Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58270

⸱

4 december 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Hematology, Oncology and Immunology, University of Tübingen, 2Dept. of Endocrinology, Diabetology, Clinical Pathology and Metabolism, University of Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

Chronische lymfatische leukemie (CLL) is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. NFAT transcriptiefactoren zijn belangrijk regulatoren van ontwikkeling en activering in vele celtypes. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van chromatine immunoprecipitation (ChIP) in menselijke CLL cellen te identificeren roman doelgenen van NFAT2.

Samenvatting

Chronische lymfatische leukemie (CLL) wordt gekenmerkt door de groei van kwaadaardige B-cell klonen en vertegenwoordigt de meest voorkomende leukemie in westerse landen. De meerderheid van CLL patiënten tonen een vadsig verloop van de ziekte en het fenotype van een anergic van hun leukemie cellen, verwijzend naar een B-cel receptor niet reageert op externe stimulatie. We hebben onlangs aangetoond dat de transcriptiefactor NFAT2 een belangrijke regulator van de anergie in CLL is. Een grote uitdaging in de analyse van de rol van een transcriptiefactor in verschillende ziekten is de identificatie van haar specifieke doelgenen. Dit is van groot belang voor de opheldering van pathogenetische mechanismen en potentiële therapeutische interventies. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een klassieke techniek om aan te tonen van eiwit-DNA interacties en kan daarom worden gebruikt om te identificeren directe doelgenen van transcriptiefactoren in zoogdiercellen. Hier, was ChIP gewend LCK identificeren als een directe doel-gen van NFAT2 in menselijke cellen van CLL. DNA en geassocieerde eiwitten zijn kruisverwijzende met formaldehyde en vervolgens geschoren met het ultrasoonapparaat in DNA-fragmenten van ongeveer 200-500 basenparen (bp). Kruislings gekoppelde DNA-fragmenten die zijn gekoppeld aan de NFAT2 zijn dan selectief immunoprecipitated uit het puin van de cel met behulp van een antilichaam αNFAT2. Na zuivering, worden de bijbehorende DNA-fragmenten gedetecteerd via kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). DNA-sequenties met duidelijk verrijking vertegenwoordigen regio's van het genoom die het doelwit van NFAT2 in vivo. Passende afknippen van het DNA en de selectie van het vereiste antilichaam zijn van bijzonder groot belang voor de succesvolle toepassing van deze methode. Dit protocol is ideaal voor de demonstratie van directe interacties van NFAT2 met doelgenen. De belangrijkste beperking is de moeilijkheid om de ChIP in grootschalige testen analyseren van de doelgenen van meerdere transcriptiefactoren in intact organismen in dienst.

Inleiding

Chronische lymfatische leukemie (CLL) vertegenwoordigt de meest voorkomende leukemie bij volwassenen in de westerse landen, vertonen verschillende accumulatie van CD19, CD23 en CD5 uitdrukken van de rijpe B cellen1. De meeste patiënten vertonen een cursus vadsig ziekte, die geen specifieke behandeling voor vele jaren geïmplementeerde vergt. Sommige patiënten Toon daarentegen snelle progressie vereisen onmiddellijke therapeutische interventies met immuun-chemotherapie of andere gerichte therapieën2,3. Nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFAT) is een familie van transcriptiefactoren beheersing van verschillende ontwikkelings- en activering processen in talrijke cel typen4,5,6. We toonden onlangs overexpressie en constitutionele activering van NFAT2 in CLL cellen van patiënten met vadsig ziekte7. Hier, regelt het een niet-reagerende staat aan B-cel receptor stimulatie anergie7genoemd. Om aan te tonen dat NFAT2 aan de organisator van lymfocyt-specifieke proteïne tyrosine kinase (LCK bindt) en LCK expressie in menselijke CLL cellen, een specifieke chromatine immunoprecipitation assay regelt werd (ChIP) ontwikkeld en ingezet.

