcriptie driver regel die onder de controle van endogene verordening op het gebied van transcriptionele en post-transcriptional van een Drosophila wordt uitgedrukt gen. In dit protocol, tonen we de generatie van een driver regel specifiek voor branchless (bnl) gen een FGF familie eiwit dat vertakkende morfogenese van tracheale airway epitheel^{5 regelt}codering. In dit voorbeeld wordt de eerste codering exon van de bnl -gen werd vervangen door een opeenvolging van een bacteriële LexA transactivator reeks zonder te veranderen van een endogene cis-regulerende sequenties van de bnl -gen. We laten zien dat de strategie een bnl-LexA driver regel die spatiotemporally de expressie van een gen van de verslaggever geplaatst stroomafwaarts van LexAoperator (LexAop of LexO) uitsluitend in bnl regelt- gegenereerd epitheliale/mesenchymale/neuronale cellen uiten.

Protocol

1. de ontwerpen en de bouw van de gRNA expressie Vector

1. Voor het juist een lang gedefinieerde regio van een exon vervangen gebruikt u een dubbele gRNA aanpak⁶, waarin elke gRNA speciaal te op twee uiteinden van het geselecteerde gebied van belang richten kan. Selecteer de twee sites van de doelstelling van de gRNA binnen de eerste codering exon van het gen voor het verkrijgen van een nauwkeurige gen-specifieke Spatio expressie van het stuurprogramma.
2. Bij Drosophila melanogaster, selecteert u de gRNA doel sites met behulp van het flyCRISPR optimale Target Finder hulpprogramma (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Andere beschikbare CRISPR-ontwerpgereedschappen inzetbaar, met inbegrip van de geoptimaliseerde CRISPR Design tool (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), en E-CRISP (www.e-crisp.org/E-CRISP).
   Opmerking: De volgende protocollen van gRNA design en klonen werd aangenomen van de methoden hierboven beschreven^6,7.
   1. Kopieer de feitelijke volgorde in het vak in de online tool. Selecteer de meest recent uitgebrachte Drosophila melanogaster genoom aantekening versie, "r_6," in het drop-down menu voor "Select genoom." In het veld "Selecteer gids lengte (nt)," input "20." Selecteer het vinden van "Alle CRISPR doelen" en klik op "Vind CRISPR doelen".
   2. Evalueren alle kandidaat-gRNA doelstellingen door het instellen van "Maximum" voor "Starheid" en "NGG slechts" voor "PAM". Probeer te selecteren van de gRNA sites zonder een uit-doelwit of een minimum aantal af-doelen mogelijk. Gebruik de web-tool beschreven in Doench et al. 2014 ⁸ Schakel gRNAs met een mogelijke score van de "goede" activiteit.
   3. Tegelijkertijd zorgen ervoor dat er geen single nucleotide polymorphism in de doelstellingen van de gRNA in het genoom van de bovenliggende vlieg lijn geselecteerd voor injectie (Bijvoorbeeld nos-Cas9 op het X-chromosoom, BL # 54591). Volg het protocol beschreven in Gratz et al. 2015⁷ aan de genomic DNA halen uit de bovenliggende vlieg lijn. PCR vullen, ongeveer, de 500 – 1000 nt regio's gebruikend inleidingen die flank van de volgorde van belang en een polymerase van DNA van HiFi; volgorde-Controleer of de PCR versterkt producten.
3. Volg voor het genereren van een tandem gRNA expressie vector, een afbinding-onafhankelijke klonen protocol⁶ in te voeren van twee reeksen van de protospacer in een pCFD4 RNA expressie vector. Merk op dat een verbeterde multi-gRNA expressie vector (pCFD5) nu beschikbaar, is waarin zowel de sgRNAs van de sterke U6:3 initiatiefnemers⁹ (https://www.crisprflydesign.org) worden uitgedrukt. Gebruik een DNA vergadering-methode om een kloon van de gRNAs in de pCFD4-vector.
   1. Ontwerpen en bestellen van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor de invoering van twee reeksen van de protospacer in de pCFD4 van RNA expressie vector (tabel 1A). Als eerder beschreven⁶bevat de voorwaartse primer de eerste protospacer reeks geflankeerd door regio's overeenkomt met het U6-1 de promotor en de kern van de gRNA in pCFD4; de omgekeerde primer bevat de aanvulling van de omgekeerde volgorde van de tweede protospacer geflankeerd door de regio's die overeenkomt met de gRNA kern en U6-3 promotor in pCDF4.
   2. Resuspendeer inleidingen tot 100 μM met DNase en RNase-gratis dubbel gedestilleerd water (ddH₂van O). Het maken van een primer concentratie van 10 μM werken. PCFD4 plasmide als sjabloon gebruiken en instellen van PCR reactie met behulp van een hifi-polymerase en aanbevolen instellingen voor PCR reactie⁶.
   3. Om te clonen de versterkte product in pCFD4, pCFD4 plasmide met BbsI enzym te verteren door het opzetten van de volgende reactie: 2 – 5 μg pCFD4 plasmide, 5 μl van 10 x spijsvertering buffer, 1 μL van BbsI enzym en ddH₂O om het uiteindelijke volume op 50 μl. Meng de inhoud van de reactie door zachtjes te tikken van de buis en verzamelen van alle de verspreide druppels van de wand van de buis aan de onderkant door een korte spin. Incubeer de mix van de reactie bij 37 ° C gedurende 2 uur.
   4. Voer het PCR-product van stap 2 en het verteerd product uit stap 3 op een 1% agarose gel. Voer de elektroforese voor genoeg tijd om volledig gescheiden van de DNA-bands. Knip het juiste formaat DNA banden onder een UV trans-illuminator voor het zuiveren van de verwachte producten met behulp van gel elutie kolom volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). Het PCR product moeten 600 bp, en het plasmide gelineariseerde pCFD4 moet ~6.4 kb ⁶.
   5. Instellen van de DNA vergadering reactie in een PCR-buis, per de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
   6. 2 μL van de vergadering product omvormen bevoegde bacteriën (DH5α of soortgelijke stammen met ΔrecA1, ΔendA1), plaat op ampicilline (100 μg/mL) met LB (LB/Amp) agar platen en Incubeer bij 37 ° C's nachts. Merk op dat de DNA vergadering mix misschien wel giftig voor bepaalde stammen van bacteriën, maar verdunning van de vergadering-mix de toxiciteit verminderen kan.
   7. Kies 3-4 ampicilline-resistente kolonies van de overnachting-bebroede plaat, enten van de kolonie in 3 mL LB met 100 μg/mL ampicilline, en groeien geënte bacteriën in een shaker 37 ° C's nachts. Plasmide uittreksel uit de overnachting-gekweekte bacteriën met behulp van de plasmide mini prep kit volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
   8. Het volgnummer van de plasmiden met T3 universele primer aan het scherm voor de juiste klonen met de tandem gRNA inbrengen. Vast een glycerol voorraad van bacteriën getransformeerd met een reeks-gecontroleerd pCFD4-gRNA in 20% glycerol en winkel in een vriezer-80 ° C voor toekomstig gebruik.

