Method Article

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol introduceert een eenvoudige twee stappen methode voor het differentiëren van hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen xeno- en voorwaarden feeder cel-vrije cultuur. De cel kweekmethoden gepresenteerde inschakelen kostenefficiënte en grootschalige productie van klinische kwaliteit cellen toepassing op hoornvlies cel therapie gebruik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoornvlies limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs) zijn verantwoordelijk voor het continu vernieuwen het hoornvlies epithelium en dus behoud van hoornvlies homeostase en visuele helderheid. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide LESCs bieden een veelbelovende cel bron voor hoornvlies cel substitutietherapie. Ongedefinieerde, XENOGENECELLEN cultuur en differentiatie voorwaarden variatie veroorzaken in de onderzoeksresultaten en de klinische vertaling van hPSC afkomstige therapeutics belemmeren. Dit protocol biedt een reproduceerbare en efficiënte methode voor hPSC-LESC differentiatie xeno- en voorwaarden feeder cel-vrij. Ten eerste serveert enkelgelaagde cultuur van ongedifferentieerde hPSC op recombinante laminin-521 (LN-521) en gedefinieerde hPSC medium als een fundament voor de robuuste productie van kwalitatief hoogwaardige grondstof voor differentiaties. In de tweede plaats levert een snelle en eenvoudige hPSC-LESC differentiatie methode LESC populaties in slechts 24 dagen. Deze methode omvat een vierdaags oppervlakte ectodermal inductie in suspensie met kleine molecules, gevolgd door aanhangend cultuur fase op LN-521/collageen IV combinatie matrix in gedefinieerde hoornvlies epitheliale differentiatie medium. Cryostoring en uitgebreide differentiatie verder zuivert de celpopulatie en kunt bankieren van de cellen in grote hoeveelheden voor cel therapie producten. De resulterende hoogwaardige hPSC-LESCs bieden een mogelijke nieuwe behandeling strategie voor hoornvlies oppervlakte wederopbouw voor de behandeling van de cel van de stam van de limbal deficiëntie (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het transparante hoornvlies aan de oculaire oppervlakte kunt licht in te voeren van het netvlies en biedt de meeste refractieve vermogen van het oog. De buitenste laag, de gestratificeerde hoornvlies epitheel, wordt voortdurend geregenereerd door limbal epitheliale cellen van de stam (LESCs). De LESCs bevinden zich in de basale laag van de limbal nissen in het corneoscleral junction1,2. LESCs geen specifieke en unieke markers, zodat hun identificatie een meer uitgebreide analyse van een aantal vermeende markeringen vereist. Epitheliale transcriptie factor p63, en met name N-terminaal afgeknotte transcript van de alpha isovorm van p63 (ΔNp63α), is voorgesteld als een relevante positieve LESC markeerdraad3,4. Asymmetrische verdeling van LESCs kan ze zelf vernieuwen, maar ook de productie van nakomelingen die centripetaal en anteriorly worden gemigreerd. Als de cellen vooruitgang richting het hoornvlies oppervlak ze geleidelijk verliezen hun stemness en ten slotte terminaal onderscheid maken naar oppervlakkige squamous cellen die voortdurend verloren gaan van het hoornvlies oppervlak.

Schade aan een van de lagen van het hoornvlies kan leiden tot ernstige visuele handicap, en hoornvlies gebreken zijn dus een van de belangrijkste oorzaken van zicht verlies wereldwijd. In de cel van de stam van de limbal-deficiëntie (LSCD), is de limbus vernietigd door ziekte of een trauma die tot conjunctivalization en troebelingen van het hoornvlies oppervlak en daaropvolgende verlies van visie5,6 leidt. Cel substitutietherapie met behulp van autologe of allogene limbal transplantaties biedt de strategie van een behandeling voor patiënten met LSCD4,,7,,8,9. Echter, oogsten van autologe transplantaten draagt een risico van complicaties voor het gezonde oog en donorweefsel is schaars. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), specifiek menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), kan dienen als een onbeperkte bron van klinisch relevante celtypen, met inbegrip van hoornvlies epitheliale cellen. Zodoende, hPSC afkomstige LESCs (hPSC-LESCs) vormen een aantrekkelijke nieuwe cel voor oogbeschadigingen en/of cel substitutietherapie.