ChIP is een van de verschillende technieken voor het onderzoeken van de rol van transcriptiefactoren in gen expressie8. Genexpressie is strak georkestreerd in een zeer complexe wijze door verschillende regelgevers met transcriptiefactoren een onvervangbaar deel te nemen aan dit proces9,10,11,12. Transcriptiefactoren regulering van de expressie van genen in een ruimtelijke en temporele context geconstateerd in talrijke soorten (bijvoorbeeld voor ontwikkeling en differentiatie)13,14,15, 16,17,18. Fouten in de ingewikkelde controlemechanismen waarbij transcriptiefactoren kunnen leiden tot een verscheidenheid van pathologische processen waaronder kanker19,20. Vandaar, identificatie van transcriptiefactoren en hun respectieve doelstellingen kan bieden nieuwe therapeutische mogelijkheden21,22. Om te onderzoeken van dit intrigerende veld zijn verschillende methoden beschikbaar, zoals de ChIP, elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA), verschillende DNA pull-down testen en verslaggever-assays8,11,12, 23 , 24.

Om aan te tonen dat een bepaalde transcriptiefactor met specifieke regio's van het genoom interageert is in vivo ChIP een ideale techniek25. Voor dit doel, DNA en geassocieerde eiwitten in levende cellen worden kruiselings gekoppelde met behulp van UV-bestraling of formaldehyde (kruislings gekoppelde ChIP, XChIP). Deze stap wordt weggelaten om betere DNA en eiwit herstel in de zogenaamde native ChIP (NChIP)26te verkrijgen. De DNA-eiwitcomplexen worden vervolgens geschoren met het ultrasoonapparaat in stukjes van ongeveer 200-500 basenparen (bp) en immunoprecipitated uit het puin van de cel met behulp van een specifiek antilichaam tegen de transcriptiefactor van belang. De bijbehorende DNA-fragmenten zijn vervolgens gezuiverd en gekenmerkt door PCR, moleculaire klonen en rangschikken. Alternatieve technieken microarrays (ChIP-on-Chip) of de volgorde van de volgende generatie (ChIP-Seq) gebruiken voor het analyseren van de immunoprecipitated van DNA.

ChIP voor het eerst werd geïntroduceerd door Gilmour en Lis in 1984 toen ze UV gebruikt licht aan covalent kruislings gekoppelde DNA en eiwitten gebonden in levende bacteriën27. Lysis van de cel en immunoprecipitation van bacteriële RNA polymerase, werden specifieke sondes van bekende genen gebruikt om de in vivo distributie en de dichtheid van RNA polymerase kaart. De methode werd later gebruikt door de dezelfde onderzoekers voor het analyseren van de verdeling van eukaryotische RNA polymerase II op warmte schok eiwit genen bij Drosophila28. De bepaling van de XChIP werd verder verfijnd door Varshavsky en collega's die voor het eerst gebruikt formaldehyde dwarsbinding om te bestuderen van de vereniging van Histon H4 met warmte schok eiwit genen29,30. De NChIP benadering, die het voordeel van een betere DNA en eiwit herstel als gevolg van natuurlijk intact epitopes draagt en dus meer antilichamenspecificiteit, voor het eerst werd beschreven door Hebbes en collega's in 198831.

Het voordeel van ChIP in vergelijking met andere technieken voor het analyseren van DNA-eiwit interactie is in feite dat de werkelijke interactie van een transcriptiefactor onderzocht in vivo en geen sondes worden kan of kunstmatige omstandigheden gemaakt door buffers of gels 8,11,12in dienst. Door het combineren van ChIP met next-generation sequencing, kunnen meerdere doelen tegelijk worden geïdentificeerd.