2. ontwerpen en de bouw van de HDR-Donor

1. Ontwerpen voor genomic knock-in van een Gal4 of LexA reeks, een double-stranded HDR donor met de volgorde van de transactivator geflankeerd door de twee takken van de homologie.
   1. Gebruik > 1,5 kb links en rechts homologie wapens flankerende gRNA gerichte locatiegebonden. Uitgebreide homologie wapens verhoging van de efficiëntie van HDR tijdens de reparatie proces ¹⁰.
   2. PCR versterken de homologie wapens uit de genomic DNA (gDNA), gewonnen uit de bovenliggende vlieg lijn geselecteerd voor injectie (Bijvoorbeeld nos-Cas9 (op het X-chromosoom), BL # 54591). Een bewijs lezing hot-start polymerase van DNA polymerase enzym geschikt voor lange PCR extensie gebruiken (Zie Tabel van materialen). Controleer of volgorde.
2. Om te voorkomen van de gRNA naar de gemanipuleerde locus retargeting, ontwerpen de vervanging donor op zodanige wijze dat de gRNA erkenning sites worden verstoord door de exogene reeks geïntroduceerd.
   Let op: om te voorkomen dat de vermeende cis-regulerende elementen wijzigen, kies altijd de gRNA erkenning sites binnen de codering exon-regio.
3. Voor het genereren van een vervangende cassette, plan de DNA vergadering strategie om vier segmenten samen: de 5' en 3' homologie wapens, de middelste exogene transactivator DNA-sequentie en het gelineariseerde klonen vector backbone (bijvoorbeeld pUC19 of andere gebruikte vectoren klonen). Na de fabrikant richtsnoer voor DNA vergadering (zie tabel of Materials), de geschikte inleidingen voor PCR versterking en montage van elk segment ontwerpen. Resuspendeer inleidingen tot 100 μM met ddH₂O. Make een 10 μM werken concentratie primer. HiFi-polymerase gebruiken voor alle PCR reacties. Volg de onderstaande voorschriften:
   1. PCR versterken een Gal4 of LexA cassette van de expressie van een beschikbare vector (b.v., nls-LexA:p65; de ideale Gal4/LexA/QF2 expressie plasmiden kunnen worden gevonden en kan worden verkregen uit gemeenschappelijke middelen zoals Addgene) met behulp van de inleidingen vermeld in tabel 1B.
      1. Ontwerp om te behouden alle de oorspronkelijke transcriptionele en post-transcriptional regeling van de vervangen exon op de uitdrukking van de opeenvolging van DNA van transactivator, de cassette op een zodanige wijze dat de bewerkte genomic allel spreek een chimeer mRNA van de transactivator en het gen. De 5' en 3' eind van de gerichte exon te behouden elke splicing signaal te behouden.
      2. Nemen een T2A zelf verbrijzelen-peptide reeks tussen de resterende 5' codering exon en de volgorde van de transactivator om te voorkomen dat de traduction een chimeer eiwit. Voeg een vertaling stop codon na de opeenvolging van exogene transactivator (Figuur 5).
   2. PCR versterken de homologie wapens uit de genomic DNA (gDNA), gewonnen uit de bovenliggende vlieg lijn geselecteerd voor injectie (Bijvoorbeeld nos-Cas9 (op het X-chromosoom), BL # 54591) met behulp van de inleidingen vermeld in tabel 1B. HiFi-polymerase gebruiken voor alle PCR reacties met behulp van de systemen als volgt: 5 μL van 5 x reactie Buffer, 0,5 μL van 10 mM dNTPs, 1,25 μL van 10 μM vooruit Primer, 1,25 μL van 10 μM Reverse Primer, 0,5 μL van sjabloon DNA, 0,25 μL van de Polymerase van het DNA van de High-Fidelity , 16,25 μL van ddH₂O.
   3. Gebruik gelineariseerde klonen vector zoals pUC19. Een aantal donor vectoren zijn nu beschikbaar. Zien te veelomvattend tochtband op de volgende website-http://flycrispr.molbio.wisc.edu.
   4. Voer de PCR producten op een 1% agarose gel. Voer de elektroforese voldoende tijd om een duidelijke scheiding van de gewenste band van de ongewenste niet-specifieke banden (indien aanwezig). Gel-zuiveren de verwachte DNA-fragmenten. Het meten van de concentratie van elke gezuiverde DNA-fragment met een spectrofotometer.
   5. Instellen van de DNA vergadering reactie volgens de instructies van de fabrikant. Meng de gelineariseerde klonen vector- en het doeldomein fragmenten uit stap 3 en stap 4 in de volgende reactie: 1 μL van lineaire klonen vector (50 ng/l), 2-3 vouw overmaat van elke doelgroep fragment, 10 μL van 2 x DNA vergadering master mix, zodat de uiteindelijke reactie volume 20 μL met ddH < C21 > 2O. Incubate de reactie mix gedurende 1 uur bij 50 ° C.
   6. Omvormen 2 μL van de vergadering product bevoegde bacteriën, plaat op LB/Amp agar platen met 100 μg/mL ampicilline. Ook Voeg X-Gal + IPTG op de plaat voor blauw/wit screening.
   7. Kies 3 – 4 witte kolonies van de overnachting-bebroede plaat, de kolonie in 3 mL LB met 100 μg/mL ampicilline beënten, en groeien bij 37 ° C's nachts in een shaker. Uittreksel plasmide van de overnachting-gekweekte bacteriën met behulp van de plasmide mini prep kit na de fabrikant handleiding (Zie Tabel van materialen).
   8. Het scherm van de positieve kolonie door PCR of beperking spijsvertering.
   9. Volgorde controleren de HDR donor regio van het definitieve plasmide. Sla een bacteriële voorraad getransformeerd met de juiste klonen in 20% glycerol bij-80 ° C voor toekomstige inoculatie.

