Methodenartikel

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

DOI:

10.3791/58298

⸱

23 januari 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een stapsgewijze protocol voor tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) waarmee de analyse van cel-type-specifieke genoom-brede Histon wijziging.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetische regulatie speelt een centrale rol in genexpressie. Aangezien Histon wijziging werd ontdekt in de jaren 1960, zijn de functies van de fysiologische en pathologische uitvoerig bestudeerd. Inderdaad, de komst van de volgende generatie diepe Sequencen en chromatine immunoprecipitation (ChIP) via specifieke Histon wijziging antistoffen heeft een revolutie teweeggebracht in onze visie op de Epigenetische regulatie over het genoom. Omgekeerd, weefsels bestaan meestal uit diverse celtypes, en hun complex mengsel vormt analytische uitdagingen op het onderzoek naar de epigenome in een bepaald celtype. Om aan te pakken de cel type-specifieke chromatine staat in een genoom-brede manier, ontwikkeld we onlangs tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), die is gebaseerd op de selectieve zuivering van de chromatine tagged kern Histon eiwitten uit cel typen van belang, gevolgd door ChIP-Seq. Het doel van dit protocol is de invoering van beste praktijken van tChIP-Seq. Deze techniek biedt een veelzijdig instrument voor weefsel-specifieke epigenome onderzoek in diverse histone modificaties en modelorganismen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefsels van dieren bestaan uit diverse celtypes. De genregulatie in elke cel definieert het celtype. Wijzigingen van de chromatine - DNA methylering en Histon modificatie - ten grondslag liggen aan de specificiteit van de cel-type van de genexpressie. Dus de meting van de Epigenetische regulatie in elk celtype heeft al verlangd, maar het is een technische uitdaging geweest.

Om te onderzoeken de epigenetica in een bepaald celtype, was tandem chromatine immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) onlangs ontwikkelde ()Figuur 1)1. In tChIP, epitoop-gelabeld kern Histon eiwit H2B uitgedrukt van een cel-type-specifieke promotor. Deze functie kan de isolatie van de chromatins uit de cellen van belang, hoewel het materiaal uit een mengsel van verschillende celtypes begint. Volgende ChIP-Seq — chromatine zuivering via een bewerkt-Histon mark en de volgende generatie diepe sequentiebepaling van geïsoleerd DNA — wij de epigenetische status van de gerichte celtype in een genoom-brede manier kunnen controleren.

Met behulp van deze techniek, we onlangs onderzocht neuron-specifieke trimethylation van Histon H3 eiwit op lysine 4 (H3K4me3) merken. In deze studie ontwikkelden we een knock-in muis in welke C-terminaal vlag-gelabeld H2B eiwit werd uitgedrukt op Cre-gemedieerde recombinatie (Rosa26CAG floxed-pA H2B-vlag). Door kruising met een muis bezitten van het Cre-endoplasmic reticulum (ER) gen onder de controle van de promotor van de CamK2a, geïnduceerde de lijn verkregen muis H2B-vlag in actieve neuronen op tamoxifen injectie (Camk2aH2B-vlag)1. Vanaf de hersenen van de gevestigde muis lijn, we tChIP-Seq met anti-H3K4me3 antistof uitgevoerd. Aangezien H3K4me3 merken komen vaak met promotor regio's overeen, kunnen we honderden mRNAs specifiek uitgedrukt in neuronen1ontdekken.

Hier beschrijven we een typisch tChIP-Seq methode dat betrekking heeft op de stappen van weefsel dissectie naar bibliotheek bouw ()Figuur 1). Het uiteindelijke doel van dit protocol is het delen van onze best practices voor de prestaties van tChIP-Seq en de toekomstige toepassing van deze methode op andere celtypes en histone modificaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hierin beschreven methoden zijn goedgekeurd door de deling van de veiligheid van RIKEN (H27-EP071) en uitgevoerd met de desbetreffende richtsnoeren en voorschriften.

