Methodenartikel

Het snijden en drijvende methode voor paraffine-ingebedde weefsel voor het segmenteren

DOI:

10.3791/58288

⸱

5 september 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Science, Nanchang University, 2Queen Mary School, Medical Department, Nanchang University, 3School of Life Science, Nanchang University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om paraffine segmenteren. Deze methode combineert snijden en zwevende met behulp van een eenvoudige thermostatische kamer om te voorkomen dat het proces van de overdracht vereist met de conventionele methode. Dientengevolge, waren de efficiëntie en het aantal intact paraffine secties sterk verbeterd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afdelen van het weefsel van paraffine-ingebedde wordt wijd gebruikt in de histologie en pathologie. Het is echter vervelend. Ter verbetering van deze methode, hebben verschillende commerciële bedrijven bedacht complexe sectie overdracht systemen met behulp van vloeibaar water. Om deze technologie te vereenvoudigen, wij gemaakt een eenvoudige methode om met behulp van zelfgemaakte apparatuur die combineert knippen en drijvende binnen een eenvoudige thermostatische kamer; Daarom voert de secties automatisch het waterbad op het wateroppervlak. De hippocampus van volwassen muis hersenen, volwassen muis nieren, hersenen van muis embryonale en volwassen zebrafish ogen werden gesneden met behulp van zowel conventionele paraffine segmenteren en de onderhavige methode voor vergelijking. Statistische analyse toont aan dat onze verbeterde methode tijd bespaarde en hogere kwaliteit secties geproduceerd. Daarnaast is het gemakkelijk voor junior exploitanten paraffine segmenteren voor een hele specimen in een korte tijd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfologische studie is belangrijk in het biologisch onderzoek. Hoewel de nieuwe technologie heeft toegestaan onderzoekers te observeren hun doelstellingen rechtstreeks vanuit het hele weefsel of organismen1,2,3, snijden het specimen in dunne secties, gevolgd door de kleuring, blijft de primaire methode fornot enige weefsel morfologie maar ook eiwit gericht op direct in het weefsel. De lichte microscopie van gebruikt drie typen secties: paraffine, bevroren, en semithin. Hoewel cryosectioning gemeenschappelijk is voor de bescherming van de antigenicity van het weefsel, en de voorbereiding van het monster simpel is, is de morfologie van de ingehouden weefsel slecht en ongeschikt voor dunne vectorafbeeldingsbestanden4,5. Paraffine segmenteren is de meest gebruikte methode voor het tentoonstellen van goed bewaarde morfologie. Zoals de specimens zijn helemaal uitgedroogd en ingebed in de wax, kunnen de paraffineblokken voor onbepaalde tijd worden opgeslagen. Daarnaast produceert paraffine afdelen dunne secties die toegankelijker maken van biologische sonde in verdere experimenten en cel laag overlay in de Z-richting te verminderen.

Conventionele paraffine segmenteren is echter vervelend en exploitant vaardigheid vereist. Paraffine secties ondergaan fixatie, uitdroging, insluiten, snijden en zweven. Bovenal is sectie linten overzetten van de meshouder naar het waterbad noodzakelijk maar moeilijk voor junior exploitanten. Vooral in droge lucht, de sectie linten zal draai als gevolg van statische elektriciteit en zijn moeilijk te ontvouwen op het warme water. Ter verbetering van de afdeling worden kwaliteit, bevochtigen van het oppervlak van de blootgestelde weefsel tussen microtoom blade passeert, koeling van de wax blokken door ze onder te dompelen in ijs water, of het verhogen van de luchtvochtigheid met een luchtbevochtiger in de buurt van de microtoom aanbevolen6,7 . Nieuwere methoden ter verbetering van paraffine afdelen zijn hybride paraffine insluiten, cryosectioning8en commerciële afdeling overdracht systeem bijstand9. Hoewel deze methoden gedeeltelijk paraffine verbeteren afdelen van snelheid en kwaliteit, ze maken afdelen veel omslachtiger, en commerciële sectie overdracht systemen zijn duur.