3. de embryo injectie, vliegen genetica en Screening voor het bewerken van het genoom

1. Voorbereiden van de hoge zuiverheid endotoxine-vrije gRNA expressie vector evenals de HDR donor plasmide met behulp van de maxiprep van een plasmide kit (Zie Tabel van materialen).
2. Mede de gRNA expressie plasmide (100 ng/μl) en de vervanging donor (500 ng/μl) te injecteren in de kiemcellen van nos-Cas9 embryo's⁶. Opmerking: we gebruiken een commerciële dienst voor injectie, maar deze procedure kan worden uitgevoerd in het laboratorium zo goed.
3. Vliegen genetica en screening (Figuur 2 en Figuur 3):
   1. Wanneer de ingespoten embryo's tot volwassenen uitgroeien, kruis elke één G vliegt₀ naar balancer vliegen. Selecteer geschikte balancer voor het chromosoom met het allel gerichte.
   2. Anesthetize de F1 nakomelingen van elke G0 kruis op een pad van CO₂ en 10-20 mannen onder een stereomicroscoop willekeurig te kiezen. Steek hen individueel naar de balancer vrouwtjes zoals afgebeeld in Figuur 3.
   3. Wanneer de F2 larven hatch, kies de alleenstaande vader van de F1 van elk kruis en uitpakken van de gDNA via het interne vliegen genomic DNA voorbereiding protocol:
      1. Bereiden van gDNA extractie buffer: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, bewaren bij kamertemperatuur. Bereiden van 20 mg/mL stockoplossing proteïnase K en op te slaan in de vriezer.
      2. Zet elke vlieg in een 1,5 mL micro-centrifuge buis en label van de buis. Bewaren in de vriezer-80 ° C's nachts.
      3. Voorbereiding van een verse werken volume van gDNA extractie buffer met 200 µg/mL eindconcentratie van proteïnase K.
         Opmerking: Gebruik geen een oude buffer voor deze stap.
      4. Squish elke vlieg voor 10 – 15 s met een uiteinde van de pipet met 50 μl van squishing buffer zonder verstrekking van de vloeistof. Afzien van de resterende buffer in de buis en meng goed. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-30 min.
      5. Buizen ter 95 ° C warmte blok voor 1-2 min naar de inactivering van het proteïnase K.
      6. Spin down voor 5 min op 10.000 x g. Opslaan van het preparaat bij 4 ° C voor verdere PCR analyse.
4. Gebruik dezelfde methode ter voorbereiding van de gDNA van een nos-Cas9 -fly, die als een negatieve controle fungeert. Uitvoeren van drie-stap PCR gebaseerd schermen om te identificeren van de juiste "uiteinden uit" HDR (Figuur 2en Figuur 5) met behulp van gDNA van elke man van de F1 als een sjabloon⁵. Gebruik 1 μL van de DNA-prep in de volgende systeem van de PCR-reactie: 10 μL van 2 x PCR Master Mix met kleurstof, 1 μL van elke primer (10 μM), 1 μL van DNA sjabloon, en 7 μL van ddH₂O.
5. Zoals blijkt uit figuur 5A, uitvoeren van PCR inleidingen fwd1 en rev1 naar scherm te gebruiken voor het bestaan van de invoegpositie of vervanging; uitvoeren van PCR fwd2 en rev2 inleidingen te gebruiken om te controleren of de toevoeging of vervanging van 3' regio; uitvoeren van PCR gebruikt inleidingen M13F en rev3 te controleren "eindigt-in" HDR (tabel 1 c).
6. Houd de vliegen lijnen met de bevestigde uiteinden-out HDR en stellen evenwichtige voorraden uit de F2-generatie. Genenoverdracht naar de balancer vliegen weer te verwijderen elke onbedoelde mutaties op andere chromosomen.
