Toestellen voor het oogsten van weefsel Microcolumns

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het produceren van oogsten naalden die kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van full-dikte huidweefsel zonder donor site littekens. De naalden kunnen worden gecombineerd met een systeem voor het eenvoudig verzamelen om hoogvolume oogsten.

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft het productieproces voor een laboratoriumapparatuur, gemaakt van off-the-shelf componenten, die kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van microcolumns van full-dikte huidweefsel. De geringe omvang van de microcolumns kan donor sites snel genezen zonder donor site littekens, terwijl de oogsten volledig-dikte weefsel maakt de opneming van alle onderdelen van de cellulaire en extracellulaire van huidweefsel, met inbegrip van die verbonden met diepere dermale regio's en de adnexal huid structuren, die nog moeten met succes worden gereproduceerd met behulp van conventionele weefsel engineering technieken. De microcolumns kan worden toegepast direct in de huid wonden te vergroten genezing, of ze kunnen worden gebruikt als de bron van autologe cellen/weefsels voor andere weefsel engineering benaderingen. De oogsten naalden worden gemaakt door het wijzigen van de standaard injectienaalden, en ze kunnen worden alleen gebruikt voor het oogsten van kleine hoeveelheden weefsel of in combinatie met een systeem van de eenvoudige zuig gebaseerde collectie (ook gemaakt van algemeen beschikbare laboratorium benodigdheden) voor Hoogvolume oogsten om studies in grote diermodellen.

Inleiding

Autologe huidtransplantatie is de steunpilaar van de reparatie van de wond, maar het is beperkt door de donor site schaarste en morbiditeit, leidt tot gezamenlijke inspanningen in de afgelopen decennia aan het ontwikkelen van nieuwe therapeutische opties ter vervanging van conventionele huidtransplantatie^1,2 . Recent ontwikkelde we een alternatieve methode voor het oogsten van de huid om uit te rusten van de voordelen van full-dikte huidtransplantatie terwijl het minimaliseren van de donor site morbiditeit. Door het verzamelen van full-dikte huid in de vorm van kleine (~0.5 mm doorsnede) "microcolumns", donor sites zijn kunnen genezen van snel en zonder littekens onder normale omstandigheden (Zie de sectie discussie hieronder voor mogelijke uitzonderingen,)³. Microcolumns direct in de wond bedden te versnellen van de sluiting van de wond en het verminderen van contractie³kan worden toegepast, en herstellen van een breed scala van epidermale en dermale celtypes en functionele adnexal structuren⁴, waarvan vele ontbreken in conventionele split-dikte huidtransplantatie of huidige bioengineered huid substituten⁵. Het vermogen van microcolumns om uit te breiden genezing van hun sites van de donor te genezen zonder littekens zijn beide zelfstandig gevalideerd door andere onderzoek groepen^6,7.

Eerder hebben we een laboratorium oogsten systeem zodat de collectie van microcolumns op schaal⁸; echter, dit systeem is samengesteld uit vele aangepaste onderdelen die niet algemeen beschikbaar zijn. Hier beschrijven we in detail het proces voor produceren oogsten naalden, evenals eenvoudige inzamelingssystemen, van meestal overal verkrijgbare componenten, die kunnen worden gebruikt gemaakt om de hoogvolume oogsten. Het apparaat beschreven in dit manuscript is geschikt voor in vitro en dierlijk werk, maar niet voor gebruik bij de mens. Een klinische apparaat met FDA goedkeuring voor het toepassen van deze techniek bij de mens is commercieel beschikbaar, maar niet hier in detail zal worden besproken.

Protocol

Alle werken met betrekking tot levende dieren en dierlijke weefselsteekproeven zijn goedgekeurd door het Massachusetts algemene ziekenhuis institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC).