1. de weefsels dissectie

  1. Ontleden van de weefsels van belang in kleine stukjes (ongeveer < 3 mm2) met fijne lente schaar.
    Opmerking: Grotere weefsel fragmenten duren langer om te bevriezen en kleinere stukken over grotere volumes van buffer, zowel die van invloed kunnen zijn op de resultaten zal dragen.
  2. De ontleed weefsel fragmenten toevoegen aan een schoon container gevuld met vloeibare stikstof en verzamelen ze in 2 mL buizen (1 stuk per buis) gevuld met vloeibare stikstof.
    Opmerking: Buizen met een hydrofiele oppervlak worden aanbevolen voor deze stap.
  3. Plaats de buizen bij-80 ° C voor > 5 min met de dop open voor het verdampen van de resterende vloeibare stikstof.
    Opmerking: Na het sluiten van het GLB, weefsel fragmenten kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C gedurende één maand vóór gebruik.

2. cel fixatie

Opmerking: Hebben We een handige cryogene grinder gebruikt voor deze stap. Een alternatief apparaat kan worden gebruikt.

  1. Plaats de 2 mL-eiwit lage bindende buizen met de weefselsteekproeven op een rek van metalen ijs gekoeld in vloeibare stikstof.
  2. Breng een metalen kogel in een 1,5 mL-buis en chill met vloeibare stikstof. Plaats het op het ijs van de metalen rek.
  3. Open de tube-2 mL en plaats van de prechilled van de metalen kogel in de buis. Sluiten van het GLB, zet de 2 mL-buizen in de houder van de buis van een handige cryogene grinder en onmiddellijk Dompel de houder van de geassembleerde buis in vloeibare stikstof voor 1 min.
  4. De houder van de bevroren buis invoegen in de buitenste cassette van de handige cryogene grinder en schud krachtig 60 keer voor 30 s.
  5. Demonteren van de houder van de buis, verwijder de metalen kogel en plaats de 2 mL-buis op een monster koeler prechilled bij-20 ° C.
  6. Leg het monster koeler bij-20 ° C gedurende 15 minuten ter voorkoming van bevriezing van de fixeerspray in de volgende stap.
  7. Brengen van het monster koeler aan de Bank, open het deksel van de buis en onmiddellijk druppelen 900 µL van 1% formaldehyde erin. Na meerdere malen pipetteren, spoel de suspensie in nieuwe 2 mL-buis met 900 µL van 1% formaldehyde en correctie voor 10 min met zachte rotatie in een incubator vastgesteld op 23 ° C.
    Let op: Formaldehyde is giftig en schadelijk.
  8. Om te stoppen met de reactie van fixatie, voeg 100 µL van 2,5 M glycine aan elke buis en Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  9. Voeg 1 mL ijskoud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), centrifuge voor 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap twee keer (3 wasbeurten in totaal).
    Opmerking: Vaste monsters kunnen worden flash-bevroren door vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C.
  10. Voeg 500 µL van Lysis Buffer 1 (50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) (pH 8,0), 10% w/v glycerol, 0,5% w/v NP-40, 0,25% w/v Triton X-100 en 0.1 x proteaseinhibitor cocktail) naar de pellet, Pipetteer meerdere malen, en draaien voor 10 min bij 4 ° C.
    Opmerking: Lysis-buffermengsel 1 moet worden gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C vóór gebruik.
  11. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
  12. Voeg 1 mL Lysis Buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA, en 0.1 x proteaseinhibitor cocktail) naar de pellet, vortex, en draaien voor 10 min bij 4 ° C.
    Opmerking: Lysis-buffermengsel 2 moet worden gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C vóór gebruik.
  13. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
  14. 800 µL van radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer met 1 x proteaseinhibitor cocktail toevoegen aan de pellet en resuspendeer de pellet door pipetteren.
  15. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
  16. Voeg 500 µL van RIPA buffer met 1 x proteaseinhibitor cocktail.
  17. Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 x g bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
  18. Voeg vervolgens 1 mL van RIPA buffer met 1 x proteaseinhibitor cocktail. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.