7. Kwalitatief hoogwaardige gDNA uit de gevestigde bestanden voorbereiden met het sturen van lange PCR (> 800 – 1000 nt) amplicon met high-fidelity Taq polymerase en volledig volgorde controleren de waarbij de gemanipuleerde genomic regio's verkregen. Anderzijds kunt ruwe gDNA uittreksel zoals beschreven eerder versterken korter (< 800 nt), overlappende PCR producten om te volgorde-valideren van het bewerkte genoom. Gebruik het volgende protocol om te bereiden de Drosophila van de genomic DNA van goede kwaliteit:
   1. Zet over 25 volwassen vliegen in een 1,5 mL microcentrifuge buis, en bevriezen in de vriezer van-20 ° C of -80 ° C gedurende ten minste 1 uur.
   2. Toevoegen van 250 μL van oplossing A (pH 9.0 Tris HCl 0,1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1%).
   3. Meng het vliegen met behulp van de homogenisator pestles in microcentrifuge buizen, en zet de buis op ijs.
   4. Incubeer bij 70 ° C gedurende 30 minuten.
   5. 35 μL van KOAc (5 M), shake en mix goed toevoegen, maar niet niet vortex.
   6. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
   7. Draaien op 12.000 x g gedurende 15 minuten.
   8. Met een micropipet van 1 mL, zorgvuldig alleen het supernatans dat duidelijk overbrengen in een nieuwe buis, verlaten terug een eventueel neerslag of interfase.
   9. 150 μl van isopropanol aan het supernatant toevoegen. Meng zachtjes door inversie.
   10. Spin bij 10.000 x g gedurende 5 min.
   11. Verwijder het supernatant voorzichtig en laat de pellet in de buis.
   12. Wassen van de pellet met 1 mL 70% EtOH.
   13. Spin bij 12.000 x g gedurende 5 min.
   14. Verwijder het supernatant. Lucht drogen de pellet gedurende 15 tot 20 minuten. Niet meer dan de pellet drogen.
   15. Los van de pellet in 100 μl van ddH₂O.
   16. High-fidelity geschikt voor lange amplicon de polymerase van DNA gebruiken (> 800 bp) om het volledige bewerkte regio versterken. In het ideale geval nemen twee inleidingen buiten de ingevoegde cassette aan de genomic regio versterken. Gel zuiveren het PCR-product, en zoals eerder beschreven, volgorde de productprestaties met meerdere overlappende inleidingen.
8. Valideert de juiste Spatio-expressiepatronen uit ontleed weefsels/embryo's van de gemanipuleerde vliegen lijnen:
   1. RT-PCR van het totale RNA om te controleren of de expressie van het hybride mRNA product (tabel 1 d) uitvoeren.
   2. Het uitvoeren van een in situ -hybridisatie van het mRNA-product van het belang in het larvale weefsels/embryo voor het valideren van de expressie.
   3. Op het scherm voor de nauwkeurige weefsel-specifieke Spatio-expressiepatronen onder de sequentie-geverifieerd uiteinden-out lijnen, cross elk van de bewerkte lijnen verkregen voor het stuurprogramma van de binaire expressie met de LexO- GFP of LexO- RFP (voor LexA stuurprogramma) lijn (verkrijgbaar bij de voorraad centra van Bloomington) en houd rekening met de LexA of Gal4 verslaggever-genexpressie in embryo-larval en volwassen weefsels onder een fluorescentie Microscoop gereden.