Traditioneel, hebben zowel de ongedifferentieerde hPSC cultuur-methoden en de protocollen van de differentiatie te LESCs vertrouwd op het gebruik van niet-gedefinieerde feeder cellen, dierlijke sera, geconditioneerde media of vruchtwater membranen10,11, 12 , 13 , 14 , 15. onlangs, streven naar veiligere cel therapie producten de zoektocht naar meer gestandaardiseerde en xeno-vrije cultuur en differentiatie protocollen hebben gevraagd. Dientengevolge, zijn verschillende gedefinieerde en xeno-gratis methoden voor langetermijnkweek van ongedifferentieerde hPSCs nu verkrijgbare16,17,18. Als een continuüm, gestuurde differentiatie protocollen te vertrouwen op moleculaire signalen bij hPSCs aan hoornvlies epitheliale lot onlangs geweest geïntroduceerd19,20,21,22, 23. Nog veel van deze protocollen beide ongedefinieerde, feeder gebaseerd hPSCs gebruikt als materiaal of complexe, XENOGENECELLEN groeifactor cocktail voor differentiatie wordt gestart.

Het doel van dit protocol is bedoeld als een robuuste, geoptimaliseerde, xeno- en feeder-vrije hPSC cultuur methode en latere differentiatie naar hoornvlies LESCs. Enkelgelaagde cultuur van pluripotente hPSCs op laminin-521 (LN-521) matrix gedefinieerd, albumine-gratis hPSC medium (specifiek essentiële 8 Flex) kunt snelle productie van homogene grondstof voor differentiaties. Daarna een eenvoudige, de strategie van de differentiatie van de twee stappen begeleidt hPSCs naar oppervlakte ectodermal lot in suspensie, gevolgd door aanhangend differentiatie naar LESCs. Een waar > 65% ΔNp63α express-celpopulatie wordt verkregen binnen 24 dagen. Het protocol xeno - en feeder-free is getest met verschillende hPSC lijnen (zowel hESCs als hiPSCs), zonder dat er gelden voor de cel specifieke optimalisering van de lijn. De protocollen voor het weekend-vrije onderhoud, passaging, cryostoring en hPSC-LESC fenotypering hier beschreven inschakelen productie van grote hoeveelheden van kwalitatief hoogwaardige LESCs voor klinische of onderzoek doeleinden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Universiteit van Tampere heeft de goedkeuring van de nationale autoriteit voor Medicolegal zaken Finland (Dnro 1426/32/300/05) voor onderzoek naar menselijke embryo's. Het Instituut heeft ook ondersteunende verklaringen van de ethische commissie van de Pirkanmaa ziekenhuis District te ontlenen, cultuur, en hESC lijnen (Skottman/R05116) te onderscheiden en te gebruiken hiPSC lijnen in ophthalmic onderzoek (Skottman/R14023). Geen nieuwe cellijnen zijn afgeleid voor deze studie.

Opmerking: Het protocol beschreven is gebaseerd op specifieke, verkrijgbare hPSC en hoornvlies epitheel differentiatie media. Raadpleeg de Tabel van materialen voor fabrikant/leverancier informatie en catalogus nummers.

1. invoering van Xeno - en Feeder-free hPSC cultuur

  1. Voorbereidingen
    1. Jas 24-Wells-platen met menselijke recombinante laminin-521 (LN-521). Gebruik voor de eerste feeder-gratis (FF) passage, LN-521 bij een concentratie van 1,09 µg/cm2, en op 0.55 µg/cm2 voor de volgende passages. De voorgestelde LN-521 concentraties dienen als uitgangspunt voor succesvolle FF cultuur maar kunnen worden verlaagd.
      1. Ontdooi LN-521 flacon langzaam bij 4 ° C volgens de instructies van de fabrikant.
        Opmerking: Op de juiste wijze behandeld LN-521 oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal 3 maanden na het ontdooien.
      2. Ter voorbereiding van de oplossing van de coating, Verdun juiste hoeveelheid LN-521 stockoplossing met 1 x Dulbecco Phosphate-Buffered zout (DPBS) met Ca2 + en Mg2 + tot een totaal volume van 300 µL per putje.