1. produktie van oogsten naalden

1. Installatie van de productiefase
   1. Beveiligen van een vrouwelijke luer lock connector op een post, en de post op een rotatie podium zo monteren dat de luer-lock in het midden van het werkgebied(Figuur 1 is).
   2. Plaats deze eerste fase van de rotatie verticaal en loodrecht mounten op een tweede, horizontale rotatie podium (Figuur 1B).
   3. Monteer de horizontale rotatie fase op een twee-as vertaling podium (Figuur 1B).
   4. Zet vast de combinatie op een stabiel oppervlak, zoals een optische breadboard.
   5. Afzonderlijk mount een roterende gereedschap naar het zelfde breadboard, met het gereedschap geplaatst in parallel met het breadboard en op ongeveer dezelfde hoogte als de luer lock connector het werkgebied rotatie/vertaling combinatie (Figuur 1C).
   6. Installeren van de licht-donkerscheiding tweewielers concentrisch op de rotary tool (een kleinere, lagere grit diamant cut-off wiel over een grotere, hogere grit stenen cut-off wiel) (Figuur 1D).
      Opmerking: Over een 9 mm verschil tussen de diameters van de twee wielen is over het algemeen voldoende.
   7. Positie een overhead licht bron met een verstelbare arm op de roterende gereedschap, met het licht gericht op de wielen snijden.
   8. Om visualisatie te verbeteren, plaatst u een ontleden Microscoop op de productie-installatie, zodat het oculair is gericht op de schijven snijden (Figuur 1C).
      Opmerking: U kunt ook gebruikers kunnen Vergrootglas brillen dragen.
2. Omvormen van de naald-tip
   1. Draag beschermende brillen en een chirurgisch masker te beletten fijne metalen deeltjes de ogen of luchtwegen.
   2. Kies injectienaalden van de juiste grootte, gebaseerd op experimentele vereisten meten.
   3. Markeren de beoogde lengte op elke oogst naald.
      Opmerking: Voor het oogsten van varkens huid, 8 mm naalden zijn meestal voldoende; Hoewel de lengte kan variëren op basis van experimentele behoeften (bv., dikte van de huid doelweefsel is terechtgekomen, gauge breinaalden). In het algemeen, een 19-gauge naald werkt goed voor de huid van varkens.
   4. Lager de naald loodrecht naar de rotary tool met de macht, met behulp van de rand van de schijf van de buitenste snijden met het stopzetten van de overtollige lengte van de naald, op het punt aangegeven in stap 1.2.3.
   5. De verkorte, botte naald verbinden met de vrouwelijke luer lock connector op de productiefase.
   6. De horizontale rotatie fase zo instellen dat de naald onder een 12° hoek parallel aan de schijven snijden op de rotary tool wordt (het veranderen van de hoek invloed op de kracht die nodig is voor het inbrengen van de naald hebben zal).
   7. Zet de overhead licht en haar positie aanpassen met inachtneming van de naald onder vergroting, totdat het licht uit de middellijn (in de lengte) van de naald wordt weerspiegeld.
   8. Macht op het roterende gereedschap, dan gebruik de vertaling fase om de nld richting de binnenste (ruit) snijden schijf(Figuur 2).
   9. Houden het bevorderen van de naald langzaam tegen de snijden schijf totdat de schijf snijden ongeveer de middellijn van de naald (als gevisualiseerde door het bovenlicht reflectie langs de middellijn tot).
   10. Langzaam het gesneden naald oppervlak van het innerlijke diamant wiel op de buitenste stenen wiel om de afwerking van het oppervlak van de gesneden naald met een fijnere Pools (Figuur 2B).
   11. Intrekken van de naald uit de buurt van de schijf snijden.
   12. Met behulp van de verticale rotatie-fase, de naald 180° draaien.
   13. Herhaal de stappen 1.2.9-1.2.10 om te wijzigen van de andere kant van de naald.
       Opmerking: De naald moet nu twee uiteinden van het snijden van ongeveer gelijke lengte (figuur 2C en 2D).
   14. Verwijder de naald uit de productiefase.
   15. Schoon de binnenkant vervelen met een metalen draad die iets kleiner is dan de inwendige diameter van de naald.
   16. Met behulp van een scherpe houten stok (bv., door het magnetisch uitlijnen uit het einde van de kleine houten stok op een katoen-tip applicator), Verwijder eventuele bramen die nog steeds aan de randen van de nieuwgevormde naald kunnen worden verbonden.
       Opmerking: Oogsten naalden kan oppervlaktegesteldheid en gesteriliseerd met autoclaaf indien nodig.