Resultaten

Dit protocol werd met succes gebruikt voor het genereren van een gerichte binaire expressie verslaggever systeem specifiek voor bnl cellen⁵uitdrukken. Het cis-regelgevende elementen (CREs) waarmee complexe Spatio bnl -expressie niet worden gekenmerkt. Daarom, om te bereiken Spatio expressie onder de controle van de endogene bnl regelgevende volgorde, alleen de eerste codering exon van bnl was ontworpen worden vervangen d...

Discussie

Traditioneel, werden Drosophila enhancer vallen gegenereerd door twee verschillende methoden. Een van de manieren bevat willekeurige invoeging van een stuurprogramma (bijv., Gal4) volgorde in het genoom door omzetting (bv., P-element omzetting)¹ . Als alternatief, kunnen de stuurprogramma-sequenties worden geplaatst onder de Transcriptionele controle van een vermeende versterker/promotor regio in een plasmide constructie, die vervolgens zou worden geïntegreerd in een ect...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	klonen
LB-Agar	BD Difco	BD 244520	klonen
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Moleculair biologie
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Moleculair biologie
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Moleculair biologie
UltraPure DNase/RNase-vrij water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Moleculair biologie
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Moleculair biologie
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Moleculair biologie
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Moleculair biologie
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Beperkingsenzym
Primers	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA-sjabloon en vector voor gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA-assemblage
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		DNA-sjabloon voor LexA-amplificatie
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Moleculair biologie
2x PCR PreMix, met kleurstof (rood)	Sydlab	MB067-EQ2R	Moleculair biologie
Gel elutiekit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Moleculair biologie
TRI reagent	Sigma-Aldrich		Moleculair biologie
Direct-zol RNA-zuiveringskits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Moleculair biologie
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Moleculair biologie
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Vlieglijn
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		Vlieglijn
btl-Gal4	Kornberg lab		Vlieglijn
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Vlieglijn
Confocale microscoop SP5X	Leica		Beeldvorming expressiepatroon
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	vlieg duwen
Stereo microscoop	Olympus	SZ-61	vlieg duwen
Microtube homogeniserende stampers	Fisher-Scientific	03-421-217	Genomische DNA-isolatie
NanoDrop spectrofotometer	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA-kwantificering