Belangrijke beperkingen van deze techniek zijn de beperkte toepasbaarheid voor grootschalige testen in intact organismen25. De analyse van differentiële gen-expressiepatronen kunnen ook uitdagende met behulp van de ChIP technieken als de respectieve eiwitten worden uitgedrukt, alleen op een laag niveau of tijdens smalle tijd windows. Een ander potentieel beperkende factor is de beschikbaarheid van een passende antilichaam geschikt voor ChIP11.

Het protocol van de ChIP hier gepresenteerd kan worden gebruikt voor de identificatie in vivo van doelgenen van een transcriptiefactor door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Specifiek, was het doel om het identificeren van de roman doelgenen van NFAT2 in CLL. ChIP werd gekozen omwille van zijn potentieel te tonen direct de binding van NFAT2 aan de promotor regio's van verschillende doelgenen onder natuurlijke omstandigheden in menselijke CLL patiënt cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met menselijk materiaal werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Tübingen en geïnformeerde toestemming is verkregen van alle patiënten die hebben bijgedragen aan deze studie monsters.

1. isolatie en stimulatie van de Jurkat cellen

Opmerking: Voor het optimaliseren van het protocol, gebruikt u de Jurkat cel waarvan bekend is dat de hoge niveaus van NFAT2 express. Alle stappen worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow.

  1. Bereiden van 50 mL RPMI 1640 aangevuld met 10% FCS en 1% penicilline/streptomycine door opwarming van de aarde het tot 37 ° C in een waterbad.
  2. Cultuur Jurkat cellen voor 1-2 d in een maatkolf van cel cultuur bij 37 ° C en 5% CO2 20 ml RPMI 1640 aangevuld met 10% FCS en 1% penicilline/streptomycine met een dichtheid van ongeveer 2 x 106 cellen/mL (cellen worden geteld met Trypan blauw kleuring en een Neubauer kamer onder de Microscoop) en oogst ze door gedurende 5 min. op 200 x gcentrifugeren.
  3. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet en resuspendeer de cellen in 10 mL RPMI 1640 aangevuld met 10% FCS en 1% penicilline/streptomycine. Vervolgens de cellen met een conventionele trypan blauw kleuring en een Neubauer kamer onder de Microscoop te tellen.
  4. De cellen uit stap 1.3 gedurende 5 min. op 200 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende vloeistof door aspiratie. Vervolgens resuspendeer de cellen bij een dichtheid van 2 x 107 cellen/mL in RPMI 1640 pipetteren met 10% FCS en 1% penicilline/streptomycine en overdracht 1 mL in de tube van een nieuwe conventionele 5 mL aangevuld.
  5. Het stimuleren van de cellen door 32.4 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en 1 µM ionomycin toe te voegen. Vervolgens Incubeer de cellen gedurende 16 uur bij 37 ° C en 5% CO2 met het deksel van de buis geopend (om besmetting te voorkomen, een verzegeling film luchtdoorlatend kan worden gebruikt).

2. isolatie en stimulatie van primaire CLL cellen van menselijke patiënten

Opmerking: Patiënten monsters werden verworven en gestimuleerd als eerder beschreven7. Alle stappen worden uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow.