      3. Pipetteer de oplossing van de coating aan de putjes, verzegelen de goed plaat met parafilm, en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Gecoate platen kunnen tot 2 weken bij 4 ° C worden bewaard.
        (Optioneel): als alternatief voor een snelle coating protocol, incubeer goed platen met coating oplossing gedurende 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
    2. Bereiden hPSC kweekmedium (specifiek essentiële 8 Flex) door aanvulling van basaal medium met meegeleverde aanvulling, volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 50 U/mL penicilline-streptomycine. Merk op dat de formulering gevoelig voor licht en hoge temperaturen is. Het supplement ontdooien en opwarmen van de media bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen licht. Gebruik het aangevuld hPSC medium binnen twee weken na de datum van de suppletie.
  2. Overdracht van de hPSC naar FF cultuur op LN-521
    1. Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
    2. Passage hPSCs van standaard cultuur systeem op feeder lagen (bijvoorbeeld geïnactiveerd menselijke voorhuid (hFF) of muis embryonale fibroblasten), of andere FF cultuur systemen met behulp van standaard methodologie. HPSC kolonies gekweekt op hFF feeder cellen kunnen bijvoorbeeld worden ontleed om kleine stukjes met een scalpel en de stukken dan los met een naald tip. Menselijke PSC's gekweekt met behulp van FF cultuur systemen kunnen worden overgedragen met behulp van de cluster passaging methode met of zonder voorafgaande enzym behandeling.
    3. Verwijder de LN-521 coating oplossing uit de 24-putjes en voeg 1 mL voorverwarmde hPSC medium per putje.
      Opmerking: De putten te droog als LN-521 zal inactivering bij drogen niet toegestaan.
    4. De kolonie stukken/cel clusters overbrengen in LN-521 gecoat 24-putten in hPSC medium met een pipet. Overdracht 20 – 30 kolonie stukken per putje, het vermijden van overbevolking van de putten.
    5. Het medium vervangen met 1 mL van hPSC medium, wordt de dag na de overdracht en elke andere dag daarna. De culturen zijn klaar voor passaging 3-4 dagen later als hPSCs uitgegroeid uit tot kolonies met een gladde, ongedifferentieerde morfologie. Ter referentie, Zie figuur 1B (eerste afbeelding). Voor de eerste passage van de FF, de koloniën niet mag groeien tot een volledig confluente enkelgelaagde, maar de culturen moeten worden gepasseerd wanneer kolonies een geschatte grootte van 1 mm bereiken.
  3. Passaging en onderhoud van FF hPSC cultuur
    1. Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
    2. Passage van de tweede FF passage vanaf het FF hPSCs wanneer de cultuur confluentie 80-100% heeft bereikt. Passage FF hPSCs naar nieuwe LN-521 gecoat 24-Wells-platen met eencellige passaging twee keer per week (op maandag en donderdag) om hoge kwaliteit culturen met ongedifferentieerde morfologie en om weekend-vrije voeding regime. Voor meer informatie, gelieve te verwijzen naar18,24,25.
      1. Spoel de FF hPSCs tweemaal met 1 mL van de 1 x DPBS zonder Ca2 + en Mg2 +.
      2. Loskoppelen FF hPSCs met xeno-vrije trypsine-EDTA (specifiek TrypLE Selecteer enzym) door drachtige 500 µL per putje bij 37 ° C, 5% CO2. Voor optimale incubatietijd, kunt u de cellen te ronden maar niet om los te maken. Dit duurt meestal 3 min bij 37 ° C, 5% CO2 (niet hoger dan 5 min).
      3. Verwijderen van xeno-vrije trypsine-EDTA en onmiddellijk vergroten met 500 µL per putje van gedefinieerde trypsine-remmer.
      4. Loskoppelen FF hPSCs door voorzichtig, maar grondig pipetteren om te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. Spoel de FF hPSC suspensie door een zeef van 40 µm cel in een 15 mL conische centrifugebuis met voorverwarmde hPSC medium.
      5. Was de putjes met 1 mL van hPSC medium en wassen medium aan de conische centrifuge tube van 15 mL toevoegen.
      6. De eencellige schorsing gedurende 5 minuten bij 300 x g centrifugeren, gecombineerd de cel pellet en resuspendeer in 1 mL voorverwarmde hPSC medium.