3. de chromatine schuintrekken

  1. Breng de lysate tot een koker ultrasoonapparaat en plaats vervolgens de buis op een ultrasonicator.
  2. De chromatine afschuiving met de volgende instellingen: temperatuur: 4 ° C; incident piekvermogen: 175 W; plicht factor: 10%; cycli/burst: 200; en tijd: 2.400 s.
  3. Het monster overbrengen in een 1,5 mL-eiwit lage bindende buis en Centrifugeer gedurende 5 min bij 20.000 x g bij 4 ° C.
  4. De bovendrijvende substantie in een nieuwe eiwit lage bindende buis verzamelen.
    Opmerking: Het monster kan worden flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C.

4. kwaliteitscontrole van DNA (Reverse Crosslinking)

  1. Mix 20 µL van de lysate en 180 µL van ChIP elutie Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) en 1% w/v natrium dodecyl sulfaat (SDS)) in een buis van polymerase kettingreactie (PCR). Incubeer het monster bij 65 ° C in een thermische cycler gedurende 6 uur met de thermische cycler deksel open. Houd het deksel van de thermische cycler open om te voorkomen dat overmatig denaturatie.
    Opmerking: De ChIP elutie Buffer moet worden gefilterd en opgeslagen bij kamertemperatuur vóór gebruik. Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 's nachts.
  2. Voeg 1 µL van 10 mg/mL RNase A, vortex, en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  3. Voeg 6.5 µL van 15 mg/mL proteïnase K, vortex, en Incubeer bij 55 ° C gedurende 60 minuten.
  4. Overdracht van de reactie op een lage DNA-bindende buis, Voeg 4 µL van 5 mg/mL glycogeen, en vortex. Dan, voeg 200 µL van fenol/chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1) en Centrifugeer gedurende 5 min bij 18.000 x g bij kamertemperatuur.
  5. Het supernatant overbrengen in een nieuwe DNA lage bindende buis. Voeg 200 µL van Tris-EDTA-NaCl buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8.0) en 200 mM NaCl) voor de resterende fenol/chloroform/Isoamylalcohol oplossing en Centrifugeer gedurende 5 min bij 18.000 x g bij kamertemperatuur. De bovendrijvende vloeistof verzamelen en meng met het eerste supernatant.
  6. Voeg 900 µL van ijskoude ethanol en incubeer gedurende 1 uur bij-20 ° C.
    Opmerking: Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 4 - 6 h.
  7. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 18.000 x g bij 4 ° C.
  8. Verwijder het supernatant. Voeg 1 mL ijskoud 75% ethanol tot de pellet en Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 18.000 x g bij 4 ° C. Herhaal deze stap (twee wasbeurten in totaal).
  9. Verwijder het supernatant grondig en drogen voor 1 minuut bij kamertemperatuur.
  10. Voeg 50 µL van Tris-EDTA (TE) buffer en het DNA los door broeden bij kamertemperatuur gedurende 30 min. of bij 4 ° C's nachts. Vermijd vortexing of pipetteren. Houd dit DNA als 'input' en gebruiken voor bibliotheek voorbereiding indien nodig.
  11. Meten van de concentratie van DNA met een Fluorimeter volgens de instructie van de fabrikant (Zie tabel van materialen) en controleer de grootteverdeling met een microfluidic elektroforese machine (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2a). gebruik 10 ng of minder DNA voor deze test.
    Opmerking: Fragmenten van 100 tot 500 basenparen (bp) moeten make-up 50% of meer van het DNA.

5. affiniteit zuivering door Anti-Flag antilichaam

Opmerking: Voor neuron tChIP-Seq, hersenen weefsels van 8 muizen worden doorgaans gebruikt voor een steekproef van tChIP-Seq te bereiden 2 ng van gezuiverde DNA tandem immuun-gezuiverd door (zie stap 7.1). In onze handen, 0.1 ng van DNA nog steeds geboden kwalitatief hoogwaardige DNA bibliotheken voor ChIP-Seq (Kadota, onuitgegeven). Dus, in theorie, een enkele muis kan het volstaan voor het uitvoeren van neuron tChIP-Seq. Het normbedrag moet worden geoptimaliseerd voor het type van het weefsels en cellen van belang. Voor de negatieve controle van de imumuno-zuivering experiment, moet hersenweefsel lysate van Muizen zonder elke expressie H2B-vlag worden opgesteld en gebruikt.