  1. Voorbereiden van de apparatuur die nodig is te trekken bloed uit patiënten en voor het uitvoeren van een verlopende scheiding van dichtheid: 21-G naalden, tourniquet, NH4-heparine-bloed collectie spuiten (bijvoorbeeld S-monovettes), 1 x PBS en kleurovergang medium dichtheid (dichtheid 1.077 g/mL) .
  2. Venapunctie, tekenen het bloed van CLL patiënten (ca. 40 mL bloed per patiënt) in de spuiten. Breng het bloed in 50 mL conische buisjes. Spoel de injectiespuit met 10 mL PBS en bundelen de bloed-PBS-suspensie in de 50 mL tubes (pas het aantal buisjes met het volume van bloed).
  3. Bereiden van het medium dichtheid kleurovergang in een conische buis van verse 50 mL 15 mL. Vervolgens laag 35 mL van de bloed-PBS-ophanging zorgvuldig op kleurovergang medium dichtheid. Voor dit doel, houdt de buis onder een vlakke hoek en Pipetteer langzaam de bloed-PBS-schorsing tegen de muur van de onderkant van de conische tube van 50 mL. Als meer van de bloed-PBS-ophanging is zich ophopen in de conische tube van 50 mL, de hoek van de buis tot een rechte hoek vergroten Herhaal deze stap volgens het volume van de bloed-PBS-ophanging.
  4. Uitvoeren van centrifugeren op 560 x g gedurende 20 minuten (zonder de rem), en daarna uitpakken de mononucleaire cellen fase waarin de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). Om dit te doen, de witte interfase van de dichtheid verlopende scheiding met een serologische 5 mL-pipet verzamelen en overbrengen naar een nieuwe conische tube van 50 mL.
  5. Vul de celsuspensie tot 50 mL met PBS en Centrifugeer gedurende 5 min op 360 x g. Verwijder het supernatant door aspiratie. Herhaal deze stap met centrifugeren voor 5 min op 275 x g. Vervolgens bundelen de cellen van één patiënt in 5-10 mL PBS in een conische tube van 50 mL.
  6. Tellen de cellen zoals beschreven in punt 1.3.
    Opmerking: Het hangt af van het aandeel van CLL cellen in de geïsoleerde PBMCs, als de cellen direct voor deze procedure kunnen worden gebruikt of een B-cel isolatie moet plaatsvinden, bijvoorbeeld via magnetische cel sorteren (MACS). Het isolement van de B-cel wordt aangeraden maar kan worden weggelaten als het aandeel van CLL cellen hoger dan 95% van de totale lymfocyten is (bepaald via stroom cytometry). Bloed van CLL patiënten is vast en lysed volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens een kleuring met CD19-FITC en CD5-PE antilichamen wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant en de cellen worden geanalyseerd via stroom cytometry. Een voorbeeldige patiënt is afgebeeld in Figuur 1, waarin het aandeel van CLL cellen 89.03 is %. Zo heeft een B-cel isolatie moet worden uitgevoerd in deze patiënt. Het aandeel van fysiologische B cellen is te verwaarlozen (3.72% in het voorbeeld).
  7. Wassen van de cellen met 10 mL voorverwarmde (37 ° C) RPMI 1640 aangevuld met 10% FCS, 1% penicilline/streptomycine, 100 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM natrium pyruvaat en 50 mM β-mercaptoethanol gedurende 5 min. op 200 x g en verwijder de bovendrijvende vloeistof door aspiratie.
  8. Aanpassen van de cellen tot 2 x 107 cellen/mL in RPMI 1640 aangevuld met 10% FCS, 1% penicilline/streptomycine, 100 mM niet-essentiële aminozuren, 1 mM natrium pyruvaat en 50 mM β-mercaptoethanol (37 ° C) en vulling 1 mL van de celsuspensie in een tube van 5 mL.
    Opmerking: De ß-mercaptoethanol is werkzaam tegen oxidatieve stress.
  9. Het stimuleren van de cellen door 32.4 nM PMA en 1 µM ionomycin toe te voegen. Vervolgens Incubeer de cellen gedurende 16 uur bij 37 ° C en 5% CO2 met het deksel van de buis geopend (om besmetting te voorkomen, een verzegeling film luchtdoorlatend kan worden gebruikt).
    Opmerking: Om het niveau van stress de cellen kunnen rusten gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2 in de incubator vóór de 16 h van stimulatie.

3. fixatie Lysis van de cel en chromatine schuintrekken

Opmerking: Patiënten monsters en Jurkat cellen zijn vaste en lysed met een commercieel beschikbare ChIP kit volgens de instructies van de fabrikant met de wijzigingen zoals eerder beschreven7. De vastlegging wordt uitgevoerd onder de motorkap van een laminaire flow.