      7. De cellen met de hemocytometer of teller van geautomatiseerde cel tellen.
      8. Verwijder de LN-521 coating oplossing (0.55 µg/cm2) uit de 24-putjes en voeg hPSC medium zoals 1.2.3.
      9. Plaat FF hPSCs op 0.55 µg/cm2 LN-521 gecoat 24-putten op een celdichtheid van 40.000-50.000 cellen/cm2.
      10. Medium vervangen door verse hPSC medium de dag na de passaging, en elke andere dag daarna met uitzondering van zondag.
    3. De cellen zijn klaar om te worden gebruikt voor differentiatie 3-4 dagen na passaging, wanneer de cultuur heeft bereikt > 85% confluentie. Om te zorgen voor de hoge kwaliteit van de hPSCs, verwijzen naar karakteriseringsmethoden in detail beschreven in eerdere werken18,24,25. Het is aanbevolen om alleen cultuur hPSCs tot celkarakteristieken 15 in het systeem van de FF met eencellige passaging om te voorkomen dat karyotypic veranderingen. Gebruik alleen hoge kwaliteit, ongedifferentieerde hPSCs als grondstof voor differentiaties.

2. gestuurde differentiatie en cryopreservatie van hPSC afkomstige LESCs

  1. Voorbereidingen
    1. Xeno-vrij basale inductie medium (basale inductie medium) bereiden: Supplement Dulbecco van Eagle's medium (specifiek KnockOut DMEM) bewerkt met 15% serum xeno-vrije vervanging (spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-glutamine, 0.1 mM 2 - mercaptoethanol, 1% niet-essentiële aminozuren en 50 U/mL penicilline-streptomycine. Gebruik de basale inductie medium binnen twee weken.
    2. Media voorbereiden hoornvlies inductie in de cultuur van de schorsing.
      1. Dag 1: Aanvulling basale inductie medium met 5 μM blebbistatin.
      2. Dag 2: Aanvulling basale inductie medium met 10 µM SB-505124 en 50 ng/mL menselijke fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF).
      3. Dag 3-4: Supplement basale inductie medium met 25 ng/mL bot morfogenetische eiwit 4 (BMP-4).
    3. Hoornvlies epitheel differentiatie medium (differentiatie medium, specifiek CnT-30) voorbereiden aanhangend cultuur: supplementen aan basale medium volgens de instructies van de fabrikant toevoegt 50 U/mL penicilline-streptomycine en.
      Opmerking: Differentiatie middellange formulering is gevoelig voor licht. Gebruik het medium aangevuld differentiatie binnen 6 weken na de datum van de suppletie.
    4. Jas van 100 mm weefselkweek gerechten voor aanhangend differentiatie (zie stap 2.3) met een mengsel van 5 µg/cm2 menselijke placenta collageen type IV (col IV) en 0,5 µg/cm2 LN-521 verdund in 1 x DPBS met Ca2 + en Mg2 +, in een totaal coating van 5 mL per schotel. Bereiden en bewaar de coatings met col IV en LN-521 zoals beschreven in 1.1.1.3.
  2. Stap I: hoornvlies inductie in schorsing cultuur
    1. Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
    2. Loskoppelen FF hPSCs eencellige schorsing met xeno-vrije trypsine-EDTA volgens de instructies in de stappen 1.3.2.1–1.3.2.6. Cellen tellen en distribueren van 2-3 x 106 cellen per laag bijlage 6-well plaat goed, in het totaal volume van 3 mL van basale inductie medium aangevuld met 5 μM blebbistatin ertoe EB vorming overnachting bij 37 ° C, 5% CO2 (dag 1).
    3. Verwijder het medium op de volgende dag (dag 2), en vervangen door 3 mL van basale inductie medium aangevuld met 10 µM SB-505124 en 50 ng/mL bFGF.
    4. Op de volgende twee dagen (3-4 dagen), verwijder het medium en vervang door 3 mL van basale inductie medium aangevuld met 25 ng/mL BMP-4.
  3. Stap II: Hoornvlies differentiatie in aanhangend cultuur
    1. Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
    2. Op dag 5, plaat de EBs neer op 100 mm weefselkweek gerechten bekleed met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521.
