Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Summary

Hier presenteren we een methode voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door vervanging van de eerste codering exon van genen met transcriptie stuurprogramma's. De CRISPR/Cas9 gebaseerde methode plaatst een transactivator reeks onder de endogene regulering van een vervangen gen, en bijgevolg vergemakkelijkt transctivator expressie uitsluitend in gen-specifieke Spatio patronen.

Abstract

Binaire transcriptie systemen zijn krachtige genetische hulpmiddelen voor het visualiseren en manipuleren van cel lot en gen-expressie in specifieke groepen van cellen of weefsels in modelorganismen op grote schaal gebruikt. Deze systemen bevatten twee componenten als afzonderlijke transgene regels. Een driver regel spreekt een transcriptionele activator onder de controle van weefsel-specifieke initiatiefnemers/versterkers, en een verslaggever/effector lijn havens een target-gen stroomafwaarts geplaatst op de site van de binding van de transcriptie activator. Dieren herbergen van beide componenten induceren weefsel-specifieke transactivation van de genexpressie van een doel. Precieze Spatio uitdrukking van het gen in gerichte weefsels is essentieel voor onbevooroordeelde interpretatie van cel/gen-activiteit. Ontwikkeling van een methode voor het genereren van exclusieve cel/weefsel-specifieke stuurprogramma lijnen is daarom essentieel. Hier presenteren we een methode voor het genereren van zeer weefsel-specifieke gerichte expressie systemen door gebruik te maken een "geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische Repeat/CRISPR-geassocieerde" (CRISPR/Cas)-genoom bewerken techniek gebaseerd. Bij deze methode wordt de endonuclease Cas9 wordt gericht door twee chimeer gids RNAs (gRNA) voor specifieke sites in de eerste codering exon van een gen in het genoom van de Drosophila maken dubbel-strand einden (DSB). Vervolgens kan met behulp van een exogene donor plasmide met de transactivator reeks, de cel-autonome reparatie machines homologie geleide herstellen (HDR) van de DSB, wat resulteert in precieze verwijdering en vervanging van de exon met de transactivator volgorde. De transactivator klopte-in wordt uitgedrukt uitsluitend in cellen waar het cis-regelgevende elementen van het vervangen gen zijn functioneel. Het gedetailleerde stapsgewijze protocol hier gepresenteerd voor het genereren van een binaire transcriptionele stuurprogramma uitgedrukt in Drosophila fgf/branchless-epitheliale/neuronale cellen produceren voor elke gen - of weefsel-specifieke expressie kan worden aangenomen.

Introduction

De genetische toolbox voor gerichte genexpressie is in Drosophila, waardoor het een van de beste modelsystemen te onderzoeken van de functie van genen die betrokken zijn in een breed scala van cellulaire processen goed ontwikkeld. Binaire expressiesystemen, zoals gist Gal4/UAS (upstream activering sequence), werd aangenomen voor weefsel-specifieke enhancer overlapping en gene misexpression in de Drosophila genetische model¹ (Figuur 1). Dit systeem vergemakkelijkt de ontwikkeling van een groot aantal technieken zoals Spatio verordening overexpressie van het gen, misexpression, knock-out in....

Protocol

1. de ontwerpen en de bouw van de gRNA expressie Vector

1. Voor het juist een lang gedefinieerde regio van een exon vervangen gebruikt u een dubbele gRNA aanpak⁶, waarin elke gRNA speciaal te op twee uiteinden van het geselecteerde gebied van belang richten kan. Selecteer de twee sites van de doelstelling van de gRNA binnen de eerste codering exon van het gen voor het verkrijgen van een nauwkeurige gen-specifieke Spatio expressie van het stuurprogramma.
2. Bij Drosophila melanogaster, selecteert u de gRNA doel sites met behulp van het flyCRISPR optimale Target Finder hulpprogramma (http://tools.flycrispr.molbio.w....

Results

Dit protocol werd met succes gebruikt voor het genereren van een gerichte binaire expressie verslaggever systeem specifiek voor bnl cellen⁵uitdrukken. Het cis-regelgevende elementen (CREs) waarmee complexe Spatio bnl -expressie niet worden gekenmerkt. Daarom, om te bereiken Spatio expressie onder de controle van de endogene bnl regelgevende volgorde, alleen de eerste codering exon van bnl was ontworpen worden vervangen d.......

Discussion

Traditioneel, werden Drosophila enhancer vallen gegenereerd door twee verschillende methoden. Een van de manieren bevat willekeurige invoeging van een stuurprogramma (bijv., Gal4) volgorde in het genoom door omzetting (bv., P-element omzetting)¹ . Als alternatief, kunnen de stuurprogramma-sequenties worden geplaatst onder de Transcriptionele controle van een vermeende versterker/promotor regio in een plasmide constructie, die vervolgens zou worden geïntegreerd in een ect.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	cloning
LB-Agar	BD Difco	BD 244520	cloning
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Molecular Biology
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Molecular Biology
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Molecular Biology
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Restriction enzyme
Primers	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		DNA template for LexA amplification
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
Gel elution kit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Molecular Biology
TRI reagent	Sigma-Aldrich		Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Molecular Biology
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		Fly line
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Confocal Microscope SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA quantification