  1. Pipetteer 200 µL van de magnetische kralen geconjugeerd met schapen anti-muis immunoglobuline G (IgG) in een buis van lage binding aan eiwitten.
  2. Plaats de buis op een magnetische staan en wachten op 1 min. voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant en voeg 1 mL ijskoud PBS en vortex. Herhaal deze stap (twee wasbeurten in totaal).
  3. Voeg 20 µL van 1 mg/mL Dizzee RASCAL antilichaam en roteren voor 5 uur bij 4 ° C.
    Opmerking: Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 's nachts.
  4. Wassen van de kralen die volgende stap 5.2. Plaats de kralen in een tube van 15 mL.
  5. Resuspendeer de kralen in 1110 µL van de buffer RIPA en voeg vervolgens 900 µL van 10 x blokkeren reagens, 180 µL van 50 x Denhardt de oplossing 10 µL van 100 x proteaseinhibitor cocktail en 6.8 mL van de lysate bereid in stap 3. Dit mengsel wordt gesplitst door 5 eiwit lage bindende buizen. Draaien voor 6 uur bij 4 ° C.
    Opmerking: Deze incubatietijd kan worden uitgebreid tot 's nachts.
  6. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht 1 minuut voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant, voeg 1 mL buffer RIPA en meng voorzichtig. Herhaal deze stap 5 keer (6 wasbeurten in totaal). Het zwembad van alle de kralen in een buis van de lage bindende één eiwit.
  7. Voeg 200 µL van ChIP elutie Buffer en roteer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Controleer de kwaliteit van het DNA zoals beschreven in stap 4.11 (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2B en C). Ga onmiddellijk naar de volgende stap.

6. affiniteit zuivering door het antilichaam van de Anti-H3K4me3 en omgekeerde Crosslinking

Opmerking: De volgende kraal voorbereiding die stappen (6.1-6.4) moeten worden uitgevoerd vóór stap 5.7.

  1. Pipetteer 40 µL van magnetische kralen geconjugeerd met schapen-antimuis IgG in een lage binding van 2 mL-eiwitten-buis.
  2. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht 1 minuut voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant, voeg 1 mL ijskoud PBS en meng voorzichtig. Herhaal deze stap (twee wasbeurten in totaal).
  3. Voeg 4 µL van 1 mg/mL anti-H3K4me3 antilichaam en roteer gedurende 6 uur bij 4 ° C.
  4. Wassen van de kralen die volgende stap 6.2. Plaats de kralen in een lage binding van 2 mL-eiwitten-buis.
  5. Resuspendeer de kralen in 1558 µL van de buffer RIPA en voeg vervolgens 200 µL van 10 x blokkeren reagens, 40 µL van 50 x de Denhardt oplossing, 2 µL van 100 x proteaseinhibitor cocktail en 200 µL van het eluaat bereid in stap 5.7. 'S nachts draaien bij 4 ° C.
    Opmerking: De SDS in de buffer van de elutie ChIP was meer dan 10 keer in deze incubatie verdund.
  6. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht 1 minuut voor het supernatant te duidelijk geworden. Verwijder het supernatant, voeg 1 mL buffer RIPA en meng voorzichtig. Herhaal deze stap 4 keer (5 wasbeurten in totaal). Na de laatste wash, de kralen overboeken naar een DNA lage bindende buis, en verwijder het supernatant.
  7. Voeg 200 µL van ChIP elutie Buffer en roteer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Het eluaat overbrengen in een nieuwe laag bindingTube van DNA.
    Opmerking: Het eluaat kan worden achtergelaten bij-80 ° C.
  8. Volg stap 4 voor de decrosslinking van DNA. Resuspendeer de gezuiverde DNA in 20 µL van TE buffer.
  9. Controleer de kwaliteit van het DNA zoals beschreven in stap 4.11 (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2D). (optioneel) Verrijking analyses door kwantitatieve PCR uit te voeren zoals eerder beschreven2. Tienvoudige of grotere verrijking moet worden nageleefd.