      1. Verwijder de coating oplossing uit 100 mm weefselkweek gerechten en voeg 10 mL van voorverwarmde differentiatie medium per schotel.
        Opmerking: De gerechten te droog als LN-521 zal inactivering bij drogen niet toegestaan.
      2. Overdracht van het EBs van één 6-well plaat goed naar twee tot drie 100 mm weefselkweek gerechten (ongeveer 50 EBs per cm2) door pipetteren. De EBs gelijkmatig verdelen door zacht te schudden.
    3. De cellen in aanhangend cultuur bij 37 ° C, 5% CO2, ter vervanging van het medium met 10 mL verse differentiatie voedingsbodem driemaal per week (op maandag, woensdag en vrijdag) voor de komende 2,5-3 weken te handhaven. Controleer de cellen regelmatig voor het ontstaan van juiste epitheliale morfologie met behulp van de fasecontrastmicroscoop.
  4. Stap III: Cryo-banking hPSC afkomstige LESCs
    1. Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT in de laminaire flow motorkap, met uitzondering van de cryopreservatie medium dat vooraf moet worden gekoeld.
    2. Ontkoppel hPSC afkomstige LESCs met xeno-vrije trypsine-EDTA en tellen van de cellen, zoals geïnstrueerdg voor FF hPSCs in stappen 1.3.2.1–1.3.2.6, maar met behulp van differentiatie medium.
      Opmerking: Voor hPSC afkomstige LESCs, optimale incubatietijd met xeno-vrije trypsine-EDTA is langer (ongeveer 5 min). Gebruik 3 mL trypsine-EDTA xeno-vrije en gedefinieerde trypsine remmer per schotel van 100 mm.
    3. Na het tellen van de cellen, herhaal centrifugeren gedurende 5 min. 300 x g gecombineerd medium en resuspendeer de pellet cel in vooraf gekoeld, xeno-vrije hPSC cryopreservatie medium. Pipetteer de single cell schorsing in cryotubes zodat elke cryotube bevat 0,5 tot 1 x 106 cellen in 1 mL cryopreservatie medium.
    4. Plaats de buizen in een bevriezing container en overdracht onmiddellijk (binnen 5 min) tot-80 ° C's nachts.
    5. De volgende dag, door de buizen te overbrengen in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
  5. Stap IV: Ontdooien de cryopreserved hPSC-LESCs
    1. Jas voorafgaand aan ontdooien, de gerechten/Wells-platen met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521.
    2. Vooraf warm alle benodigde materialen en reagentia aan RT de laminaire flow Hood.
    3. Verwijder de coating oplossing uit gerechten/putten en toevoegen van de juiste hoeveelheid voorverwarmde differentiatie medium.
      Opmerking: De gerechten te droog als LN-521 zal inactivering bij drogen niet toegestaan.
    4. Ontdooi de cellen snel bij RT en onmiddellijk de celsuspensie overbrengen in een 15 mL conische centrifugebuis met 5 mL van voorverwarmde differentiatie medium.
    5. Centrifugeer de celsuspensie voor 5 min 300 x g gecombineerd en resuspendeer de pellet in differentiatie middellange tot elk cryopreservatie medium verwijderen.
    6. Plaat van de cellen op gerechten/putten bekleed met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521, in differentiatie medium bij een dichtheid van 40.000-50.000 cellen/cm2. Het handhaven van de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, ter vervanging van de differentiatie gemiddeld drie keer per week.

3. fenotypering van hPSC afkomstige LESCs

  1. Kwalitatieve immunofluorescentie analyse
    1. Jas voor immunofluorescentie, 24 - of 12-well putjes van de plaat met 5 µg/cm2 col IV en 0,5 µg/cm2 LN-521 en plaat/dooi hPSC-LESCs in differentiatie medium bij een dichtheid van 40 000-50 000 cellen/cm2.
    2. Wanneer de culturen hebt bereikt confluentie, herstellen de cellen met de 4% paraformaldehyde (PFA): de putjes tweemaal met 1 x DPBS zonder Ca2 + en Mg2 +wassen en incubeer 15-20 min met 4% PFA op RT. Daarna wassen tweemaal met 1 x DPBS te verwijderen elke PFA-residuen. Gebruik 0,5-1 mL van de oplossingen per putje.