  1. Een 1,5 mL-buis met 1 mL van 37% formaldehyde, een 1,5 mL-buis met 1 mL van 1,25 M glycine, een tube van 5 mL met 4 mL 1 x PBS en een doos met ijs bereiden voor de fixatie van de cellen.
  2. Na stimulatie van de cellen voor de respectieve incubatietijd in stap 1.5 of 2.9, draai de buizen van 5 mL bij 200 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cellen in 500 µL van PBS in de buizen van 5 mL.
  3. 340 µM formaldehyde (13,5 µL van 37% formaldehyde) aan de cellen toevoegen. Incubeer de schorsing voor 2,5 min (Jurkat cellen) of 5 min (patiënt monster) bij kamertemperatuur na korte mengen door zorgvuldig pipetteren omhoog en omlaag.
    Let op: Langdurige fixatie tijd nodig is voor de primaire cellen om te verzekeren dat optimale schuintrekken.
  4. 125 mM glycine (57 µL van 1,25 M glycine) toevoegen om te stoppen de fixatie en incubeer gedurende een ander 5 min. Zet de cellen op ijs onmiddellijk daarna en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant door aspiratie.
  5. De cellen tweemaal met 1 mL ijskoud PBS bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C wassen en verwijder het supernatant telkens door aspiratie.
    Opmerking: Na de fixatie, het protocol kan worden onderbroken. Vaste cellen moeten worden opgeslagen bij-80 ° C. Om te testen, als de epitoop van het antilichaam wilde gebruiken in het volgende protocol wordt niet gemaskeerd via fixatie, kunnen aanvullende monsters worden gebruikt voor analyse via de Elektroforese van het gel van de SDS-pagina en westelijke vlek. Deze stappen zijn uitgevoerd met 100 µg eiwit volgens de instructies van de fabrikant. Alle αNFAT2 antilichamen worden gebruikt bij een verdunning van 1:1000, het antilichaam GAPDH bij een verdunning van 1:10000. Een voorbeeldige afbeelding van vaste monsters van Jurkat cellen met geschikte en ongeschikte antilichamen is afgebeeld in Figuur 2.
  6. Resuspendeer de pellet cel in 5 mL verkrijgbare lysis-buffermengsel 1 door pipetteren omhoog en omlaag. Vervolgens Leg de monsters op het ijs op een shaker en incubeer hen gedurende 10 minuten terwijl het schudden.
    Opmerking: Voorafgaand aan cellysis, de cellen kunnen worden gedesintegreerd voor 10 s in vloeibare stikstof. Dit is nuttig voor Jurkat cellen maar in primaire patiënt monsters moet worden vermeden. Voor de desintegratie, plaatst u de buizen van 5 mL voor 5 s in 5-10 mL vloeibare stikstof in een bepaalde container. Draag veiligheidsbril en passende veiligheidshandschoenen.
  7. Vervolgens centrifugeren van de buizen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant zorgvuldig door pipetteren.
  8. Meng de cellen in 5 mL verkrijgbare lysis-buffermengsel 2 door omhoog en omlaag pipetteren en incubeer gedurende 10 min op ijs terwijl het schudden. Dan de buizen bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C gecentrifugeerd en verwijder het supernatant zorgvuldig door pipetteren.
  9. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL (Jurkat cellen) of 140 µL (patiënt monsters) van het scheren van de buffer 1 met 1 x proteaseinhibitor (5 µL of 1.4 µL, respectievelijk) en het mengsel gedurende 10 minuten op ijs uit te broeden.
  10. Draag voor een chromatine schuintrekken, 140 µL van de celsuspensie uit stap 3.9 in ultrasoonapparaat buizen (Vermijd produceren luchtbellen en herhaal deze stap indien nodig als gevolg van monstervolume). Plaats de buizen in de gerichte ultra-ultrasoonapparaat bij een temperatuur van 7 ° C en schuintrekken voor 10 min (cellijn) of 7,5 min (patiënt monsters) met een gemiddelde incident kracht van 9.375 W te verkrijgen van 200-500 bp DNA-fragmenten.
  11. Ten slotte, centrifugeer bij 15700 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in de kleine centrifuge en verzamelen de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis.
  12. Om te testen voor de juiste fragment maten, 20 µL van de sheared chromatine via gel-elektroforese in 1,5% TBE agarose gel te analyseren. Een voorbeeldige beeld van sheared chromatine van Jurkat cellen van goede en slechte kwaliteit is afgebeeld in Figuur 3. Op dit punt, kan het protocol mogelijk worden onderbroken. Sheared chromatine moet worden opgeslagen bij-80 ° C.