7. bibliotheek bouw

  1. Bereken het percentage van DNA in de regio van de 100-500-bp met behulp van de functie analyse uitstrijkje van de software voor de machine van de Elektroforese van het microfluidic voor elke input en ChIP DNA-monster. Het monstervolume vereist voor het verkrijgen van 2 schatten ng van 100 tot 500 bp DNA. Gebruik 20 ng DNA in het bereik van 100-500-bp als de "input" monster.
  2. Pipetteer DNA-monsters in 8-strip PCR buizen en H2O om het totale volume aan 10 µL. (optioneel) als de hoeveelheid DNA groter is dan 10 µL, proportioneel schaal-up toe te voegen de volgende reactie van de einde-reparatie en de selectie van de grootte.
  3. Bereiden van eind-reparatie master mix (Zie Tabel van materialen). 4 µL van eind-reparatie master mix toevoegen aan het DNA en incubeer gedurende 30 minuten bij 20 ° C.
  4. Voeg 36 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 en 0,6 x volume (30 µL) van de vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) magnetische kralen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
  6. Het supernatant overbrengen naar een nieuwe buis, toevoegen van 1.2 x hoeveelheid (60 µL) SPRI magnetische kralen, en 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  7. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
  8. Wassen van de kralen tweemaal met 200 µL van 80% EtOH, de buis houdt nog steeds aan de magneet.
  9. Kort centrifugeren de buis voor het verzamelen van de resterende EtOH onderaan en plaats deze terug op de magneet. De residuele EtOH grondig verwijderen.
  10. Laat het deksel van de buis open voor 1-2 min om de EtOH te verdampen.
  11. Sluit het deksel en de buis op ijs te houden.
    Opmerking: Nu u hebt verkregen DNA grootte-geselecteerd van 100 tot 500 bp op de parels. Verdere details over de selectie van de dubbele grootte kunnen worden gevonden op de website van de fabrikant (www.beckman.com).
  12. Voorbereiding A-tailing master mix (Zie Tabel van materialen).
  13. Resuspendeer de kralen (uit stap 7.10) met 10 µL van A-tailing master mix en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 ° C.
  14. Toevoegen van 1,8 x volume (18 µL) van polyethyleenglycol (PEG) / NaCl-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Volg stappen 7.7-7.11 voor het zuiveren van het DNA.
  16. Bereiden van afbinding buffer mix (Zie Tabel van materialen).
  17. Pipetteer 8 µL van afbinding buffer mix op de kralen (uit stap 7.14), voeg 1 µL van 1 µM adapter en resuspendeer de kralen. Gebruik 1 µL van 5 µM adapter voor de input steekproef. Overweeg het gebruik van verschillende adapters voor elk monster voor multiplexing.
  18. Voeg 1 µL van DNA Ligase en incubeer gedurende 15 minuten bij 20 ° C.
  19. 1.0 x-volume (10 µL) van PEG/NaCl-oplossing toevoegen, resuspendeer de kralen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  20. Volg stappen 7.7-7.10 voor het zuiveren van het DNA.
  21. Pipetteer 25 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in de buis en resuspendeer de kralen.
  22. Voeg 1.0 x volume (25 µL) PEG/NaCl-oplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  23. Volg stappen 7.7-7.10 voor het zuiveren van het DNA.
  24. Pipetteer 11 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in de buis en resuspendeer de kralen.
  25. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
  26. De bovendrijvende substantie in een nieuwe 8-strip PCR buis verzamelen.
  27. Bereiden van real-time PCR master mix (Zie materialen voor details).
  28. Pipetteer 8,5 µL voor real-time PCR master mix in een 384-well kwantitatieve PCR (qPCR)-plaat en voeg 1,5 µL van de adapter afgebonden DNA (uit stap 7,26).
  29. Pipetteer 10 µL van elke TL standaard in lege wells.
  30. Uitvoeren van PCR in real time met het volgende programma: (98 ° C voor 45 s) x 1 cyclus, (98 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s) x 20 cycli, en (72 ° C gedurende 60 s) x 1 cyclus.
  31. Bepaal het aantal cycli van PCR die nodig zijn voor het bereiken van de intensiteit van de fluorescentie van de TL standaard 2.
  32. Voorbereiden van de PCR-master mix (Zie Tabel van materialen).
  33. Pipetteer 11,5 µL van het PCR master mix in de resterende adapter-afgebonden DNA (uit stap 7,26) en het uitvoeren van PCR zoals aangegeven in stap 7.30 met de cycli van PCR bepaald in stap 7.31.
  34. Voeg 1.0 x volume (20 µL) PEG/NaCl-oplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  35. Volg stappen 7.7-7.10 voor het zuiveren van het DNA.
  36. Pipetteer 20 µL van 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in de buis en resuspendeer de kralen.
  37. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht totdat het supernatans duidelijk wordt.
  38. De bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-DNA lage bindende buis verzamelen.
  39. Controleer de kwaliteit van de bibliotheek zoals beschreven in stap 4.11 (Zie representatieve gegevens weergegeven in figuur 2E en F). Gebruik 1 µL van het DNA-monster van bibliotheek. (optioneel) Verrijking analyses uit te voeren door qPCR zoals eerder beschreven 2. Tienvoudige of grotere verrijking moet worden nageleefd.