      Opmerking: Vaste cellen kunnen worden opgeslagen in 1 x DPBS bij 4 ° C gedurende maximaal één week vóór de kleuring.
      Let op: PFA is giftig en corrosief. PFA verwerken in een zuurkast en Draag beschermende kleding, handschoenen en oogbescherming.
    3. Gecombineerd 1 x DPBS en permeabilize van celmembranen door Triton X-100 in 1 x DPBS voor 10-15 min met 0,1% het broeden.
    4. 0,1% Triton X-100 en blok niet-specifieke antilichaam bandplaatsen gecombineerd door broeden voor 1 h met 3% bovien serumalbumine (BSA) in 1 x DPBS op RT. voorbereiden primair antilichaam verdunningen in 0,5% BSA in 1 x DPBS.
      Opmerking: Zie tabel 1 voor aanbevolen primaire antilichamen.
    5. 3% BSA gecombineerd en incubeer met adequaat verdunde primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
    6. Was de putjes goed 3 x voor 5 min met 1 x DPBS. Maak secundair antilichaam verdunningen in 0,5% BSA in 1 x DPBS.
      Opmerking: Zie tabel 1 voor aanbevolen secundaire antilichamen.
    7. 1 x DPBS gecombineerd en incubeer met passende, op de juiste manier verdunde secundair antilichaam voor 1 h op RT, beschermd tegen licht.
      Opmerking: Vanaf deze stap op, houd de monsters beschermd tegen licht om te voorkomen dat vervagen van de fluorescente kleurstoffen.
    8. Was de putjes goed 3 x voor 5 min met 1 x DPBS en tenslotte counterstain kernen met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en zware montering met fluorescentie montage media. DAPI kan afzonderlijk gebruikt volgens de aanwijzingen van de fabrikant of opgenomen in het medium van de montage. Plaats Ronde coverslips (diameter 19 mm en 13 mm voor 12 - en 24-well platen, respectievelijk) in elk putje. Volg de instructies van de fabrikant met betrekking tot het drogen en opslag van de gemonteerde monsters.
    9. Het imago van de gekleurde cellen met een fluorescente microscoop.
  2. Kwantitatieve immunofluorescentie analyse
    1. Cytospin monsters van hPSC afkomstige LESCs op object bril voor te bereiden.
      1. Ontkoppel hPSC afkomstige LESCs met xeno-vrije trypsine-EDTA en tellen van de cellen, volgens de instructies in stap 2.4.2.
      2. Na het tellen, vooraf gekoeld 1 x DPBS en centrifuge voor 5 min op 300 x g. aanpassen het monstervolume en cel-concentratie overeenkomstig de instructies van de fabrikant van de gegeven cytocentrifuge, bijvoorbeeld 50.000-100.000 cellen toevoegen in een monstervolume van 150 µL.
      3. Spin cellen tot object bril met een cytocentrifuge bijvoorbeeld 5 min op 28 x g en moeilijke situatie onmiddellijk voor 15-20 min met 4% PFA in 1 x DPBS op RT. Raadpleeg de handleiding van de gegeven cytocentrifuge voor de aanbevolen spinnen tijd en snelheid.
    2. Ga verder met de kleuring van de cytospin monsters, zoals beschreven in stappen 3.1.3–3.1.8 gebruik vloeibare blocker pen omringen de monsters met een hydrofobe cirkel te voeren de kleuring in een druppel voor de economische praktijk. Wast kunnen worden uitgevoerd in containers met de houders van de dia, met het oog op een efficiënt afvoeren van overtollig antilichamen en minimale achtergrondkleuring. Counterstain kernen met DAPI en monteer de gebeitst monsters met fluorescentie montage media, die betrekking hebben op met coverslips. Volg de instructies van de fabrikant van over drogen en opslag van de gemonteerde monsters.
    3. 5 – 10 opnamen per monster van willekeurig geselecteerde locaties met bijvoorbeeld 10 X vergroting van een fluorescentie Microscoop.