4. chromatine Immunoprecipitation

Opmerking: De chromatine immunoprecipitation werd uitgevoerd met een commercieel beschikbare ChIP kit volgens de instructies van de fabrikant met wijzigingen7.

  1. Berekenen van het aantal immunoprecipitations (70 µL (Jurkat cellen) of 15 µL (patiënt monsters) sheared chromatine plus één antilichaam) en bereiden 20 µL van eiwit A gecoat kralen per neerslag in een 1,5 mL-buis. Wassen van de kralen in 40 µL 1 x ChIP buffer 1 per neerslag door pipetteren omhoog en omlaag, laat de kralen rusten in een magnetische rek voor 1 min en verwijder de bovendrijvende vloeistof door pipetteren. Voer deze stap vier keer in totaal. Uiteindelijk, resuspendeer de kralen in het oorspronkelijke volume met 1 x ChIP buffer 1.
  2. Gebruik voor de immunoprecipitation zelf, 10 µg van het antilichaam αNFAT2 (7A6) te vangen NFAT2 met zijn afhankelijke doel sequenties. 2,5 µg voor een konijn IgG antilichamen (DA1E) als een IgG-besturingselement gebruiken. Bereiden de reacties in verse 1,5 mL buizen zoals aangegeven in tabel 1.
    Opmerking: Het is belangrijk dat het gebruik van een monoklonaal antilichaam met hoge affiniteit waarvan epitope wordt niet gemaskeerd tijdens fixatie voor dit protocol. Polyclonal antilichamen introduceren een extra mate van variatie waardoor het aanzienlijk moeilijker op de juiste manier de resultaten moet interpreteren ontvangen.
  3. Incubeer het mengsel uit stap 4.2 's nachts bij 4 ° C op een draaiend wiel bij 6 omwentelingen per minuut.
  4. Op de volgende dag spin de buizen voor 5 s bij 7.000 x g in de kleine centrifuge, broeden ze in een magnetische rek voor 1 min en verwijder de bovendrijvende vloeistof door aspiratie. De kralen met elk van de buffers wassen 1, 2, 3 en 4 keer achter elkaar wassen.
  5. Om dit te doen, resuspendeer de kralen in 350 µL van was buffer en incubeer hen gedurende 5 min bij 4 ° C op een draaiend wiel bij 6 omwentelingen per minuut.
  6. Draai daarna de buizen voor 5 s bij 7000 x g in de kleine centrifuge. Dan, plaats hen voor 1 min in een magnetische rack, verwijder het supernatant en toevoegen de volgende was buffer.
  7. Na de laatste stap van het wassen, verwijder de bovendrijvende vloeistof door pipetteren, neem de kralen in 100 µL van elutie buffer 1 en broeden ze gedurende 30 minuten op een draaiend wiel bij 6 omwentelingen per minuut.
  8. Draai de buizen kort (5 s bij 7000 x g in de kleine centrifuge) en plaats ze in een magnetische rek voor 1 min.
  9. Vervolgens kopieert u het supernatant pipetteren tot een nieuwe 1,5 mL koker en voeg 4 µL van elutie buffer 2.
  10. Als u wilt maken de invoercontrole, meng 1 µL van de sheared chromatine met 99 µL van elutie buffer 1 en 4 µL van elutie buffer 2 (bij deze instelling, er zijn drie buizen per patiënt: één input controle, een IgG-control en één αNFAT2 monster).
  11. Incubeer de monsters gedurende 4 uur bij 65 ° C en 1300 rpm in een 1,5 mL tube shaker. Voeg 100 µL van 100% isopropanol, vortex en spin de monsters voor 5 s bij 7000 x g in de kleine centrifuge.
  12. Resuspendeer de beschikbare magnetische kralen door grondig vortexing, voeg 10 µL van de parels aan elk monster en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een draaiend wiel bij 6 omwentelingen per minuut.
  13. Na de incubatie, draai de buizen voor 5 s bij 7000 x g in de kleine centrifugeren en plaats hen voor 1 min in een magnetische rack. Verwijder het supernatant door aspiratie.
  14. Resuspendeer de kralen in 100 µL was buffer 1. Omkeren van de buizen om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een draaiend wiel bij 6 omwentelingen per minuut.
  15. Draai de buizen voor 5 s bij 7000 x g in de kleine centrifuge, plaats hen voor 1 min in een magnetische rack en de bovendrijvende vloeistof verwijderen door pipetteren. Herhaal de stappen 4.13-4.14 met was buffer 2.
  16. Vervolgens verwijderen van de was-buffer door aspiratie, resuspendeer de kralen in 55 µL van elutie buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op het draaiende wiel op 6 tpm tot elueer de geprecipiteerde DNA. Tot slot, draai de buizen voor 5 s bij 7000 x g in de kleine centrifuge, plaats hen voor 1 min in een magnetische rek en breng het supernatant in nieuwe 1,5 mL buizen.
    Opmerking: Hier het protocol kan worden potentieel gepauzeerd. De eluted DNA moet vervolgens worden opgeslagen bij-20 ° C.