In dit protocol, we laten zien hoe maak je eenvoudig, goedkoop en flexibel apparatuur stap voor stap, die kan worden aangesloten op de meshouder van rotary microtome. Deze apparatuur bestaat uit een sectie kanaal, een bad met water en een kachel met een temperatuur detectieschakeloptie. Na het uitsnijden, tientallen secties stromen in de sectie kanaal en voer het waterbad rechtstreeks, dus automatisch ontvouwen. Dit verbetert de efficiency van paraffine afdelen en maakt deze technologie geschikter. Met behulp van deze methode, meer volwassen muis hippocampal secties, volwassen muis nier secties, embryonale 15,5 dagen oude (E15.5) muis hersenen secties en volwassen zebrafish oog secties werden geoogst in minder tijd en morfologisch meer intact gebleven. Deze methode kan ook worden gebruikt voor andere weefselsteekproeven waarvoor versnelde paraffine afdelen terwijl het vermijden van verlies van onderscheid van de sectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Nanchang Universiteit.

1. Monteer de apparatuur en sluit de microtoom

  1. Het ontwerp van de parameter per de eisen (aanvullende Figuur 1).
  2. De parameter naar een plaatselijke fabriek voor de vervaardiging van de acryl planken leggen.
  3. Monteren van alle onderdelen in volgorde: chloroform kunt combineren 7 commerciële acryl planken in een tank met een sectie kanaal en water bad (Figuur 1).
    Let op: Chloroform produceert giftige stoffen bijeenkomt licht en zuurstof. Monteer het toestel in een zuurkast.
  4. Installeer de tubulaire elektrische verwarmingselement door het gat in acryl bestuur #1 (figuur 2A, pijlpunt).
  5. Om de temperatuur controller installeren, maken een klein gaatje op de #2 acryl bord met behulp van een elektrische boor en installeren van de temperatuur-detector (figuur 2A, pijl). Installeer een digitale thermostaat op de tank (figuur 2A).
    Opmerking: De temperatuur-detector moet binnen 1 cm onder het wateroppervlak.
  6. Macht om toegang te verlenen, de kruisspanning onder 24 V voordat ik overga op de apparatuur.
  7. Verwijder de sectie afval lade uit de microtoom.
  8. Het koppelen van het kanaal van de secties met de microtoom Messenhouder met neutrale silicone sealant (figuur 2B).
    Opmerking: neutrale silicone sealant boven de bovenkant van het blad niet smeren zodat het oude blad is gemakkelijk te vervangen.
  9. Droog 's nachts om de chloroform en neutrale silicone sealant tijd om te stollen.
  10. Het mes op de meshouder installeren. Giet water in het waterbad (figuur 2C). Het wateroppervlak moet enkel raken de top van het blad (figuur 2D, pijl hoofd).

2. paraffine segmenteren

Opmerking: Puin verzamelt vaak op de randen van het boven- of ondergrens van de wax blok en het wateroppervlak. Dit puin moet regelmatig worden gewist.

  1. Conventionele paraffine afdelen10uit te voeren.
    1. Klem de paraffine-ingebedde specimen op rotary microtome en plaats het mes in een messenhouder.
    2. Zet de handknop en afdeling van het model.
    3. Het lint van paraffine gesegmenteerd overbrengen in de 38.5 ° C warm waterbad.
    4. Pick up die de secties op de Microscoop vanaf het wateroppervlak na ontvouwen glijden.
    5. De dia's in een oven bij 42 ° C's nachts droog.
  2. Verbeterde paraffine segmenteren (Figuur 3)
    1. Schakel de apparatuur in.
    2. Open de kachel met temperatuur detectieschakeloptie en de gerichte temperatuur tussen 38.0 ° C tot 40.0 ° C gedurende 1 uur op voorhand te warm het water instellen.
    3. Wijzigen van het blok van de paraffine overgenomen door paraffine insluiten; vervolgens plaatst u het blok paraffine op van de microtoom cassette klem en vergrendelen.
      Opmerking: De superieure en inferieure grenzen van de paraffine blok moeten worden gewijzigd horizontaal om te voorkomen dat het lint van de sectie van de vorming van een boog en steeds kunnen doorstromen naar het kanaal van de smalle secties.
    4. Aanpak snel het monster door snijden dikker secties.
    5. Aangepast aan de dikte van een geschikt sectie (10 µm voor volwassen muis hersenen, volwassen muis nieren en embryo muis hersenen, 4 µm voor zebrafish ogen). Zet de handknop en de secties treedt automatisch het kanaal van de secties en bad.
    6. Het gedeelte van het model in een langzame en uniforme snijden beroerte (figuur 3A).
      Opmerking: Thethickness van de eerste sectie zal worden gewijzigd nadat de handknop is gestopt voor een paar minuten. De disposable messen moeten worden vervangen wanneer de secties opeenvolgende krassen hebben.
    7. Het begeleiden van de secties in de bad kamer te zweven in een lijn (figuur 3B, 3 C).
      Opmerking: Als de kopsectie houdt zich aan de muur van de kamer, gebruik een borstel-gids om het drijvende te houden.
    8. Secties in Microscoop dia's te houden. Na de secties volledig ontvouwen in het waterbad, aparte verschillende secties met een pincet. Dan halen ze uit het waterbad naar de Microscoop dia's (figuur 3D).
      Opmerking: Secties moeten worden opgepikt vanaf de achterkant van het waterbad, zoals die in het kanaal van de secties en de voorste van het waterbad zal nog niet volledig ontvouwen.
    9. Droog de dia's door ze te plaatsen in een oven van 42 ° C's nachts. De dia's kunnen vervolgens worden opgeslagen op kamertemperatuur voor onbepaalde tijd.
  3. De Haematoxyline-eosine (HE) kleuring omwille van de evaluatie van de verbeterde methode8gebruiken