    4. Schat het percentage positief gekleurde cellen ten opzichte van de totale (DAPI positief) cellen, bijvoorbeeld met ImageJ Image Processing and Analysis softwaretools (https://imagej.nih.gov/ij/). Bij voorkeur analyseren > 500 cellen per monster.
      1. Open de afbeelding om te worden geanalyseerd in ImageJ software. Het dupliceren van het beeld en het filter met de Gaussian blur standaard verwijderen van ruis.
      2. Maak een drempel. Aanpassen van de drempelwaarden aan optimale selectie van positief gebeitst celkernen, en toe te passen. De gedupliceerde afbeelding wordt nu omgezet naar een binaire weergave.
      3. Proces de binaire image met binaire processing tools "Vul gaten" en "Stroomgebied" zal automatisch afzonderlijke samengevoegde gebieden vertegenwoordigen van enkele kernen.
      4. De "Analyze deeltjes" hulpprogramma gebruiken om automatisch lijst regio's van belangen (ROIs) naar de ROI manager venster, die wordt geopend bij het toepassen van de opdracht. Sluit de binaire beeldoverdracht.
      5. Visualiseer de ROI van de oorspronkelijke afbeelding door te kiezen voor "Toon alle" in de Manager van de ROI. Bevestigen van de juiste keuze van gebeitst celkernen en indien nodig handmatig verwijderen en toevoegen van afzonderlijke selecties.
  3. Stroom cytometry analyse
    1. Om te bevestigen de p63α expressie niveaus, vlek de cellen voor stroom cytometry.
      1. Ontkoppel hPSC afkomstige LESCs met xeno-vrije trypsine-EDTA en tellen van de cellen, volgens de instructies in stap 2.4.2.
      2. Wash de cellen tweemaal met 1 mL pre gekoeld 1 x DPBS en Centrifugeer gedurende 5 min op 300 x g. Fix en permeabilize met kant-en-klare fixatie/permeabilization oplossing voor 20 min bij 4 ° C. Daarna wassen de cellen tweemaal met 1 mL pre gekoeld 1 x wassen buffer permeabilizing.
        Opmerking: Vanaf deze stap op, houd de cellen bij 4 ° C of op ijs, tenzij anders aangegeven.
      3. Let op: Fixatie/permeabilization oplossing bevat 4,2% formaldehyde. Omgaan met de gevaarlijke oplossing in een zuurkast en Draag beschermende kleding, handschoenen en oogbescherming.
      4. Verdeel monsters in polypropyleen buizen van 5 mL. Elk monster moet bevatten 100.000-200.000 cellen en het monstervolume moet worden aangepast aan ongeveer 100 µL van het 1 x wassen buffer.
      5. Voeg 2 µL van fluorescerende geconjugeerd p63-α FACS antilichaam (Zie voor aanbevolen antilichaam, tabel van apparatuur en materiaal) in het monster buizen. Laat één monster onbevlekt om te dienen als negatieve controle. Vortex de monsters en incubeer gedurende 1 h op RT, beschermd tegen licht.
      6. Spoel de cellen tweemaal met 1 mL pre gekoeld 1 x wassen buffer en ten slotte resuspendeer de pellets met 300 µL van buffer. Bewaar de buizen op ijs, beschermd tegen licht.