5. detectie van NFAT doelgenen in CLL cellen.

  1. Voeren de qRT-PCR-reactie in tweevoud voor elk monster als aangegeven in tabel 2.
    Opmerking: Voor de detectie van doelgenen een kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) wordt uitgevoerd met behulp van een commercieel beschikbare qRT-PCR-Mix met een Real-time PCR-instrument.
  2. Gebruik witte reactie van de 96-wells-platen voor de reacties en de RT-PCR-instrument. De fietsen omstandigheden zijn als volgt: 95 ° C gedurende 30 s, [95 ° C gedurende 5 s, 60 ° C gedurende 30 s] x 40 cycli.
    Opmerking: Een seriële verdunning van de input (onverdund of verdund 1:10, 1:100 en 1:1000 in nuclease-gratis water) wordt gebruikt voor de berekening van de relatieve verrijking. In de Jurkat cellen, werd IL-2 gebruikt als een positieve controle32. CD40L, een bekende doelstelling van NFAT2 in de B-cellen, werd gebruikt als positieve controle in CLL cellen en LCK als een voorbeeld voor een nieuwe doelgroep gen van NFAT2 in CLL33,34. De inleidingen voor de CD40L, de IL-2 en LCK promotor regio worden beschreven in de tabel van specifieke reagentia en apparatuur.

6. normalisatie en Data-analyse

Opmerking: De relatieve verrijking voor de promotor regio's van belang (IL-2, CD40L of LCK) wordt berekend met behulp van de IgG-control voor normalisatie.