8. sequencing

  1. Volgnummer van de bibliotheken in een volgende generatie sequencer (Zie representatieve gegevens afgebeeld in Figuur 3).
    Opmerking: De volgorde diepte voldoende voor de data-analyse zal variëren afhankelijk van de grootte van het genoom van het organisme3. Voor mens en muis, is het raadzaam te verkrijgen van ten minste 20-40 miljoen single-end leest. Volgens het rendement van leest, multiplexing mogelijk kosteneffectieve.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de weefsel dissectie, fixatie, lysis van de cel, tandem zuivering van chromatine, en DNA bibliotheek voorbereiding voor de volgende generatie sequencers. Tijdens de procedures, kan een test de kwaliteit van het DNA, dat de sleutel tot succesvolle sequencing, in meerdere stappen (Figuur 2 is). Aangezien een enkele nucleosoom meestal door 147 bp DNA 4 omgeven wordt, mag sheared DNA niet korter zijn dan die grootte. On...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ons protocol is geoptimaliseerd voor de neuronen van de hersenen van de muis, waarin de uitdrukking van vlag-gelabeld H2B wordt veroorzaakt door tamoxifen injectie. Initiatiefnemers gebruikt voor H2B expressie, uitgangsmateriaal weefsel, en het bedrag van de weefsels worden centrale parameters voor succesvolle tChIP-Seq. Dus, de optimalisatie van deze factoren moet worden beschouwd als voor elk celtype van belang.

Een kritieke stap onder de procedures die in dit protocol is het DNA Schuintrekk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken alle leden van de lab Iwasaki voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (#26113005 S.N. te JP17H05679 naar S.I.); een Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (A) (JP17H04998 naar S.I.) van het ministerie van onderwijs, wetenschap, sport en cultuur van Japan (MEXT); en de exploratie-projecten "Cellulaire evolutie" en alle RIKEN project "Ziekte en Epigenome" van RIKEN (aan S.N. en S.I.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Protein LoBind tube, 2 mLEppendorfNo. 0030108132Voor cellyse
Protein LoBind tube, 1.5 mLEppendorfNo. 0030108116Voor ChIP en voorbereiding van de bibliotheek
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorfNo. 0030108051Voor ChIP en voorbereiding van de bibliotheek
8-strip PCR tubeBIO-BIK3247-00Voor ChIP en voorbereiding van de bibliotheek
SK MillTOKKENSK-200Handige cryogeenmolen om celpoeder voor fixatie te maken
Metal bulletTOKKENSK-100-DLC10Accessoire van SK Mill
2 mL roestvrijstalen buisTOKKENTK-AM5-SUSEen optie voor cellyse
2 mL roestvrijstalen buishouderTOKKENSK-100-TLEen optie voor cellyse
16% formaldehyde (w/v), methanol-vrijPierce28906Om cellen te fixeren. Bereid 1% oplossing voor gebruik voor.
GlycineNacalai Tesque17109-35Bereid 2,5 M stock op
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Voor het wassen van lysaal en gezuiverde DNA
HEPESNacalai Tesque02443-05Voor Lysis buffer 1. Bereid 1 M, pH 7,5 stock op.
5 M NaCl, moleculair biologiekwaliteitNacalai Tesque06900-14Voor Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer en Tris-EDTA-NaCl Buffer
0,5 M EDTA, moleculair biologiekwaliteitWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Voor Lysis buffer 1, Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer en Tris-EDTA-NaCl Buffer
GlycerolWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Voor lysis buffer 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Voor lysis buffer 1
Triton X-100, moleculair biologiekwaliteitNacalai Tesque12967-32Voor Lysis buffer 1
TrisNacalai Tesque35406-91Voor Lysis buffer 2, ChIP Elution Buffer en Tris-EDTA-NaCl Buffer. Bereid 1 M, pH 8,0 stock op.
0,1 M EGTA pH neutraalNacalai Tesque08947-35Voor Lysis Buffer 2
Protease-remmercocktail (100x)Nacalai Tesque25955-24Om eiwitdegradatie te blokkeren
RIPA bufferThermo Fisher Scientific89900Voor cellyse en wassen
milliTUBE 1 mL AFA FiberCovaris520130Sonicatorbuis. Accessoire van de gefocuste ulrasoon
Gefocuste ulrasoonCovarisS220 of E220Om DNA te verteren in een geschikte grootte voor ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027Voor ChIP Elution Buffer
RNase ANacalai Tesque30141-14Om DNA uit het lysaal te zuiveren
Proteinase K, recombinant, PCR-kwaliteitSigma-Aldrich3115887001Om DNA uit het lysaal te zuiveren
EthanolWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Maak 70% oplossing
Monoklonaal anti-FLAG M2-antilichaam geproduceerd in muizenSigma-AldrichF1804Om chromatine dat tot expressie wordt gebracht in cellen van belang te zuiveren
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgGThermo Fisher Scientific11201DDit kan worden gebruikt voor anti-FLAG IP en anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-methyl histone H3 (K4), muis monoklonaal antilichaamWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Elk ander antilichaam dat werkt voor ChIP-analyse zal werken
10x Blocking ReagentSigma-Aldrich11096176001Voor blokkering tijdens affiniteitszuivering
Denhardt’s oplossingNacalai Tesque10727-74Voor blokkering tijdens affiniteitszuivering
Glycogen (5 mg/ml)Thermo Fisher ScientificAM9510Om DNA uit het lysaal te zuiveren
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866Voor kwantificering van geïsoleerd DNA
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851Voor kwantificering van geïsoleerd DNA
0,5 mL buisAxygen10011-830Voor kwantificering door Qubit
Fenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Om DNA uit het lysaal te zuiveren
AMPure XP-kralenBeckman CoulterA63881SPRI magnetische kralen voor bibliotheekvoorbereiding
Metalen ijsrekFunakoshiIR-1Om het cellysaal bevroren te houden
Sample CoolerNew England BiolabsT7771SHelpt cellen te fixeren met minimale schade
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAOm de kwaliteit van geïsoleerde DNA-fragmenten te controleren. Een andere fragment analyzer kan worden gebruikt.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilent TechnologiesG2946CAWordt geleverd met de Bioanalyzer
High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626Om de kwaliteit van de geïsoleerde DNA-fragmenten te controleren
KAPA LTP Library Preparation KitRoche07961898001Wordt geleverd met 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer,

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chromatine immunoprecipitatiehistonmodificatieweefseldissectiecryogeen malenformaldehydefixatiesonicatie van chromatineaffiniteitszuivering

Gerelateerde artikelen