2. de huid weefsel oogsten

1. Gebruik de oogsten naalden voor het verzamelen van microcolumns van de huid van ex vivo weefsel of met levende dieren.
2. Ex vivo huid weefsel dat is dun (met name van monsters waar het subcutane vet ontbreekt of weg was afgesneden), houd het doelweefsel boven de opening van een tube van 50 mL centrifuge en/of stapelen van twee stukken van weefsel boven op elkaar, om te voorkomen beschadiging van de n de uiteinden van de Eedle door hen te slaan tegen harde oppervlakken.
   Opmerking: Voor in vivo oogsten van levende dieren, is het aanbevolen dat lokale lidocaïne en adrenaline worden beheerd door intradermale injectie voor analgesie en te verminderen bloeden.
3. Monteer de oogst apparatuur volgens de hoeveelheid microcolumns nodig, zoals hieronder beschreven.
4. De optie van de laag-medium volume:
   1. Kleine tot middelgrote hoeveelheden microcolumns verkrijgen, vul dan een standaard spuit (10-20 mL spuiten meestal goed werken) met normale zout en sluit deze aan op een oogst naald.
   2. Volledig steek de oogsten naald in de donorhuid en intrekken van het.
   3. Druk op de zuiger van de spuit leegmaken zoutoplossing via de oogsten naald en verdrijven de microkolom die is ingediend in de boring van de naald.
   4. Om te versnellen het proces van de oogsten, herhaal stap 2.4.2 3 tot 5 keer alvorens het verdrijven van de microcolumns in stap 2.4.3.
      Opmerking: Het is meestal handig om het verdrijven van de microcolumns in een standaard cel zeef om te verlichten van de daaropvolgende verzameling van microcolumns.
   5. Als naalden verstopt raken, verhoogt de druk op de zuiger verdrijven het vast weefsel te verwijderen van de klomp. Als gewoon toenemende druk volstaat, droeg invoegen een metalen draad door de naald tip opening om duidelijk de klomp in de naald.
   6. Houd de microcolumns ondergedompeld in zout of middellange tot gebruik ter voorkoming van uitdroging.
      Opmerking: Met een ervaren operator, de hierboven beschreven methode kan worden gebruikt om te oogsten van microcolumns met een snelheid van ongeveer 1 microkolom per seconde.
5. Hoog volume optie:
   1. Maak een eenvoudig apparaat voor zuig-bijgewoonde die kan worden geconstrueerd om verzameling van grote hoeveelheden microcolumns.
      Opmerking: Het apparaat bestaat uit een oogsten naald, 20 mL spuit met luer lock mondstuk, zuig adapter gewoonlijk gebruikt voor liposuctie (Figuur 3A), en steriele zuig busje.
   2. Verwijder de zuiger uit de 20 mL spuit.
   3. De spuit hechten aan een zuig-adapter.
   4. Voltooi de vergadering door het aanbrengen van een oogst naald op de spuit (Figuur 3B).
   5. Gebruik een stuk van steriele zuig slang de zuig adapter verbinden met een steriele zuig busje. Zorg ervoor dat de oogst apparatuur is aangesloten op de ingang van een bus waarmee vloeistof naar stroom in de bus ongehinderd (waarvoor verbinding met een busje-poort die is gemarkeerd voor de uitstroom dan instroom).
   6. Sluit het apparaat aan op een negatieve druk bron.
      Opmerking: De vereiste druk hangt naald diameter en lengte, zoals eerder beschreven⁸. Voor het apparaat beschreven in dit manuscript, is het zuigsysteem gevonden in typische operatiekamers in het algemeen voldoende.
   7. Sluit een oogsten naald op de spuit.
   8. Oogst de microcolumns door het invoegen van de oogsten naald in de huid.
      Opmerking: De microcolumns zal worden getrokken in de injectiespuit door afzuigen, vervolgens gespoeld in de zuig bus.
   9. Duik met tussenpozen de oogsten naald in een container van steriele zoutoplossing tijdens de oogst procedure voor het spoelen van het systeem.
      Opmerking: Deze zoute flush vervoer van de microkolom vergemakkelijkt en zorgt ervoor dat ze blijven gehydrateerd. U kunt ook kan een MFK luer-adapter worden aangesloten op de luer-lock van de spuit, en via een verbinding buizen, ook voor een hangende zoute infuus zak.
   10. Altijd bij de hand een metaaldraad of kleinere meten naald, die iets kleiner is dan de binnendiameter van de oogsten naald. Als de naald verstopt raakt, kan het worden ontruimd door het invoegen van de metalen draad in de naald boring.
   11. Wanneer de gewenste hoeveelheid microcolumns hebben opgebouwd in de bus, koppel het apparaat los van de zuiging, dan giet de inhoud van de zuiging bus uit door een filter voor het verzamelen van de microcolumns.
6. Toepassing na de oogst, een topische antibiotica zalf over de donor-sites.
   Opmerking: Extra dressings zijn doorgaans niet vereist voor donor sites.

Resultaten

De oogsten naalden moeten zitten kundig voor verzamelen van microcolumns van full-dikte huidweefsel met ongeveer een 80-90% slagingspercentage en elke microkolom moet bevatten epidermis en dermis wat subcutaan vet (Figuur 4). Het slagingspercentage van het oogsten is laag, of is het moeilijk om het invoegen van een naald in het weefsel, is vervolgens een nieuwe naald waarschijnlijk nodig. Als het slagingspercentage voor het oogsten consequent laag, zelfs met ...

Discussie

De hier beschreven methoden zijn bedoeld om de collectie van weefsel microcolumns in voldoende hoeveelheden voor in vivo grote dierproeven, met behulp van tools gemaakt van verkrijgbare laboratorium benodigdheden. Dit apparaat heeft eerder is gebruikt in het weefsel van de verwijderde menselijke huid^4,9 , evenals levende varkens huid³oogsten. De specifieke parameters beschreven zijn die bleken te zijn meest geschikt voor gebruik i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Diamond wheel	Dremel	545
Hypodermic needle (19G)	Fisher Scientific	14-840-98	Andere naaldmaten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van experimentele behoeften
Stone wheel	Dremel	540
Syringe (20mL met luer lock)	Fisher Scientific	22-124-967
Suction adapter	Tulip Medical	PA20BD	Optioneel, voor hoogvolumeoogst
Suction canister	Fisher Scientific	19-898-212	Optioneel, voor hoogvolumeoogst. Steriliseer voor gebruik.
Suction tubing	Medline	DYND50216H	Optioneel, voor hoogvolumeoogst