  1. Bepaal eerst Ct (drempel cyclus) waarden voor de input seriële verdunning, de IL-2, CD40L en de LCK promotor regio via de evaluatiesoftware van qRT-PCR gegevens.
  2. Een standaard curve voor de concentraties via de seriële verdunning van de input definiëren. Bereken de concentratie voor de IL-2, CD40L en de LCK promotor regio voor elk duplicaat van elk monster met deze standaard curve.
  3. Vervolgens berekent het gemiddelde van de duplicaten. Stel vervolgens het IgG immunoprecipitation monster als referentie. De relatieve verrijking voor dit voorbeeld definiëren als 1.0 en het andere monster (van de NFAT2-immunoprecipitation) om deze verwijzing te vergelijken.
  4. Ten slotte, bereken de relatieve verrijking door het verdelen van de concentratie van de monsters door de concentratie van het IgG-verwijzing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont een voorbeeldige stroom cytometry analyse van een patiënt van de CLL na kleuring met CD19-FITC en CD5-PE antilichamen uitgevoerd. Figuur 1a blijkt de gating van de lymfocyten, de meerderheid van de cellen in het bloed van CLL patiënten vertegenwoordigt. Figuur 1b toont het aandeel van de CD19+/CD5+ CLL cellen die procent van de 89.03 van lymfocyten in het volgende...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De kritische stappen voor het uitvoeren van een succesvolle ChIP test zijn de selectie van een geschikte antilichaam en de optimalisatie van de chromatine proces25schuintrekken. De selectie van het antilichaam αNFAT2 bleek bijzonder uitdagende tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Hoewel er verschillende αNFAT2 antilichamen verkrijgbare en de meerderheid van deze werkt prima voor het westelijke bevlekken en andere toepassingen, was kloon 7A6 de enige antilichaam dat met succes kan worden gebru...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de DFG verlenen MU 3340/1-1 en de Deutsche Krebshilfe verlenen 111134 (beide toegekend aan M.R.M.). Wij danken Elke Malenke voor uitstekende technische bijstand).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyde p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Sample BufferThermo ScientificB0007
Anti-NFAT2 antibodyAlexis1008505Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibodyCell Signaling8032SClone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP GradeAbcamab2796Clone 7A6
big CentrifugeEppendorf5804RKan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
CD19-FITC mouse Anti-humanBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburKan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Gel Transfer DeviceThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular sizeThermo ScientificIB23001
iDeal ChIp-seq kit for HistonesDiagenodeC01010059
Ionomycin calcium saltSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mgLI-COR Biosciences925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging SystemLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche4729692001Kan worden vervangen door andere platen in verschillende real-time PCR-instrumenten
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 AFA-grade waterCovaris520101
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Magnetic rack, DynaMag-15 MagnetThermo Scientific12301DKan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100XThermo Scientific11140050
Microscope Axiovert 25Zeiss451200Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer improved counting chamberKarl Hecht GmbH             Co KG40442012Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
Nuclease-free waterPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-wellThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicillin/Streptomycin 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor region forwardSigma Aldrich5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forwardSigma Aldrich5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forwardSigma Aldrich5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverseSigma Aldrich5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype ControlCell Signaling# 3900SClone DA1E
Real-time PCR instrumentRocheLightCycler 480Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
Roller mixersPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
small CentrifugeThermo ScientificHeraeus Fresco 17Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten
Sodium PyruvateThermo Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling#12498
Trypan Blue solutionSigma Aldrich93595-50ML

Referenties

  1. Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
  2. Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
  3. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
  4. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
  5. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
  6. Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
  7. Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755(2017).
  8. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  9. Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
  10. Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
  11. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  12. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  13. Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
  14. Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
  15. Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
  16. Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
  17. Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
  18. Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
  19. Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
  20. Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
  21. Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
  22. Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
  23. Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
  24. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  25. Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
  26. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  27. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  28. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  29. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  30. Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
  31. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  32. Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
  33. Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
  34. Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
  35. Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130(2017).
  36. Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724(2017).
  37. Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
  38. Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
  39. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  40. Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
  41. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  42. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  43. Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Analyse van transcriptiefactorenproteïne-DNA-interactieskwantitatieve real-time PCRsonicatie-shearinganti-NFAT2-antilichaamLCK-gen-detectieformaldehydefixatie
Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.