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verbeterde methode steeg het aantal intact paraffine secties. We testten deze nieuwe methode op volwassen muis hippocampal weefsel, volwassen muis nieren, hersenen embryonale muis en zebrafish ogen. Water werd toegevoegd aan de tank en de temperatuur van het water werd gehandhaafd tussen 38.0 ° C tot 40.0 ° C. Ze waren na een serieel voorbereiding van de weefselmonsters, gesegmenteerd en in vergelijking met conventionele segmenteren. De nieuwe methode voorkwam sectie nederlaag en steeg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verbeteren van paraffine sectie morfologie en oplossen van het probleem van tijdverlies tijdens het conventionele paraffine afdelen, we een verbeterde paraffine afdelen methode die snijden en ontplooiing combineert gecreëerd. Deze verbeterde methode is gebaseerd op eenvoudige apparatuur die bestaat uit een sectie kanaal, een bad met water en een kachel met een temperatuur detectieschakeloptie. De sectie lint treedt het waterbad via het kanaal van de sectie en ontvouwt zich automatisch tijdens het snijden. Deze methode ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben een patent op dit apparaat en verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 31400936, 31460260) en de Natural Science Foundation van Jiangxi provincie van China (20171BAB215020). Wij danken ook de gezamenlijk programma tussen Nanchang Universiteit en Queen Mary University of London voor de ondersteuning van dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IncubatorBoekel Scientific133000-2
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid64-17-5
Xyleen Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid1330-20-7
ParaplastLeica39601006
Verwarmde paraffine-inbeddingsmoduleLeica
Commercieel acrylbord
TrichloormethaandSinopharm Chemical Reagent Co.,Lid67-66-3
Rendier elektrisch verwarmingselement(12 V 200 W)
Temperatuurregelaar(12 V 120 W)MingsuoXH-W3002
Roterende microtoom Leica
Neutraal siliconen dichtingsmiddelKoppel de waterkanaal met de microtoom messenhouder
SpanningstransformatorDearllS-250-12
WegwerpbladAccu-Edge4689
HematoxylineBaso Diagnostics Inc.BA-4025
Eosine Baso Diagnostics Inc.BA-4025
MicroslideSail Brand7105
Neutraal balsemSinopharm Chemical Reagent Co.,Lid10004160
Dekglas Citoglas10212424C
MicroscoopCarl Zeiss
ZoutzuurXilong Chemical7647-01-0
Waterbad voor paraffine sectiesLeica
HistoCore Arcadia C - Koude PlaatLeica
paraffine afstotende spray Thermo Scientific9990420

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  2. Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
  3. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
  4. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
  5. Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
  6. Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
  7. Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
  8. Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).
  9. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).
  10. Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  11. Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
  12. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).
  13. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).
  14. Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
  15. Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Paraffin SectioningTissue SectioningCutting Floating MethodWater Bath SectioningMicrotome SectioningSection Transfer SystemThermostatic ChamberSection Quality AnalysisHematoxylin Eosin StainingWhole Specimen Sectioning

Gerelateerde artikelen