Methodenartikel

Kracht-Clamp reometrie voor het karakteriseren van de Hydrogels op basis van eiwitten

DOI:

10.3791/58280

⸱

21 augustus 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Wisconsin-Milwaukee

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek wordt gebruikt voor het onderzoeken van de mechanische eigenschappen van laag-volume op basis van eiwitten hydrogel monsters aangebonden tussen een spreekspoel motor en een kracht sensor. Een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem zorgt voor het 'klemmen' van de kracht ervaren om het gewenste protocol.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een kracht-clamp reometrie methode karakteriseren de biomechanische eigenschappen van hydrogels op basis van eiwitten. Deze methode maakt gebruik van een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem toe te passen gecontroleerde-force protocollen op cilindrische op basis van eiwitten hydrogel monsters, die tussen een lineaire spreekspoel-motor en een transducer kracht worden aangebonden. Tijdens het uitvoeren van past de PID-systeem de extensie van het monster hydrogel te volgen van een vooraf gedefinieerde kracht-protocol door het minimaliseren van het verschil tussen de gemeten en instelpunt krachten. Deze unieke benadering op basis van eiwitten hydrogels kunt het binden van extreem laag-volume hydrogel monsters (< 5 µL) met verschillende eiwit concentratie. Onder force-oprit protocollen, waar de toegepaste stress verhoogt en verlaagt lineair met de tijd, het systeem maakt de studie van de elasticiteit en hysteresis gedragingen die zijn gekoppeld aan de (un) vouwing van eiwitten en het meten van standaard elastische en Visco parameters. Onder constante-force, waar de kracht pulse een stap-achtige vorm, de elastische reactie, behoren tot de verandering in werking is getreden heeft, is ontkoppeld van de visco-reactie, die afkomstig is van eiwit domein ontvouwen en uiteinde. Vanwege de geringe hoeveelheden monster en veelzijdigheid bij de toepassing van verschillende mechanische verstoringen, is kracht-clamp reometrie geoptimaliseerd voor het onderzoeken van de mechanische reactie van eiwitten onder kracht met behulp van een bulk-aanpak.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afgezien van een unieke fysieke eigenschappen, houdt op basis van eiwitten hydrogels de belofte van een revolutie in kracht spectroscopie doordat de meting van verschillende miljard moleculen in een 'trekken', waardoor de studie van eiwitten in drukke omgevingen, vergelijkbaar zijn met die gevonden in de huid en andere weefsels. Eiwit domeinen blijven gevouwen binnen hydrogels, waardoor de studie van hun biomechanische reactie te dwingen, bindende partners, en chemische voorwaarden. Bovendien lijkt de biomechanische reactie van eiwit domeinen binnen hydrogels op het antwoord gezien met single-molecuul kracht spectroscopie technieken. Bijvoorbeeld chemische denatureringsmiddelen en oxiderende agenten het verkleinen van de stabiliteit van de gevouwen staat, zowel op de interne eiwit domein niveau1,2,3 de macroscopische niveau4,5 , 6 , 7. ook osmolytes verhogen de stabiliteit van enkele eiwitten8,9, wat leidt tot een afname van de visco-reactie van de hydrogels, voor hetzelfde force voorwaarden7,10.

Verschillende benaderingen zijn gelegd om te synthetiseren op basis van eiwitten hydrogels, hetzij door met behulp van de fysieke interacties11,12 of covalente cross-linking4,13. Covalente Reacties toestaan voor vaste cross-linking locaties en deze hydrogels kan het herstellen van de oorspronkelijke toestand na een verwijdering van de mechanische of chemische verstoringen. Een succesvolle aanpak voor covalente dwarsbinding, is afhankelijk van de vorming van covalente koolstof-koolstof bindingen tussen blootgestelde tyrosine aminozuren met ammonium persulfate (APS) als de oxidator en een ruthenium (II)-zout als een initiatiefnemer (Figuur 1)14. Bij blootstelling aan wit licht, kan een oplossing van geconcentreerde eiwitten worden omgezet in een hydrogel. Door het beheersen van wanneer de reactie begint, de eiwit-APS-mix kunnen worden geïnjecteerd in elke vorm van gieten, waardoor zoals polytetrafluorethyleen (PFTE) buizen (figuur 1B en 1 C), het gebruik van een uiterst kleine oplossing volume15. Bovendien, het gebruik van wit licht om te activeren van de cross-linking reactie resulteert in een beperkte bleken van fluorescente proteïnen en staat de formulering van samengestelde hydrogels met een fluorescente markeringen (Figuur 1). Andere methoden van de vorming op basis van eiwitten hydrogel gebruiken dwarsbinding op basis van de SpyTag-SpyCatcher covalente interactie16, amine cross-linking via Glutaaraldehyde13of17interacties biotine-daar.

Dynamische mechanische analyse (DMA) is momenteel een techniek die op grote schaal gebruikt om te studeren polymeer gebaseerde hydrogels13,18. Terwijl DMA biomaterialen constante kracht protocollen toepassen kunt, vereist het Youngs moduli over 10 kPa en grote steekproef volumes van meer dan 200 µL19. Vanwege deze beperkingen zijn eiwit hydrogels over het algemeen te zacht om door deze techniek worden onderzocht. Zoals gemanipuleerde polyproteins moeilijker zijn te synthetiseren dan polymeren, aangezien zij een levend systeem vereisen te produceren, zijn dergelijke hoge volumes inefficiënt, bij de beste4,15. Bovendien zijn de meeste biologische weefsels zachter dan 10 kPa. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld voor biologische monsters, vooral in de studie van20,21van de elasticiteit van de spieren. Deze technieken kunnen ook opereren onder feedback aan constante kracht maar zijn geoptimaliseerd voor monsters met kleine diameters (in de range van micron) blootgesteld om af te dwingen voor zeer korte tijd (meestal minder dan 1 s).

Op basis van eiwitten hydrogels werden met succes bestudeerd met gemodificeerde reometrie technieken. Bijvoorbeeld, maakt de hydrogel gieten in een ring vorm het gebruik van extensionele reometrie voor het meten van de verandering in de ervaren kracht als een functie van uitbreiding4,22. Andere benaderingen voor het bestuderen van de reologische eigenschappen van eiwitten gebaseerde hydrogels gecontroleerde schuifspanning reometrie gebruiken Deze technieken kunnen ook laag monstervolume bereiken en tolereren van zachte materialen. Echter, deze methoden ontbreken de mogelijkheid om na te bootsen de trekken krachten die oorzaak eiwit ontvouwen in vivoen Youngs modulus wordt berekend op basis van complexe theorieën waarvoor verschillende veronderstellingen en correcties23.

We hebben onlangs gemeld dat een nieuwe aanpak die gebruikmaakt van een kleine hoeveelheid eiwitten, polymeervorm binnen de buizen met een diameter < 1 mm. Onze eerste implementatie van deze techniek was in de lengte-clamp modus, waarin de gel werd uitgebreid naar aanleiding van de gewenste protocol15actief. Bij deze methode wordt ervaring de eiwitten een voortdurende veranderingen in zowel de uitbreiding als de kracht terwijl de domeinen ontvouwen, waardoor de data interpretatie omslachtig. Onlangs hebben we een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek, waar een feedback-lus laag-volume eiwit hydrogels naar een vooraf gedefinieerde geldende protocol7 (Figuur 2 blootstellen kan) gemeld. Een analoog PID systeem vergelijkt de kracht gemeten door de kracht sensor met de punt van de reeks verzonden vanaf de computer en past de gel-extensie door het bewegen van de spreekspoel om te minimaliseren van het verschil tussen de twee ingangen. Deze 'klemmen' van de kracht staat nu voor nieuwe soorten experimenten voor het meten van de biomechanica van eiwit hydrogels.

In de modus kracht-oprit ervaringen een getuide eiwit hydrogel een constante stijging en daling van kracht met de tijd. De PID compenseert voor eventuele visco vervorming door de extensie te wijzigen in een niet-lineaire manier, afhankelijk van het soort eiwit en hydrogel formulering. Het belangrijkste voordeel van kracht helling is dat het mogelijk maakt de kwantificering van standaardparameters, zoals Youngs modulus en energie dissipatie, als gevolg van een ontvouwen en uiteinde van eiwit domeinen.

In constante-force-modus, de toegepaste kracht verandert in een stap-achtige manier. In deze modus, de gel uitbreidt en contracten elastisch wanneer de kracht is verhoogd of verlaagd, respectievelijk, gevolgd door een tijd-afhankelijke vervorming. Deze visco vervorming, plaatsvindt terwijl de gel een constante kracht ervaringen, is direct gerelateerd aan het domein ontvouwen/uiteinde. Op een vereenvoudigde manier, kan deze uitbreiding worden gezien als het equivalent van verschillende miljard enkel molecuul sporen samen gemiddeld en allemaal tegelijk gemeten. Constante-force protocollen kunnen worden gebruikt om de kruip en ontspanning van eiwit hydrogels als een functie van kracht en tijd te studeren. Als een functie van kracht, voor BSA gebaseerde eiwit hydrogels, hebben we onlangs aangetoond dat er een lineaire afhankelijkheid tussen de elastiek en visco uitbreiding en de terugslag met de toegepaste spanning7.

Hier detail wij de werking van een kracht-clamp-rheometer met behulp van samengestelde gels gemaakt van een mengsel van eiwit L (8 domeinen24, afgebeeld als L8) en een eiwit L-eGFP construct (L-eGFP), waardoor de algehele hydrogel TL en gebruiksvriendelijke aantonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. reagentia oplossing voorbereiding

  1. Bereid een startende eiwit-oplossing door ontbinding/verdunnen van de proteïne van belang zijn voor de gewenste concentratie, met behulp van een Tris-buffer [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane en 150 mM NaCl, pH 7.4].
    Opmerking: De kleinste eiwitconcentratie voor die cross-linking leidt tot hydrogels hangt af van het eiwit gebruikt en is meestal > 1 mM.
  2. Bereiden van voorraden van ammoniumnitraat persulfate (APS) (1 M) en tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride ([Ru(bpy)3]2 +) (6.67 mM) oplossingen door het oplossen van APS en [Ru(bpy)3]2 + poeders in de Tris-buffer.

2. op basis van eiwitten Hydrogel synthese

  1. Fix een 23 G naald op een injectiespuit 1 mL met een ingedrukte zuiger.
  2. Snijd een 10 cm polytetrafluorethyleen (PTFE) buis (met een binnendiameter van 0,022 in en een buitendiameter van 0.044 in) met behulp van een scheermesje. De naald en spuit koppelen aan één uiteinde van de PTFE-buis.
  3. Sluit het tweede uiteinde van de buis op een silane-oplossing en vul de buis door het intrekken van de zuiger van de spuit. Laat de buis voor ~ 30 min.
  4. Verwijder de silane-oplossing en drogen van de buis met perslucht.
    Nota: Zorg ervoor dat alle van de silane oplossing wordt gedroogd en dat geen residuen in de buis achterblijven.
  5. Meng de eiwit-oplossing met APS en [Ru (bpy) 3]2 + in een tube van 1,5 mL met behulp van een constante volumeverhouding [bijv15:1:1 of 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
  6. Vortex de photoactive oplossing tot het volledig is gemengd.
  7. Centrifugeer de mix op maximale snelheid (bv, 14.000 x g) alle bubbels verwijderen uit de oplossing.
  8. Het open uiteinde van de behandelde PTFE-buis in het photoactive mengsel invoegen en tekenen van de oplossing in de buis door het intrekken van de zuiger van de spuit.
  9. Plaats het geladen buis ~ 10 cm afstand van een 100 W kwik lamp te voorkomen het verwarming en houden het er voor maximaal 30 minuten bij kamertemperatuur (figuur 1B).
    Opmerking: In sommige gevallen, de blootstellingstijd aan het licht kunnen zijn zo laag als 30 s. kortere gelering keer hier voor fluorescerende gels, gebruikt worden photobleaching beperken.
  10. Verwijder van de buis van de naald en snijd de randen van de buis in de buurt van de hydrogel eindigt met een scheermesje.
  11. Gebruik een afgestompte 24 G naald om de hydrogel diepte in de oplossing van Tris (Figuur 1 c).
    Opmerking: Afgestompte naalden worden gebruikt om te vermijden elke inkepingen of schade aan het monster hydrogel.
  12. Inspecteer visueel of de gels voor eventuele gebreken die mogelijk vormen tijdens de extrusie of als gevolg van bubbels en negeren de gels met gebreken.

3. op basis van eiwitten Hydrogel gehechtheid en kracht-Clamp Rheometer Set-up

  1. Start het controleprogramma van het instrument. Zet de spreekspoel motor. Stel de positie van de spoel een waarde aan het einde van het bereik (bijvoorbeeld, 7,5 mm).
    Opmerking: De spreekspoel positie wordt aanbevolen te worden tegen het einde van het bereik maximale verkeer te maximaliseren van de mogelijke uitbreiding van de hydrogel.
  2. Verplaatsen van de haken in de z-richting en deze uitlijnt op de bocht in de x-richting (die de coördinaat is trekken; Zie figuur 2B). Opnemen van de waarden van de micrometer schroeven voor de x-richting.
  3. Snijd 2 steriele hechtingen in strengen van gelijke lengte (2-3 cm; Zie figuur 3A en B).
  4. Leg een losse dubbele bovenhands-knoopje in elk van de onderdelen en plaatst u de 2 lussen op de haak, verbonden met de sensor van de kracht (Figuur 3 c en 3D).
  5. Vul de experimentele kamer met Tris buffer en breng de hydrogel monster in de gevulde zaal met behulp van medische pincet.
  6. Plaats de spreekspoel en kracht sensor haken dicht bij het oppervlak van de oplossing en uitlijnen van de haken in alle richtingen met behulp van de x/y/z-positionering van de manipulatoren.
  7. Met behulp van medische pincet, hang beide zijden van de hydrogel eiwitSteekproef op de haken verbonden met de stem coil en kracht sensor (Figuur 3 c).
  8. Draai 1 hechtdraad lus rond het monster van de hydrogel op de voice coil haak door beide uiteinden van de hechtdraad lus met medische pincet en trekken ze gelijktijdig (figuur 3D).
  9. Herhaal stap 3.8 voor de lus verbonden met de kracht sensor (figuur 3D).
    Opmerking: Voorkomen een extreme verscherping van de hechtingen te voorkomen dat schade aan de constructie en transversale snijden van het monster hydrogel.
  10. Draai de hechtdraad lussen in de bochten van elke haak om te voorkomen dat eventuele ontsporing; Gebruik deze bochten als referentie punten om te vinden de nul scheiding tussen de haken in stap 3.2. Knip de overtollige lengtes van de hechtingen die met behulp van medische schaar (figuur 3D).
  11. Verplaatsen van de bijgevoegde hydrogel met z-manipulatoren langs de z-as naar de experimentele zaal om te dompelen de hydrogel in de experimentele oplossing.
  12. Hiermee lijnt u de hydrogel monster in y-z met behulp van de manipulatoren zodanig dat de gel niet onder enige stress.
  13. Nul de kracht sensor en scheiden van de twee haken met behulp van de x-micrometer stadia tot de gel begint te ervaren van de kracht. Zodra dit gebeurt, iets weer de micrometer schroef in de x-richting.
  14. Opnemen van de positie van beide manipulatoren voor de voice coil motor- en de sensor en het verschil tussen deze waarden en de gemeten in stap 3.2 gebruiken voor de berekening van de exacte scheiding tussen de aanbinden haken aan het begin van het experiment.
  15. Het bereik voor de toegestane curve ingesteld op ~1.5 - 2 mm en meten van de gel speling (figuur 4A).
    Opmerking: Voor elke toegestane meting, proberen te houden van het begin van het toegestane regime in de buurt van de eerste voice coil positie, waardoor een optimale aantal gegevenspunten aan de 2 regimes (figuur 4A). De lengte van de gel kan worden bepaald met een micron-resolutie met behulp van de scheiding tussen de haken en het snijpunt tussen de 2 regimes in de speling van de kromme (Zie ook stap 5.1). Als de kracht sensor zou kunnen drijven met de tijd als gevolg van de variaties in de proefomstandigheden, dwingen het deel van de toegestane curve waar de gel is niet onder verslagen over deze mogelijke drift. Het programma het instrument controleren compenseert automatisch voor dit verschil bij het verzenden van de opdracht set-punt naar de PID lus (figuur 4A inzet).

4. op basis van eiwitten Hydrogel karakterisering met behulp van gecontroleerde kracht-oprit en constante-Force metingen

  1. Kracht-oprit experimenten
    1. Input voor het uitvoeren van een cyclus van geweld-oprit doordat de kracht bij de gewenste densiteit (b.v., 0,01 mN/s), de eerste en laatste krachten en de duur van het protocol als een gespiegelde "V". Houd vervolgens, de gel bij 0 mN (of lage kracht) voor > 200 s om het eiwit domeinen te refold en de elasticiteit van de gel te herstellen.
    2. Sla de trace.
  2. Constante-force experimenten
    1. Uitvoeren van een constante-force-protocol door toepassing van een lage kracht (bijvoorbeeld, 0,1 mN) voor 30 s en vervolgens verhoging van de kracht op een constante kracht (bijvoorbeeld, 1 mN) over een bepaalde hoeveelheid tijd (bijvoorbeeld120 s), gevolgd door de kracht terug naar hetzelfde lage blussen waarde (bijvoorbeeld, 0,1 mN) voor > 300 s om het eiwit domeinen te refold en de elasticiteit van de gel te herstellen.
    2. Na de eerste puls, pas de PID instellingen te maximaliseren de reactietijd van de feedback lus (Zie figuur 2D).
      Opmerking: Voor stijve gels en voor kleine wijzigingen van kracht, de reactietijd van de lus wordt beperkt door de elektronica van de sensor van de kracht en de reactietijd van de spoel, en kan zo laag als 5 ms7. Voor zachtere gels en grote veranderingen in werking is getreden, wordt de reactietijd gedicteerd door de elasticiteit van de hydrogels (figuur 2D).
    3. Sla de trace.

5. de gegevensanalyse

  1. Met behulp van de gemeten scheiding tussen de haken en de positie van de berekende spoel, zodra de gel begint te ervaren van de kracht (Δx in het invoegen figuur 4A ), berekenen van de lengte van de gel L met behulp van de vergelijking:
    L = L0 + ∆x
    L0 is hier de scheiding tussen de haken, gemeten vanaf de positie van de schroeven micrometer voordat het experiment (stap 3.14).
    Opmerking: Voor gels met laag eiwitgehalte concentraties die niet leiden een volledige dwarsbinding tot, zal de gemeten lengte van spoor-naar-trace veranderen. Gedurende lange perioden van tijd, eiwitten binnen hydrogels kunnen ook ondervinden25van de effecten van veroudering, die resulteren in een totale verlenging van de gel.
  2. Normaliseren van de gemeten-extensie voor de lengte van de gel te verkrijgen van de stam.
  3. Normaliseren de gemeten kracht aan de transversale oppervlakte met behulp van de binnendiameter van de buis gebruikt voor de polymerisatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1A blijkt de regeling van de photoactive reactie die gebruikt voor het synthetiseren van de L-EGP/L8 hydrogel. Figuur 1B toont de hydrogel mengsel in de PTFE-buis vóór en na de photoactivation. Figuur 1 c presenteert de geëxtrudeerde L-eGFP-L8 hydrogel binnen een oplossing van Tris. De hydrogel monster heeft geen structurele gebreken zoals inkepingen. Hydrogels met duidel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin beschrijven we een kracht-clamp reometrie techniek om te onderzoeken van de biomechanische reactie van laag-volume op basis van eiwitten hydrogels. Bovendien, is een protocol bedoeld voor het synthetiseren van een uniforme cilindrische laag-volume hydrogel eiwitSteekproef. Een protocol wordt ook gepresenteerd waarin wordt beschreven hoe u verschillende soorten eiwit gebaseerde hydrogels met de elasticiteit van de diverse binden zonder mechanische vervorming en de eventuele schade aan op basis van eiwitten hydrogel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen de financiële steun uit onderzoek groei-initiatief (Award nr. 101 X 340), National Science Foundation, grote onderzoeksprogramma voor instrumentatie (Grant nr. PHY-1626450), grotere Milwaukee Stichting (Shaw Award) en de Universiteit van Wisconsin systeem (toegepast onderzoek Grant).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SI-KG4A krachttransducerWorld Precision Instruments (WPI)SI-KG4A
Lineaire stemkokermotorEquipement SolutionsLFA2010
Bovine serumalbumineRocky Mountain Biologicals (RMBIO)BSA-AAF-1XG / 100 G
TrizmaSigma-AldrichT1503-1KG
NatriumchlorideSigma-AldrichS7653-1KG
AmmoniumpersulfaatSigma-Aldrich248614-100G
Tris(bipyridine)ruthenium(II)chlorideSigma-Aldrich544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES 6-0 NYLON NAADT 12/PKFisher ScientificNC0395626
1mL-sering alleen, Luer-Lok-tipBD309628
Silane, SigmacoteSigma-AldrichSL2-25ML
Microbore PTFE-buis, 0,022"ID x 0,042"OD, 100 ft/rolCole-ParmerEW-06417-21
Hypodermische naald, 23 gaugeHealthcare Supply Pros305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT-dispensertips - 24 gaugeKIMCOJG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury LampALBUSH-103D USHIO
Medische pincet
Medische schaar
Olympus
De computercode en het CAD-ontwerp van de aangepaste onderdelen kunnen op verzoek beschikbaar worden gesteld aan de corresponderende auteur.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao, Y., Li, H. How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins? Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).
  2. Carrion-Vazquez, M., et al. Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).
  3. Wiita, A. P., et al. Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force. Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).
  4. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  5. Plumere, N., et al. A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage. Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).
  6. Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties. Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).
  7. Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry. Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).
  8. Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains. Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).
  9. Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy. Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).
  10. Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes. Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).
  11. Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).
  12. Sathaye, S., et al. Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface? Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).
  13. Ma, X., et al. A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling. Scientific Reports. 6, 19370(2016).
  14. Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).
  15. Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels. Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).
  16. Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).
  17. Thompson, M. S., et al. Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture. Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).
  18. Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load. Biomedical Materials. 12 (2), (2017).
  19. Desai, M. S., et al. Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels. Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).
  20. Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle. Nature Communications. 7, (2016).
  21. McDonald, K. S. Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres. Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).
  22. Wu, J. H., et al. Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties. Nature Communications. 9, (2018).
  23. Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear. Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).
  24. Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. Multidomain proteins under force. Nanotechnology. 28 (17), 174003(2017).
  25. Valle-Orero, J., et al. Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing. Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).
  26. Fang, J., et al. Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels. Nature Communications. 4, (2013).
  27. Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. Bioinks for 3D bioprinting: an overview. Biomaterial Science. , (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Force Clamp RheometryProtein Based HydrogelsPID Control SystemVoice Coil MotorForce TransducerForce Ramp ProtocolConstant Force ProtocolHydrogel Sample PreparationElasticity MeasurementViscoelastic Analysis

Gerelateerde artikelen