    2. Analyseer de monsters met een stroom-cytometer. Het gebruik van het voorbeeld onbevlekt negatieve controle voor de juiste celpopulatie gating, en voor het uitsluiten van het fluorescerende achtergrond signaal. Analyseren van minimaal 10.000 p63-α-cellen gekleurd. Raadpleeg de gebruikershandleiding van de gegeven stroom cytometer voor gedetailleerde technische uitvoering.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van hPSCs naar hPSC-LESCs

Het hele proces van het inducerende differentiatie van FF hPSCs te cryostoring hPSC-LESCs duurt ongeveer 3,5 weken. Schematisch overzicht van de methode van de differentiatie markeren zijn belangrijke stappen is in figuur 1Agepresenteerd. Figuur 1B toont de typische morphologies van de cel populaties in verschillende fasen van het protocol. De geg...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verwachte resultaat van dit protocol is de generatie van het succesvolle en robuuste van LESCs uit een enkele celsuspensie van FF hPSC binnen ongeveer 3,5 weken. Zoals hoornvlies epitheel oppervlakte ectoderm €29 ontwikkelt, wordt de eerste stap van het protocol bedoeld om sturing van hPSCs naar deze bloedlijn. Een korte 24u inductie met transformeren groeifactor bèta (TGF-β) antagonist SB-505124, en bFGF worden gebruikt voor het opwekken van ectodermale differentiatie, gevolgd door 48 h mesod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd ondersteund door de Academie van Finland (subsidie nummer 297886), het programma van de menselijke reserveonderdelen van Tekes, het Fins financiering agentschap voor technologie en innovatie, het Finse oog en weefsel Bank Foundation en de Finse Cultural Foundation. De auteurs bedanken het biomedische laboratorium technici Outi Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt en Outi Heikkilä voor uitstekende technische bijstand en de bijdrage aan de celcultuur. Professor Katriina Aalto-Setälä is erkend voor het verstrekken van de gebruikte hiPSC-lijn en de BioMediTech Imaging Core faciliteit voor het verstrekken van uitrusting voor fluorescentie imaging.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiaal/Reagens
1x DPBS met Ca2+ en Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS zonder Ca2+ en Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm celcultuurschaalCorning CellBIND#3296Cultuurvat formaat voor adherente hPSC-LESC differentiatie
12-well plateCorning CellBIND#3336Cultuurvat formaat voor IF-monsters
24-well plateCorning CellBIND#3337Cultuurvat formaat voor IF-monsters
2-mercaptoethanolGibco#31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachmentCorning Costar#3471Cultuurvat formaat voor inductie in suspensiecultuur
Alexa Fluor 488 anti-muis IgThermoFisher Scientific#A-21202Secundaire antilichaam voor IF
Alexa Fluor 488 anti-konijn IgThermoFisher Scientific#A-21206Secundaire antilichaam voor IF
Alexa Fluor 568 anti-geit IgThermoFisher Scientific#A-11057Secundaire antilichaam voor IF
Alexa Fluor 568 anti-muis IgThermoFisher Scientific#A-10037Secundaire antilichaam voor IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, humaan)PeproTech Inc.#AF-100-18BDiervrijg Recombinant Humaan FGF-basis (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixatie/Permeabilisatie OplossingBD Biosciences#554722Fixatie en permeabilisatie oplossing voor flowcytometrie
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Wasbuffer voor flowcytometrie
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Bote morphogenetisch proteïne 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Bovine serum albumine (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Cytokeratine 12 antilichaamSanta Cruz Biotechnology#SC-17099Primair antilichaam voor IF
Cytokeratine 14 antilichaamR&D Systems#MAB3164Primair antilichaam voor IF
Cytokeratine 15 antilichaamThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrimair antilichaam voor IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Cultuurmedium voor adherente hPSC-LESC differentiatie
Collageen type IV (humaan)Sigma-Aldrich#C5533Humaan placenta collageen type IV
CoolCell LX BevriezingscontainerSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure buizenSarsted#72.3801.6 mL cryobuis voor hPSC-LESC cryopreservatie
Defined Trypsine InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminine 521Biolamina#Ln521Humaan recombinant laminine 521
ΔNp63α antilichaamBioCare Medical#4892Primair antilichaam voor IF
OCT3/4 antilichaamR&D Systems#AF1759Primair antilichaam voor IF
p63α antilichaamCell Signaling Technology#ACI3066APrimair antilichaam voor IF
p63-α (D2K8X) XP Konijn mAb (PE Conjugaat)Cell Signaling Technology#56687p63-α PE-geconjugeerd antilichaam voor flowcytometrie
PAX6 antilichaamSigma-Aldrich#HPA030775Primair antilichaam voor IF
Penicilline/StreptomycineLonza#17-602E
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich#158127Celfixatief voor IF
ProLong Gold Antifade Mountant met DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI mountant voor harde montage voor IF
PSC Cryopreservatie KitThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco's gemodificeerd Eagle's mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM niet-essentiële aminozurenGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Permeabilisatiemiddel voor IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI mountant voor vloeibare montage voor IF
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Cytocentrifuge, bijv. CellSpin IITharmac
Flowcytometer, bijv. BD Accuri C6BD Biosciences
Fluorescentiemicroscoop, bijv. Olympus IX 51Olympus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles